Misurazione Traslocazione Peptide in grandi vescicole unilamellari

Biology

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Summary

Questa dettagli del protocollo un metodo per la misura quantitativa della traslocazione peptidica in grandi vescicole lipidiche unilamellari. Questo metodo fornisce anche informazioni circa la velocità di traslocazione della membrana e può essere utilizzato per identificare i peptidi che in modo efficiente e spontaneamente croce doppi strati lipidici.

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Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (59), e3571, doi:10.3791/3571 (2012).

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Abstract

C'è un interesse attivo nel peptidi che attraversano facilmente le membrane cellulari senza l'ausilio di recettori di membrana delle cellule 1. Molti di questi sono indicati come cella penetrante peptidi, che sono spesso noti per il loro potenziale come vettori di consegna della droga 1-3. Inoltre, c'è un interesse crescente in peptidi antimicrobici che operano attraverso meccanismi di membrana non-litica 4,5, in particolare quelli che attraversano le membrane batteriche senza causare la lisi cellulare e uccidere le cellule interferendo con i processi intracellulari 6,7. In realtà, gli autori hanno sempre sottolineato il rapporto tra peptidi cellula-penetrante e antimicrobico 1,8. Una solida conoscenza del processo di traslocazione della membrana e il rapporto tra struttura peptidica e la sua capacità di traslocare devono essere efficaci, i test riproducibili per traslocazione. Diversi gruppi hanno proposto metodi per misurare la traslocazione in unilamel grandeLAR vescicole lipidiche (luvs) 9-13. Luvs servire come modelli utili per le membrane delle cellule batteriche e eucariotiche e sono frequentemente utilizzati in studi peptide fluorescente 14,15. Qui, descriviamo la nostra applicazione del primo metodo sviluppato da Matsuzaki e collaboratori di prendere in considerazione peptidi antimicrobici, come magainin e buforin II 16,17. Oltre a fornire il nostro protocollo per questo metodo, abbiamo anche presentare un approccio diretto per l'analisi dei dati che quantifica la capacità traslocazione da questo test. I vantaggi di questo test traslocazione rispetto ad altri che ha il potenziale per fornire informazioni circa la velocità di traslocazione della membrana e non richiede l'aggiunta di un'etichetta fluorescente, che possono alterare le proprietà del peptide 18, di triptofano contenenti peptidi. In breve, la capacità di traslocazione in vescicole lipidiche è misurata in funzione della Foster Resonance Energy Transfer (FRET) tra i residui di triptofano nativi e dansyl fosfatidiletanolamina quando le proteine ​​sono associate con l'esterno LUV membrana (Figura 1). Cell-penetrante peptidi sono spaccati in quanto incontro tripsina disinibita incapsulato con il luvs, porta alla dissociazione dal LUV membrana e un calo del segnale FRET. Il calo FRET segnale osservato per un peptide translocating è significativamente maggiore di quello osservato per il peptide stesso quando il luvs contengono sia tripsina e inibitore della tripsina, o quando un peptide che non spontaneamente attraversare le membrane lipidiche è esposto a tripsina contenenti luvs. Questo cambiamento di fluorescenza fornisce una quantificazione diretta della traslocazione del peptide nel tempo.

