Måling peptid translokation i store Unilamellar Vesikler

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokol nærmere en metode til kvantitativ måling af peptid translokation i store unilamellar lipid vesikler. Denne metode giver også oplysninger om antallet af membranen translokation og kan bruges til at identificere peptider, der effektivt og spontant på tværs lipid dobbeltlag.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles. J. Vis. Exp. (59), e3571, doi:10.3791/3571 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Der er en aktiv interesse i peptider, der let passerer cellemembraner, uden bistand fra cellens membran receptorer 1. Mange af disse er nævnt som celle-gennemtrængende peptider, der ofte er kendt for deres potentiale som drug delivery vektorer 1-3. Desuden er der stigende interesse for antimikrobielle peptider, der opererer via ikke-membran lytiske mekanismer 4,5, især dem, der krydser bakterielle membraner uden at forårsage cellelysis og dræbe celler ved at gribe ind med intracellulære processer 6,7. Faktisk har forfatterne i stigende grad påpeget sammenhængen mellem celle-gennemtrængende og antimikrobielle peptider 1,8. En fast forståelse af processen med at membranen translokation og forholdet mellem peptid struktur og dens evne til at translocate kræver effektive, reproducerbare assays til translokation. Flere grupper har foreslået metoder til at måle translokation i store unilamelLAR lipid vesikler (LUVs) 9-13. LUVs tjene som nyttige modeller for bakterier og eukaryote cellemembraner, og bruges ofte i peptid fluorescerende undersøgelser 14,15. Her beskriver vi vores anvendelse af metoden først udviklet af Matsuzaki og medarbejdere til at overveje antimikrobielle peptider, som magainin og buforin II 16,17. Ud over at give vores protokol for denne metode, vi også præsentere en enkel tilgang til data analyse, der kvantificerer translokation evne til at bruge denne analyse. Fordelene ved denne translokation analyse i forhold til andre er, at det har potentiale til at give oplysninger om antallet af membranen translokation og ikke kræver tilsætning af en fluorescerende etiket, som kan ændre peptid egenskaber 18, til tryptofan-holdige peptider. Kort fortalt, er translokation evnen til lipid vesikler målt som en funktion af Foster Resonance Energy Transfer (FRET) mellem indfødte tryptophan rester og dansyl phosphatidylethanolamin når proteiner er forbundet med den eksterne LUV membran (Figur 1). Cell-gennemtrængende peptider spaltes, som de støder på uhæmmet trypsin indkapslet med LUVs, der fører til afstandtagen fra LUV membran og et fald i FRET signal. Faldet i FRET signal er observeret for et translocating peptid er væsentligt større end den observeret for de samme peptid, når LUVs indeholder både trypsin og trypsin inhibitor, eller når et peptid, der ikke spontant krydser lipid membraner er eksponeret over for trypsin-holdige LUVs. Denne ændring i fluorescens giver en direkte kvantificering af peptid translokation over tid.