Protocol

1. Preparazione di grandi vescicole lipidiche unilamellari (luvs)

  1. Preparare luvs a servire come membrana cellulare imita per il dosaggio 19.
  2. Mix fosfatidilcolina (POPC, 760,10 g / mol), fosfatidilglicerolo (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonil fosfatidiletanolammina (DNS-PAPA, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) disciolto in cloroformio in un 50 : rapporto 45:5. Come ogni test richiede la gestione separata di luvs sia sperimentale e di controllo, due fiale torta dei lipidi deve essere preparato. 0,376 mg di lipidi totali (0,188 mg POPC, POPG 0,169 mg e 0,019 mg di DNS-PAPA) è solitamente sufficiente a rendere vescicole sufficiente per una prova traslocazione singolo.
  3. Evaporare cloroformio utilizzando un flusso di gas N 2.
  4. Asciutto la torta lipidi 9-14 ore in un essiccatore a vuoto.
  5. Preparare uno stock 10 mM HEPES soluzione tampone (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). Tampone HEPES è stOR a 4 ° C.
  6. Preparare una soluzione madre di 0,4 mm suina tripsina (23,3 kg / mol) in 10 mM tampone HEPES preparato in precedenza. La tripsina è conservato a -20 ° C e, nella nostra pratica, di solito non subisce più di 2 cicli gelo-disgelo prima dell'uso.
  7. Preparare una soluzione madre di 4,0 mm Bowman-Birk inibitore della tripsina (8 kg / mol) in 10 mM di soluzione tampone HEPES e conservare a -20 ° C. Nel nostro uso, questo stock è rifornito mensilmente e di solito non subisce più di 3 cicli di gelo / disgelo prima che sia reso di nuovo.
  8. Ricostituire vescicole sperimentale multilamellari (MLV) in una soluzione 0,2 mM tripsina con l'aggiunta di un uguale volume di magazzino tripsina 0,4 mM e 10 mM tampone HEPES soluzione alla torta secca lipidica. Per un singolo campione di 0,376 mg di lipidi totali, una miscela di 150 ml di soluzione di tripsina e 150 ml di tampone HEPES è sufficiente.
  9. Controllo MLV ricostituire in una soluzione con tripsina 0,2 mm e 2,0 mm Bowman-Birk inibitore della tripsina con l'aggiunta di un uguale volume di 0.4 mM magazzino tripsina e 4,0 mM inibitore della tripsina per i dolci secchi lipidi. Per un singolo campione di 0,376 mg di lipidi totali, una miscela di 150 ml di soluzione di tripsina e 150 ml di inibitore della tripsina è sufficiente.
  10. Trasferire soluzioni MLV da fiale di vetro a 1,7 ml di tubo microcentrifuga.
  11. Oggetto MLV soluzioni a 5 cicli gelo / disgelo in azoto liquido.
  12. Preparare lipidi estrusore (Avanti Polar Lipids) inserendo due supporti filtro inumidito con tampone HEPES su ogni pezzo in teflon estrusore. Inserire una membrana nuclepore traccia incisa con 0,1 micron pori (Whatman, Regno Unito) tra i due pezzi di Teflon estrusore, e disporre i pezzi estrusore all'interno del contenitore metallico estrusore. Posizionare il distanziale ciambella sopra i due pezzi estrusore prima di stringere la parte superiore in metallo del filtro estrusore e inserirlo nella porta.
  13. Riempire il volume vuoto all'interno della estrusore con 500 microlitri di buffer 10 mM HEPES usando una siringa da 250 microlitri di vetro per evitare la perdita di campione vescicole. </ Li>
  14. Caricare ogni campione MLV nel estrusore e spingere il campione attraverso la membrana almeno 21 volte per assicurare uniformi dimensioni unilamellari vescicola. Luvs sono ottenuti dalla estrusione seguente soluzione MLV.
  15. Luvs conservare a 4 ° C ed utilizzare entro 48 ore.

2. Quantificare LUV Concentrazione

  1. LUV concentrazione è stata quantificata mediante determinazione del contenuto di fosforo totale presente nel campione 20.
  2. Preparare 8,9 NH 2 SO 4 in acqua Nanopure e conservare a temperatura ambiente.
  3. Preparare un 2,5% w / v di ammonio molibdato VI (588,04 g / mol), soluzione in acqua Nanopure. Preparare al 10% w / v acido ascorbico (176,1 g / mol) la soluzione in acqua Nanopure. Proteggere la soluzione di acido ascorbico da esposizione alla luce coprendo il tubo con un foglio. Conservare entrambe le soluzioni a 4 ° C per un massimo di 2 mesi.
  4. Preparare 0,65 mM fosfato soluzione tampone (sodio fosfato monobasico anidro, 120 g / mol).
  5. Preparare sei normale tubes. Gli standard dovrebbero contenere 0,0 microlitri, 50 microlitri (0,0325 μmoles), 100 l (0,065 μmoles), 175 microlitri (0,114 μmoles), 250 microlitri (0,163 μmoles), o 350 microlitri (0,228 μmoles) di soluzione di fosforo.
  6. Preparare LUV provette in triplice copia. Ogni tubo campione dovrebbe contenere circa 0,1 μmoles di luvs. Sperimentale e di controllo LUV concentrazioni devono essere misurate separatamente.
  7. Per correggere eventuali sali di fosforo asciugato in Bowman-Birk in polvere inibitore, un controllo LUV vuoto deve essere preparato. Il bianco deve contenere lo stesso volume del 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk soluzione inibitore come è stata posta nel controllo LUV provetta.
  8. Mettere 450 ml di 8,9 NH 2 SO 4 in ciascuno dei campioni, standard, e tubi vuoti.
  9. Campioni di calore, gli standard e gli spazi per 25 minuti a 175-210 ° C in un forno.
  10. Rimuovere tutti i tubi e lasciare raffreddare. Aggiungere 150 ml di 30% di H 2 O 2 a ciascuno dei tubes.
  11. Campioni di calore, gli standard e gli spazi per 30 minuti a 175-210 ° C.
  12. Rimuovere i campioni, gli standard e gli spazi di calore. Se una delle soluzioni non sono ancora incolore, aggiungere 50 microlitri di H 2 O 2 a tutti i tubi e il calore per altri 15 minuti a 175-210 ° C.
  13. Aggiungere 3,9 mL Nanopure H 2 O, 0,5 ml di soluzione di ammonio molibdato e 0,5 mL di soluzione di acido ascorbico ad ogni provetta.
  14. Tutti i tubi di calore per 5-7 minuti in un bagno di acqua bollente.
  15. Misurare l'assorbanza di ogni standard e campione a 820 nm utilizzando un Agilent 8453 spettrofotometro UV-Visibile. La provetta contenente 0,0 mmol fosforo dovrebbe essere usato come la protezione da tutti gli standard e sperimentali LUV campioni. Il tubo che contiene il 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk soluzione inibitori dovrebbero essere usati come bianco per il controllo LUV campione.
  16. Un lineare contenuto assorbanza vs fosforo curva standard può essere prodotto ed utilizzato per calcolare il totale phosphOrus LUV contenuto e la concentrazione dei campioni.