Protocol

1. Forberedelsen af ​​store Unilamellar Lipid Vesikler (LUVs)

  1. Forbered LUVs at tjene som cellemembranen efterligner for analysen 19.
  2. Bland phosphatidylcholin (POPC, 760,10 g / mol), phosphatidylglycerol (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonyl phosphatidylethanolamin (DNS-paven, 994,350 g / mol) (Avanti Polar lipider) opløst i chloroform i en 50 : 45:5 ratio. Som enhver analyse kræver særskilt forberedelse af både eksperimenterende og kontrol LUVs, bør to lipid kage hætteglas være forberedt. 0,376 mg total lipid (0,188 mg POPC, 0,169 mg POPG, og 0,019 mg DNS-paven) er normalt tilstrækkeligt til at gøre nok vesikler for en enkelt translokation retssag.
  3. Inddampes off chloroform ved hjælp af en N 2 gasstrøm.
  4. Tør lipid kagen 9-14 timer i vakuum.
  5. Forbered en bestand 10 mM HEPES bufferopløsning (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). HEPES buffer er stored ved 4 ° C.
  6. Forbered en stamopløsning på 0,4 mM svin trypsin (23,3 kg / mol) i 10 mM HEPES buffer forberedt ovenfor. Trypsin opbevares ved -20 ° C, og i vores praksis, er normalt ikke undergår mere end 2 fryse-tø før brug.
  7. Forbered en stamopløsning på 4,0 mM Bowman-Birk trypsin inhibitor (8 kg / mol) i 10 mM HEPES bufferopløsning og opbevares ved -20 ° C. I vores brug, er denne bestand genopfyldes hver måned og som regel ikke undergår mere end 3 fryse / tø, før det er lavet igen.
  8. Opløs eksperimentelle multilamellar vesikler (MLVs) i en 0,2 mm trypsin ved tilsætning af en tilsvarende mængde på 0,4 mM trypsin lager og 10 mM HEPES bufferopløsning til de tørrede lipid kage. For en enkelt prøve af 0,376 mg total lipid, er en blanding af 150 μL af trypsin løsning og 150 μL af HEPES buffer tilstrækkelig.
  9. Rekonstituer kontrol MLVs i en opløsning med 0,2 mM trypsin og 2,0 mM Bowman-Birk trypsin inhibitor ved at tilføje en tilsvarende mængde fra 0.4 mm trypsin lager og 4,0 mM trypsin inhibitor til de tørrede lipid kager. For en enkelt prøve af 0,376 mg total lipid, er en blanding af 150 μL af trypsin løsning og 150 μL af trypsin inhibitor tilstrækkelig.
  10. Overførsel MLV løsninger fra hætteglas til 1,7 ml mikrocentrifugerør.
  11. Med forbehold MLV løsninger til 5 fryse / tø cykler i flydende kvælstof.
  12. Forbered lipid ekstruder (Avanti Polar lipider) ved at placere to filter understøtter fugtet i HEPES buffer på hver Teflon ekstruder stykke. Placer en nuclepore spor ætset membran med 0,1 μm porer (Whatman, Det Forenede Kongerige) i mellem de to Teflon ekstruder stykker, og læg den ekstruder stykker inde i metallet ekstruder dåsen. Placer donut spacer over de to ekstruder stykker før stramning af metal toppen af ​​ekstruder beholder og placere den i holderen.
  13. Udfylde det tomrum volumen inden for de ekstruder med 500 μL 10 mM HEPES buffer ved hjælp af en 250 μL glassprøjte at forhindre tab af vesikel prøve. </ Li>
  14. Load hver MLV prøven i ekstruder og skub prøven gennem membranen mindst 21 gange for at sikre en ensartet unilamellar Blære størrelse. LUVs stammer fra det MLV løsning efter ekstrudering.
  15. Store LUVs ved 4 ° C og anvendes inden for 48 timer.

2. Kvantificering LUV Koncentration

  1. LUV koncentrationen blev kvantificeret ved at bestemme det samlede indhold af fosfor i prøven 20.
  2. Forbered 8,9 NH 2 SO 4 i nanopure vand og opbevares ved stuetemperatur.
  3. Forbered en 2,5% w / v ammoniummolybdat VI (588,04 g / mol) løsning i nanopure vand. Forbered en 10% w / v ascorbinsyre (176,1 g / mol) løsning i nanopure vand. Beskyt ascorbinsyreopløsning fra lyseksponering ved at dække røret med folie. Store begge løsninger ved 4 ° C i op til 2 måneder.
  4. Forbered 0,65 mM fosfatbuffer (monobasisk vandfrit natrium fosfat, 120 g / mol).
  5. Forbered seks standard tuBES. Standarder skal indeholde 0,0 μL, 50 μL (0,0325 μmoles), 100 μL (0,065 μmoles), 175 μL (0,114 μmoles), 250 μL (0,163 μmoles), eller 350 μL (0,228 μmoles) af fosfor løsning.
  6. Forbered LUV prøverør i tre eksemplarer. Hvert prøveglas skal indeholde ca. 0,1 μmoles af LUVs. Eksperimentel og kontrol LUV koncentrationer skal måles separat.
  7. For at korrigere for eventuelle tørrede fosfor salte i Bowman-Birk hæmmer pulver, en kontrol LUV tom skal udarbejdes. Den tomme skal indeholde den samme mængde på 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk hæmmer løsning, som blev placeret i kontrolgruppen LUV prøveglas.
  8. Placer 450 μL på 8,9 NH 2 SO 4 i hver af prøven, som standard, og tomme rør.
  9. Heat prøver, standarder og blanke i 25 minutter ved 175-210 ° C i en ovn.
  10. Fjern alle rør, og lad dem køle af. Tilsæt 150 μL af 30% H 2 O 2 til hver af de tuBES.
  11. Heat prøver, standarder og blanke i 30 minutter ved 175-210 ° C.
  12. Fjern prøver, standarder og blanke fra varme. Hvis nogen af de løsninger, endnu ikke er farveløs, tilsættes 50 μL H 2 O 2 til alle rørene og varme i yderligere 15 minutter ved 175-210 ° C.
  13. Tilsæt 3,9 mL nanopure H 2 O, 0,5 mL ammoniummolybdat løsning og 0,5 mL ascorbinsyreopløsning til hvert rør.
  14. Varm alle rør i 5-7 minutter i et bad med kogende vand.
  15. Mål absorbansen af ​​hver enkelt standard og prøve på 820 nm ved hjælp af en Agilent 8453 UV-Visible spektrofotometer. Røret indeholder 0,0 mmol fosfor skal anvendes som blank for alle standarder og eksperimenterende LUV prøver. Røret indeholder 0,2 mm trypsin/2.0 mM Bowman-Birk hæmmer opløsning bør anvendes som blank for kontrol LUV prøven.
  16. En lineær absorbans vs fosforindhold standardkurve kan produceres og anvendes til at beregne den samlede phosphOrus indhold og LUV koncentration af prøverne.

3. Forberedelse peptid Solutions

  1. Opløs peptid i nanopure H 2 O. Peptider anvendes i denne analyse, som beskrevet skal indeholde en tryptofan rester.
  2. Mål absorbansen af ​​peptid opløsning på 282 nm i tre eksemplarer. Beregn peptid koncentrationen ved hjælp af den molære ekstinktionskoefficient for tryptophan på 5700 M -1 cm -1.
  3. Fortynd peptid i nanopure vand til en endelig koncentration på 30 μM. Opbevares ved -20 ° C

4. Translokation Kvantificering

  1. Forbered eksperimenterende og kontrolprøver i 1,7 mL mikrocentrifugerør. Tilsæt så meget LUVs til hver løsning til en endelig koncentration på 250 μM. Tilsæt så meget Bowman-Birk hæmmer løsning, så hæmmer er en slutkoncentration 10X større end trypsin koncentration. Tilsæt så meget 10 mM HEPES buffer til at bringe den endelige løsning volumen til 450 μL.
  2. <li> Placer 50 μL peptid-løsning til en Starna mikro kvarts fluorometer celle. Forholdet mellem LUVs og peptid er høj nok til at sikre, at stort set alle intakte peptider er i tæt nok nærhed til en dansyl gruppe for at give et FRET signal, selvom ingen har omplantes i vesikel. Dette er i overensstemmelse med lignende FRET observeret i kontrol betingelserne for peptider, der gør og ikke translocate ind i vesikler.
  3. Tilsæt eksperimentelle eller kontrolprøve til peptid løsning i kuvetten. Dette skulle give den endelige peptid koncentrationen til 3 m.
  4. Begynd en 25 minutters fluorescerende kinetik eksperiment umiddelbart efter tilsætning af forsøgs-eller kontrol LUV løsning, der tager en fluorescens læser mindst en gang i sekundet. Indstil excitation bølgelængde på 280 nm, emission bølgelængde på 525 nm, og temperaturen til 25 ° C. Ved hjælp af en Cary Eclipse Fluorescence Spectrophotometer, vi sætte PMT følsomhed over for høje.