3. Preparazione Soluzioni Peptide

  1. Sciogliere peptide in Nanopure H 2 O. Peptidi utilizzati in questo test come descritto deve contenere un residuo di triptofano.
  2. Misurare l'assorbanza della soluzione di peptidi a 282 nm in triplice copia. Calcolare la concentrazione del peptide utilizzando il coefficiente di estinzione molare per triptofano di 5700 M -1 cm -1.
  3. Diluire in acqua peptide Nanopure ad una concentrazione finale di 30 micron. Conservare a -20 ° C

4. Traslocazione Quantificazione

  1. Preparazione di campioni sperimentali e di controllo in tubi da microcentrifuga 1,7 ml. Aggiungi luvs sufficiente per ogni soluzione per una concentrazione finale di 250 micron. Aggiungi sufficiente Bowman-Birk soluzione inibitore in modo che inibitore è una concentrazione finale 10 volte superiore alla concentrazione tripsina. Aggiungi abbastanza 10 mM tampone HEPES per portare il volume finale di soluzione a 450 microlitri.
  2. <li> si pongono 50 microlitri soluzione peptide in un fluorimetro Starna micro cella di quarzo. Il rapporto tra luvs e peptide è sufficientemente alta da assicurare che praticamente tutti i peptidi intatti sono in stretta vicinanza ad un gruppo abbastanza dansyl per dare un segnale FRET, anche se nessuno ha traslocato nella vescicola. Ciò è coerente con l'analogo FRET osservato in condizioni di controllo per i peptidi che fanno e non traslocare in vescicole.
  3. Aggiungere il campione sperimentale o di controllo per la soluzione del peptide nella cuvetta. Questo dovrebbe portare la concentrazione del peptide finale a 3 micron.
  4. Iniziare un esperimento di 25 minuti fluorescenti cinetica immediatamente dopo l'aggiunta di sperimentale o di controllo LUV soluzione, prendendo una lettura fluorescenza almeno una volta al secondo. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione a 280 nm, la lunghezza d'onda di emissione a 525 nm, e la temperatura a 25 ° C. Utilizzando un spettrofotometro Cary Eclipse a fluorescenza, abbiamo impostato la sensibilità PMT ad alta.

5. Generazione di un rapporto quantitativo Traslocazione

  1. Definire fluorescenza iniziale (F o) come la lettura a fluorescenza, dopo quindici secondi di raccolta dei dati. Nella nostra configurazione dello strumento, abbiamo trovato che i primi quindici secondi di fluorescenza dati raccolti sono inaffidabili a causa della miscelazione, la chiusura della camera campione, e le altre perturbazioni al sistema dopo l'aggiunta del campione. Dividere ogni lettura successiva o F per ottenere la fluorescenza relativa (F / F 0) in ogni punto.
  2. Media tutte le letture relative a fluorescenza da l'ultimo minuto della sperimentazione per ottenere un finale fluorescenza relativa media [F / Fo] avg .
  3. Dividere il [F / Fo] avg per i campioni di controllo da parte della [F / Fo] avg per i campioni sperimentali per ottenere un corretto valore finale fluorescenza.
le "> 6. Risultati Rappresentante