5. Generering af en Kvantitative translokation Ratio

  1. Definer indledende fluorescens (F o) som fluorescens læsning efter femten sekunders dataindsamling. I vores instrument setup, har vi fundet, at de første femten sekunder af fluorescens indsamlede data er upålidelige på grund af opblanding, lukke prøven kammeret, og andre forstyrrelser til systemet på prøve tilføjelse. Opdel hver efterfølgende læsning af F o at opnå relativ fluorescens (F / F 0) ved hvert tidspunkt.
  2. Gennemsnit alle relative fluorescens målinger fra det sidste minut af forsøget på at opnå en endelig gennemsnitlig relativ fluorescens [F / Fo] gns. .
  3. Opdel [F / Fo] gns. for kontrolprøver af [F / Fo] gns. til forsøg prøver at få en korrigeret endelig fluorescens værdi.
le "> 6. repræsentative resultater

Figur 2 viser resultaterne af denne analyse for et repræsentativt peptid, der viste robust translokation. Signalet i dette eksperiment (sort trace) viser et markant fald i FRET signal over tid. Men det er vigtigt at kontrollere for det potentielle tab af FRET signal på grund af ufuldstændig trypsin hæmning eller andre faktorer ikke er relateret til translokation evne. Til dette formål, altid vi også måle FRET signalet mellem peptid og LUVs indeholder både trypsin og Bowman-Birk trypsin inhibitor (grå spor, figur 2). I vores hænder, har det været vigtigt at udføre denne kontrol for hver peptid, hver gang et eksperiment køres. Dette giver os mulighed for klart at korrigere for eventuelle ændringer i signalet på grund af eventuelle forskelle mellem lipid vesikel præparater eller instrument støj, som kan have betydning for den relativt svage fluorescerende signaler typisk observeret ved disse koncentrationer.

Betydningen af ​​kontrol erfariment hjælp LUVs indeholder trypsin inhibitor er fremhævet af data vist i figur 3. I dette tilfælde faldt peptid signalet et tilsvarende beløb som i figur 2 i den eksperimentelle prøve (sort trace). Men kontrolprøven viser et hurtigere fald i dette peptid, så dens netto translokationen er lavere.

§ 5 i vores protokol beskriver en enkel metode til kvantificering translokation fra dette eksperiment. Højere translokationen nøgletal er tegn på peptider, translocate effektivt; den translokation ratio for cellen gennemtrængende peptid vist i figur 2 er 1,16, mens svagt translocating peptider har translokation nøgletal tættere på 1. Det er vores erfaring, er den standard error for tre uafhængige forsøg udført med forskellige Blære præparater i intervallet fra 0,01 til 0,06.

Figur 1
Figur 1. Skematisk af translocation-analysen. Eksperimentelle LUV prøver (A) er doteret med fluorescerende dansyl paven (sorte bjælker) og indeholder indkapslet trypsin (saks). Trypsin inhibitor (rød cirkel) bruges til at hæmme trypsin udenfor LUVs. De LUVs er udsat for peptid (lilla). Peptid forbindelse med LUV membraner giver en FRET signal (grøn), der falder som translocting peptider støde uhæmmet interne trypsin. Både trypsin og trypsin inhibitor er indkapslet i kontrol LUV prøver (B) til at måle fald i FRET signal relateret til translokation.

Figur 2
Figur 2. Repræsentative data for en celle-gennemtrængende peptid. En repræsentant translocating antimikrobielle pepide viser et markant fald i FRET signal i forhold til dens kontrol.

Figur 3
Figur3. Repræsentative data fremhæver vigtigheden af kontrol. Ufuldstændig hæmning af tryptic fordøjelse af en ikke-translocating peptid fører til et fald i FRET signal over tid i både eksperimentel og kontrol LUV løsninger. Fordi forskellen mellem kontrol og eksperimentelle spor er relativt lille, er denne mutant karakteriseres som et svagt translocating peptid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den protokol, der præsenteres her, kan bruges til at vurdere den relative ændring i koncentrationen af ​​peptider i og uden for lipid vesikler. Disse ændringer er relateret til translokation evne. Denne protokol kan bruges til at identificere celle-gennemtrængende peptider med potentiale som drug delivery vektorer. Efterhånden som interessen i celle-gennemtrængende peptider vokser, vil det være interessant at se, hvordan metoder, der direkte måler translokationen begivenheden er udviklet og bruges i en kvantitativ måde.