La Figura 2 mostra i risultati di questo test un peptide rappresentante che ha mostrato la traslocazione robusto. Il segnale in questo esperimento (traccia nera) mostra un netto calo della FRET segnale nel tempo. Tuttavia, è importante controllare per la potenziale perdita di segnale FRET a causa dell'inibizione tripsina incomplete o altri fattori non correlati alla capacità di traslocazione. A tal fine, abbiamo sempre anche misurare il segnale FRET tra peptide e luvs contenenti sia tripsina e Bowman-Birk inibitore della tripsina (grigio traccia, Figura 2). Nelle nostre mani, è stato importante effettuare questo controllo per ogni peptide ogni volta che viene eseguito un esperimento. Questo ci permette di correggere in modo chiaro per eventuali variazioni del segnale a causa di eventuali differenze tra le preparazioni delle vescicole lipidiche o rumore dello strumento, che può essere significativo per i segnali relativamente deboli fluorescenti tipicamente osservati a queste concentrazioni.

L'importanza del controllo esperiment utilizzando luvs contenenti inibitori della tripsina è evidenziata dai dati mostrati in Figura 3. In questo caso, il segnale è diminuito peptide una quantità simile a quella in figura 2 nel campione sperimentale (traccia nera). Tuttavia, il campione di controllo mostra un calo più rapido di questo peptide, quindi la sua traslocazione netto è più basso.

Sezione 5 del nostro protocollo descrive un metodo semplice per quantificare traslocazione da questo esperimento. Rapporti di traslocazione superiori sono indicativi di peptidi che traslocare in modo efficace; il rapporto di traslocazione per il peptide cellula penetrando mostrato nella Figura 2 è 1,16, mentre debolmente peptidi translocating hanno rapporti traslocazione più vicino a 1. Nella nostra esperienza, l'errore standard di tre esperimenti indipendenti eseguiti con preparazioni diverse vescicola è nel range da 0,01 a 0,06.

Figura 1
Figura 1. Schematica di translocatsaggio di ioni. Sperimentale LUV campioni (A) sono drogato con fluorescenti PAPA dansyl (barre nere) e contengono incapsulato tripsina (forbici). Inibitore della tripsina (cerchio rosso) è utilizzato per inibire la tripsina al di fuori del luvs. Il luvs sono esposti al peptide (viola). Peptide di associazione con i rendimenti LUV membrane uno FRET segnale (verde), che diminuisce man mano che i peptidi translocting incontro disinibita tripsina interno. Sia tripsina e inibitore della tripsina sono incapsulati in controllo LUV campioni (B) per misurare la diminuzione del segnale FRET estranei a traslocazione.

Figura 2
Figura 2. Dati rappresentativi per una cella-peptide penetrante. Un rappresentante translocating pepide antimicrobica mostra un calo significativo FRET segnale rispetto al suo controllo.

Figura 3
Figura3. Dati rappresentativi sottolineando l'importanza del controllo. Incompleta inibizione della digestione trittico di un non-peptidico translocating porta ad un calo di FRET segnale nel tempo in entrambe le sperimentali e di controllo LUV soluzioni. Perché la differenza tra il controllo e le tracce sperimentale è relativamente piccola, questo mutante è caratterizzato come un peptide debolmente translocating.

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Discussion

Il protocollo presentato qui può essere utilizzato per valutare la variazione relativa della concentrazione di peptidi all'interno e all'esterno delle vescicole lipidiche. Questi cambiamenti sono legati alla capacità di traslocazione. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare cellule penetrante peptidi con potenziale come vettori di consegna della droga. Come interesse nella cella-penetrante peptidi cresce, sarà interessante vedere come i metodi che misurano direttamente l'evento traslocazione sono sviluppati e utilizzati in modo quantitativo.