I vores laboratorium har vi fundet, at der er sammenhæng i analysen kan forbedres ved omhyggelig overvågning af et par særlige aspekter af forsøget. Første, kvantificering af både eksperimenterende og kontrol vesikler forbedrer konsekvensen af ​​de opnåede resultater ved hjælp af denne protokol. Denne analyse afhænger også af evnen til at opdage en nøjagtig indledende fluorescens forud for påbegyndelsen af ​​protein translokation og fordøjelse. Derfor er det afgørende for fluorescence signal samling til at begynde, så snart protein eller peptid er udsat for LUV løsning. Denne analyse er også følsomme over for den særlige trypsin bruges inhibitor, til dato, har vi fået den mest konsistente resultater med Bowman-Birk trypsin inhibitor (Sigma T-9777). Væsentligt er det, graden af ​​nedbrydning observeret i kontrol scenarier synes at variere betydeligt mellem peptider (som fremhævet i figur 2 og 3) og i nogle tilfælde mellem forskellige Blære forberedelserne til samme peptid. Dette understreger yderligere behovet for at køre en kontrol med hver enkelt eksperimentelle replikation. Som en ekstra kontrol, kunne man også måle FRET respons for peptid udsat for en vesikel prøve, der hverken indeholder trypsin eller trypsin inhibitor. Men denne kontrol ikke give nogen yderligere oplysninger, der er nødvendige for at evaluere data for peptid translokation.

En bekymring er, at membran-lytiske peptider kunne permeabilize membranen nok til attillader trypsin eller trypsin inhibitor at rejse på tværs af membranen. De peptider anvendes til eksempler i dette papir har vist sig at forårsage lidt membran permeabilization. Ikke desto mindre er mange membran-lytiske peptider også gøres til genstand for denne og lignende translokation assays 9,16,21,22. Dette er sandsynligvis, fordi lydstyrken er meget større udenfor end inde i vesikler. Således skal alle trypsin, der siver ud af vesikel kan hæmmes af overskydende trypsin inhibitor, der forhindrer enhver spaltning af peptid uden for Blære. Således er et positivt resultat fra denne analyse vil sandsynligvis betegner et peptid, der translocates mens forårsager relativt minimal membran forstyrrelser, forhindrer-hæmmer fra siver ind i vesikler. Uanset hvad, bør en grundig karakterisering af peptid egenskaber omfatter en vurdering af membran permeabilization.

Denne analyse er muligt at foretage en tilpasning til en bredere vifte af eksperimentelle omstændigheder. I betragtning af at translokation måles som en sjovIndsatsen af ​​FRET signalet mellem protein og membran, som beskrevet denne test er bedst egnede til proteiner og peptider, der spontant forbinder med anioniske LUVs, indeholder en tryptofan rester og har trypsin skåret steder nær tryptofan rester. Den nærhed af tryptofan til en nedskæring websted sikrer, at fragmentet indeholder tryptofan har en ubetydelig membran affinitet, og dermed en ubetydelig FRET signal. Dog kunne man også bruge peptider indeholder tyrosin eller andet kemisk konjugerede fluorescerende moities sammen med vesikler indeholdende en passende FRET acceptor. Tilsvarende kunne trypsin blive erstattet med en anden protease, der er målrettet alternativ skåret sites i et peptid af interesse. Kan dog ændre enzymet og hæmmer kræve yderligere optimering, da nogle kommercielt tilgængelige trypsins og trypsin inhibitorer førte til sammenlægning eller ustabilitet i Blære prøver. Ved at ændre lipid sammensætning LUVs, kan denne analyse også bruges til at fastlægge den rolleat lipid tiltale eller struktur spiller ved fastsættelsen af ​​peptid translokation. Desuden kan denne analyse også let kan tilpasses til at levere high-throughput målinger af translokation i en tilgang, der svarer til Wimley og medarbejdere 9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne takke Eleanor Fleming og Jessica Chen for nyttige diskussioner. Finansieringen blev leveret af National Institute of Allergy og smitsomme sygdomme (NIH-NIAID) Tildelingskriterier R15AI079685 og en Research Corporation Cottrell College Science Award. Ekstra elev Støtten blev givet af Howard Hughes Medical Institute og Staley fond.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
16:0-18:1 PG Avanti Polar Lipid, Inc 840457C
1:18 Dansyl PE Avanti Polar Lipid, Inc 810330C
16:0-18:1 PC Avanti Polar Lipid, Inc 850457C
Porcine trypsin Sigma-Aldrich T-0303
Bowman-Birk trypsin/chymotrypsin inhibitor Sigma-Aldrich T-9777
Mini-extruder Avanti Polar Lipid, Inc 610000
Ammonium molybdate (para) Alfa Aesar 10811
L-ascorbic acid Sigma-Aldrich A1417
Hydrogen Peroxide, 30% solution Mallinckrodt Baker Inc. 5240-05
HEPES Sigma-Aldrich H-3375
NaCl Sigma-Aldrich S-9625
EDTA Sigma-Aldrich E5134
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S-0751