Nel nostro laboratorio, abbiamo scoperto che la consistenza del dosaggio può essere migliorata da un attento monitoraggio alcuni aspetti particolari di questo esperimento. In primo luogo, la quantificazione delle vescicole sia sperimentali e di controllo migliora la consistenza dei risultati ottenuti con questo protocollo. Questo test dipende anche dalla capacità di rilevare un preciso fluorescenza iniziale prima dell'inizio della traslocazione delle proteine ​​e la digestione. Pertanto, è essenziale per il fluorescentisegnale di raccolta Scence per iniziare non appena la proteina o peptide è esposto al LUV soluzione. Questo test è anche sensibile alle inibitore della tripsina particolari utilizzati, fino ad oggi, abbiamo ottenuto i risultati più coerenti con Bowman-Birk inibitore della tripsina (Sigma T-9777). È importante sottolineare che il grado di degradazione osservato in scenari di controllo sembra variare in modo significativo tra peptidi (come evidenziato nelle figure 2 e 3) e in alcuni casi tra i preparati vescicola diversi per il peptide stesso. Questo sottolinea ulteriormente la necessità di eseguire un controllo con ogni replica sperimentale. Come ulteriore controllo, si potrebbe anche misurare la FRET risposta per peptide esposto ad un campione vescicola contenente né tripsina né inibitore della tripsina. Tuttavia, questo controllo non fornisce alcuna ulteriore informazione che sia necessaria al fine di valutare i dati per la traslocazione peptidica.

Una delle preoccupazioni è quella membrana-litica peptidi potrebbe permeabilize la membrana abbastanzapermettono tripsina o inibitore della tripsina per viaggiare attraverso la membrana. I peptidi utilizzati per gli esempi in questo lavoro hanno dimostrato di provocare permeabilizzazione poco membrana. Tuttavia, molti peptidi della membrana-litiche sono anche suscettibili di questo test e traslocazione simili 9,16,21,22. Ciò è probabilmente perché il volume è molto maggiore fuori che dentro le vescicole. Pertanto, qualsiasi tripsina che fuoriesce all'esterno dei vasi può essere inibita da inibitore della tripsina in eccesso, evitando qualsiasi scissione del peptide al di fuori della vescicola. Così, un risultato positivo di questa analisi indica probabilmente un peptide che trasloca pur determinando disagi membrana relativamente minima, impedendo inibitore fuoriuscita in vescicole. Indipendentemente da ciò, una caratterizzazione completa delle proprietà peptide dovrebbe includere una valutazione di permeabilizzazione della membrana.

Questo test è suscettibile di adattamento per una più ampia varietà di situazioni sperimentali. Dato che la traslocazione viene misurato come un divertimentoione di FRET segnale tra proteine ​​e la membrana, come descritto in questo saggio è più adatta alle proteine ​​e peptidi che spontaneamente associano luvs anionici, contengono un residuo di triptofano e hanno siti tagliare tripsina vicino il residuo triptofano. La vicinanza del triptofano a un sito tagliare assicura che il frammento che contiene triptofano ha una affinità trascurabile membrana, e quindi un segnale FRET trascurabile. Tuttavia, si potrebbe anche usare peptidi contenenti moities chimicamente coniugata tirosina o altre fluorescenti con vescicole contenenti un apposito FRET accettore. Allo stesso modo, tripsina potrebbe essere sostituito con un altro proteasi che gli obiettivi di taglio siti alternativi in ​​un peptide di interesse. Tuttavia, alterando l'enzima ed inibitore può richiedere ulteriore ottimizzazione in quanto alcuni trypsins disponibili in commercio e gli inibitori della tripsina ha portato alla aggregazione o instabilità dei campioni di vescicole. Alterando la composizione lipidica della luvs, questo dosaggio può essere utilizzato anche per determinare il ruoloche carica lipidi o gioca nel determinare la struttura traslocazione peptidica. Inoltre, questo test potrebbe anche essere facilmente adattato per fornire high-throughput misurazioni di traslocazione in un approccio simile a quello di Wimley e collaboratori 9.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Eleonora Fleming e Jessica Chen per le discussioni utili. Il finanziamento è stato fornito da Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID-NIH) e un Premio R15AI079685 Research Corporation Cottrell Award Science College. Sostegno degli studenti sono state fornite dal Howard Hughes Medical Institute e del fondo Staley.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16:0-18:1 PG Avanti Polar Lipid, Inc 840457C
1:18 Dansyl PE Avanti Polar Lipid, Inc 810330C
16:0-18:1 PC Avanti Polar Lipid, Inc 850457C
Porcine trypsin Sigma-Aldrich T-0303
Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor Sigma-Aldrich T-9777
Mini-extruder Avanti Polar Lipid, Inc 610000
Ammonium molybdate (para) Alfa Aesar 10811
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A1417
Hydrogen Peroxide, 30% solution Mallinckrodt Baker Inc. 5240-05
HEPES Sigma-Aldrich H-3375
NaCl Sigma-Aldrich S-9625
EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S-0751

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References

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