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Henriques, S. T., Melo, M. N., Castanho, M. A. Cell-penetrating peptides and antimicrobial peptides: how different are they? Biochem. J. 399, (1), 1-1 (2006).
  2. Trehin, R., Merkle, H. P. Chances and pitfalls of cell penetrating peptides for cellular drug delivery. Eur. J. Pharm. Biopharm. 58, (2), 209-209 (2004).
  3. Temsamani, J., Vidal, P. The use of cell-penetrating peptides for drug delivery. Drug Discov. Today. 9, (23), 1012-1012 (2004).
  4. Hale, J. D., Hancock, R. E. Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 5, (6), 951-951 (2007).
  5. Nicolas, P., Rosenstein, Y. Multifunctional host defense peptides. FEBS J. 276, (22), 6464-6464 (2009).
  6. Boman, H. G., Agerberth, B., Boman, A. Mechanisms of Action on Escherichia-Coli of Cecropin-P1 and Pr-39, 2 Antibacterial Peptides from Pig Intestine. Infection and Immunity. 61, (7), 2978-2978 (1993).
  7. Park, C. B., Kim, H. S., Kim, S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: Buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 244, (1), 253-253 (1998).
  8. Bobone, S. The thin line between cell-penetrating and antimicrobial peptides: the case of Pep-1 and Pep-1-K. J. Pept. Sci. 17, (5), 335-335 (2011).
  9. Marks, J. R., Placone, J., Hristova, K., Wimley, W. C. Spontaneous Membrane-Translocating Peptides by Orthogonal High-throughput Screening. J. Am. Chem. Soc.. (2011).
  10. Rosenbluh, J. Translocation of histone proteins across lipid bilayers and Mycoplasma membranes. J. Mol. Biol. 345, (2), 387-387 (2005).
  11. Bárány-Wallje, E. A critical reassessment of penetratin translocation across lipid membranes. Biophys. J. 89, (4), 2513-2513 (2005).
  12. Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Translocation of beta-galactosidase mediated by the cell-penetrating peptide pep-1 into lipid vesicles and human HeLa cells is driven by membrane electrostatic potential. Biochemistry. 44, (30), 10189-10189 (2005).
  13. Orioni, B. Membrane perturbation by the antimicrobial peptide PMAP-23: a fluorescence and molecular dynamics study. Biochim. Biophys. Acta. 1788, (7), 1523-1523 (2009).
  14. Ladokhin, A. S., Jayasinghe, S., White, S. H. How to measure and analyze tryptophan fluorescence in membranes properly, and why bother? Anal. Biochem. 285, (2), 235-235 (2000).
  15. Epand, R. M., Epand, R. F. Liposomes as models for antimicrobial peptides. Methods Enzymol. 372, 124-124 (2003).
  16. Kobayashi, S. Interactions of the novel antimicrobial peptide buforin 2 with lipid bilayers: Proline as a translocation promoting factor. Biochemistry. 39, (29), 8648-8648 (2000).
  17. Matsuzaki, K., Murase, O., Fujii, N., Miyajima, K. Translocation of a channel-forming antimicrobial peptide, magainin 2, across lipid bilayers by forming a pore. Biochemistry. 34, (19), 6521-6521 (1995).
  18. Henriques, S. T., Costa, J., Castanho, M. A. Re-evaluating the role of strongly charged sequences in amphipathic cell-penetrating peptides: a fluorescence study using Pep-1. FEBS Lett. 579, (20), 4498-4498 (2005).
  19. Torchilin, V. P., Weissig, V. Liposomes. Oxford University Press. New York. (2003).
  20. Almeida, P. F., Pokorny, A. Avanti Polar Lipids, Determination of Total Phosphorus. Biochemistry. 1686, (34), 8083-8083 (2009).
  21. Kobayashi, S. Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry. 43, (49), 15610-15610 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics