تأكيد المسار الأيضي والاكتشاف من خلال 13 C - وضع العلامات من الأحماض الأمينية Proteinogenic

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

13 C - النظائر الوسم هو تقنية مفيدة لتحديد استقلاب الخلية المركزية لمختلف أنواع الكائنات الحية الدقيقة. بعد أن تم مثقف الخلايا مع ركيزة محددة المسمى ، يمكن GC - MS قياس تكشف المسارات الأيضية الوظيفية استنادا إلى أنماط وسم فريدة من نوعها في الأحماض الأمينية proteinogenic.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

You, L., Page, L., Feng, X., Berla, B., Pakrasi, H. B., Tang, Y. J. Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids. J. Vis. Exp. (59), e3583, doi:10.3791/3583 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

الميكروبات والمسارات الأيضية المعقدة التي يمكن أن يتم التحقيق باستخدام أساليب الكيمياء الحيوية وعلم الجينوم وظيفية. أسلوب واحد مهم لدراسة استقلاب الخلية المركزية واكتشاف الانزيمات الجديدة هو 13 C - 1 ساعدت تحليل الأيض. وتستند هذه التقنية على وضع العلامات النظائر ، حيث يتم تغذية الميكروبات مع ركائز المسمى C 13. من خلال تتبع مسارات الانتقال بين ذرة الأيضات في شبكة الكيمياء الحيوية ، ويمكننا تحديد مسارات وظيفية جديدة واكتشاف الانزيمات.

كوسيلة مكملة لtranscriptomics والبروتيوميات ، وأساليب isotopomer بمساعدة تحليل المسارات الأيضية تحتوي على ثلاث خطوات رئيسية 2. أولا ، نحن تنمو الخلايا مع ركائز المسمى C 13. في هذه الخطوة ، وتكوين وسيلة واختيار من ركائز المسمى هما عاملان رئيسيان. لتجنب الضوضاء القياس من الكربون غير المسمى في المكملات الغذائيةمطلوب وسيط مع الحد الأدنى من مصدر وحيد للكربون. علاوة على ذلك ، ويستند اختيار ركيزة المسمى على مدى فعالية سيكون توضيح المسار يجري تحليلها. لأن الانزيمات رواية مختلفة الفراغية غالبا ما تنطوي على رد فعل أو منتجات وسيطة ، بصفة عامة ، ركائز الكربون المسمى منفردة أكثر إفصاحا للكشف عن مسارات الرواية من تلك المسماة موحد للكشف عن مسارات الرواية 3 ، 4 ، وثانيا ، نقوم بتحليل الحمض الأميني أنماط العلامات باستخدام GC - MS. الأحماض الأمينية هي وفيرة من البروتين وبالتالي يمكن الحصول عليها من التحلل الكتلة الحيوية. يمكن أن الأحماض الأمينية التي كتبها N - derivatized (ثالثي butyldimethylsilyl) - N - methyltrifluoroacetamide (TBDMS) قبل فصل GC. يمكن أن تكون مجزأة الأحماض الأمينية TBDMS derivatized بواسطة MS والنتيجة في صفائف مختلفة من شظايا. استنادا إلى نسبة الكتلة (م / ض) تهمة من الأحماض الأمينية مجزأة وغير مجزأة ، يمكننا أن نستنتج أن أنماط المسمى ممكن من الأيضات المركزية التيالسلائف من الأحماض الأمينية ، وثالثا ، علينا تتبع التحولات الكربون 13C في المسارات المقترحة ، واستنادا إلى البيانات isotopomer ، تأكيد ما إذا كانت هذه المسارات هي 2 النشطة. قياس الأحماض الأمينية النظائر يوفر معلومات عن العلامات التجارية حوالي ثمانية الأيضات السلائف حاسما في عملية الأيض المركزية. يمكن لهذه العقد الأيضية الرئيسية تعكس مهام المسارات المركزية المرتبطة بها.

ويمكن تحليل عملية الأيض 13 C - ساعدت عبر proteinogenic الأحماض الأمينية المستخدمة على نطاق واسع لتوصيف وظيفي في استقلاب الجرثومية سيئة اتسمت 1. في هذا البروتوكول ، وسوف نستخدم Cyanothece 51142 لان السلالة نموذج للتدليل على استعمال الكربون من ركائز المسمى لاكتشاف وظائف جديدة الأنزيمية.

Protocol

1. ثقافة الخلية (الشكل 1)

  1. زراعة خلايا في المتوسط ​​مع الحد الأدنى من العناصر النزرة والأملاح والفيتامينات ، وركائز الكربون المسمى تحديدا على أن أفضل طريق للتحقيق. إما استخدام قوارير الهز أو المفاعلات الحيوية للثقافة الخلية. المواد الغذائية العضوية ، مثل خلاصة الخميرة ، قد تتداخل مع قياس العلامات الأحماض الأمينية ، وبالتالي لا يمكن أن تكون موجودة في الثقافة المتوسطة.
  2. مراقبة نمو الخلايا من كثافة بصرية للثقافة في طول موجي الأمثل (على سبيل المثال ، OD 730 لCyanothece 51142) مع معمل الأشعة فوق البنفسجية / فيس.
  3. وأول ما تكون الخلايا المزروعة في وسط غير المسمى. ويفضل في المرحلة المتوسطة سجل نمو الخلايا لاستخدامها في تلقيح (3 ٪ (V / V) من نسبة التلقيح وحدة التخزين) من المتوسط ​​المسمى. وينبغي أن يكون المسمى ثقافة فرعية مثقف (3 ٪ V / V نسبة التلقيح) في المتوسط ​​نفس المسمى لتجنب إدخال الكربون غير المسمى من اللقاح الأولي.

الطبقة = "jove_title"> 2. استخراج الحمض الأميني

  1. الحصاد شبه مثقف الخلايا (10ML) في المرحلة المتوسطة النمو سجل بواسطة الطرد المركزي (10 دقيقة ، 8000 × ز).
  2. Resuspend على بيليه في 1.5mL من حمض الهيدروكلوريك 6M وتحويلها إلى الزجاج الشفاف والمسمار GC - أعلى القارورة. غطاء قوارير ووضعها في فرن 100 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ليتحلل في البروتينات إلى أحماض أمينية الكتلة الحيوية. يمكن التحلل من الكتلة الحيوية الكريات الغلة 16 من الأحماض الأمينية 20 مشتركة (الشكل 2) 5. السيستين والتربتوفان والمتدهورة ، ويتم تحويلها إلى الجلوتامين والأسباراجين الغلوتامات واسبارتاتي ، على التوالي.
  3. الطرد المركزي في حل من الأحماض الأمينية في 20000 × ز به لمدة 5 دقائق 2 مل أنابيب إيبندورف ، ونقل إلى قارورة supernatants GC جديدة. هذه الخطوة تزيل الجزيئات الصلبة في حل التحلل.
  4. إزالة الأغطية فيال GC وتجفيف العينات تماما تحت تيار من الهواء باستخدام العلمية الحرارية Reacti - برنامج عمل فيينتيان المبخر (ملاحظة : مجفف تجميد يمكن أن تستخدم أيضا رس العينات الجافة). ويمكن القيام بهذه الخطوة عشية وضحاها.

3. حمض أميني derivatization والشروط GC - MS

تحليل الأحماض الأمينية أو متهم / الأيضات عالية القطبية عبر GC يتطلب أن تكون هذه الأيضات derivatized ، حتى أن الأحماض الأمينية هي متقلبة ويمكن مفصولة اللوني للغاز 2.

  1. حل العينات المجففة مع 150 ميكرولتر من رباعي هيدرو الفوران (THF) و 150 ميكرولتر من N - (ثالثي butyldimethylsilyl) - N - methyltrifluoroacetamide كاشف derivatization.
  2. احتضان جميع العينات في فرن أو حمام المياه بين 65 و 80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. دوامة أحيانا للتأكد من حل الأيضات في القارورة.
  3. الطرد المركزي في العينات ز × 20000 لمدة 10 دقيقة ، ثم نقل إلى طاف GC قوارير جديدة. ينبغي أن يكون طاف حل واضح والصفرة. بسبب تشبع كاشفات ، يمكن أن تتأثر GC - MS دقة قياس عالية بغية دراسته واقراره من قبلntration من الأحماض الأمينية TBDMS derivatized حقن (هذه العينات غالبا ما يظهر اللون البني الداكن) ، ولذلك ، ينبغي لنا أن تضعف هذه العينات باستخدام THF قبل GC - MS قياس 6.
  4. تحليل العينات بواسطة GC - MS (نسبة استخدام تقسيم 1:05 أو 1:10 ، وحجم حقن = 1 ميكرولتر ، الناقل للغاز الهيليوم = 1.2 مل / دقيقة). استخدام الحرارة GC التالية البرنامج : عقد ب 150 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، وزيادة في 3 درجات مئوية في الدقيقة إلى 280 درجة مئوية ، وزيادة في درجة حرارة 20 مئوية في الدقيقة إلى 300 درجة مئوية ، وعقد بعد ذلك لمدة 5 دقائق. يمكن ضبط تأخير المذيبات ودقيقة 5 ~ (GC لعمود 30 مترا). يمكن تعيين مجموعة من كتلة لتوجيه الاتهام نسبة (م / ض) في MS بين 60 و 500.

4. GC - MS تحليل البيانات

  1. ويمكن أيضا TBDMS derivatized قياس الأحماض الأمينية تتأثر في فصل النظائر التمييز GC. النظائر ضوء التحرك قليلا يتنفس بشكل أسرع من النظائر في العمود GC. للحد من التحيز قياس المحتملة ، ونحن قد متوسط ​​الطيف الشامل للمجلس بكامل هيئتهحمض أميني مجموعة الذروة 6
  2. وقد أبلغ مجلس الحكم وأطياف MS الأيضات TBDMS derivatized قبل 7. موضحة في الوقت الاحتفاظ GC وفريدة من نوعها قمم م / ض لكل من الأحماض الأمينية في الشكل 3.
  3. Derivatization من الأحماض الأمينية أو الأيضات المركزية بتقديم كميات كبيرة من النظائر المشعة طبيعيا والمسمى ، من بينهم 13 مئوية (1.13 ٪) ، و 18 O (0.20 ٪) ، و 29 سي (4.70 ٪) ، و 30 سي (3.09 ٪). يمكن تصحيح الضوضاء القياس من النظائر الطبيعية في الطيف الشامل isotopomer الخام باستخدام برنامج نشر 5 و 8. وأفادت البيانات النهائية العلامات النظائر ككسور الشامل ، وعلى سبيل المثال ، M 0 ، M 1 ، م 2 ، م 3 و م 4 (تمثل شظايا تحتوي على صفر إلى أربعة الكربون 13 C المسمى).
  4. ويمكن قياس الأحماض الأمينية توفير المعلومات النظائر الوسم حوالي ثمانية الأيضات السلائف حاسمة : - 2 - أوكسو glutarأكلت ، 3 - P - غليسيرات ، أسيتيل التميم ، احميرار - 4 - P ، oxaloacetate ، الفسفوإينول ، بيروفات ، والريبوز P - 5. يمكن استخدام أنماط العلامات في هذه الأيضات لتحديد العديد من المسارات الأيضية المركزية (الشكل 2) 9. ويمكن لنتائج هذه التجارب وضع العلامات وأكد كذلك باستخدام أساليب الكيمياء الحيوية الأخرى (على سبيل المثال ، RT - PCR).

5. تحليل المسارات باستخدام الحمض الأميني المسمى البيانات

من خلال التحقيق سوى عدد قليل من الأحماض الأمينية الأساسية التي تنتج من 13 مصممة جيدا التجارب التتبع C ، ونحن قد تكشف عدة مسارات فريدة أو أنشطة انزيم دون إجراء تحليل تدفق 13 متطورة من طراز C - الأيض الأيض المركزية برمتها.

  1. Entner - Doudoroff المسار : [1 -- 13 C] ويمكن استخدام الجلوكوز كمصدر للكربون. إذا كان المسار غير نشطة ، ووضع العلامات سيرين يكون أقل بكثير من العلامات في الألانين 10.
  2. TCA دورة تشعبت : [1 -- 13 C]ويمكن استخدام البيروفات كمصدر للكربون. إذا ما تم كسر دورة TCA ، يمكن أن توصف من قبل اثنين من الكربونات اسبارتاتي ، بينما هو المسمى الغلوتامات مع واحد فقط الكربون 11 ، 12.
  3. وكلاهما يستخدم لغير المسمى CO 2 و المسمى ركائز الكربون ومصادر الكربون : CO 2 التثبيت بواسطة كالفين - بنسون - Bassham دورة في التمثيل الغذائي mixotrophic. إذا كالفين دورة وظيفية ، سيتم سيرين وتوسيم الحامض الاميني مخففة إلى حد كبير ، مقارنة مع الأحماض الأمينية الأخرى. هذه الطريقة يمكن تحديد نسبة ثاني أكسيد الكربون عند التثبيت 2 مصادر الكربون العضوي موجودة في 13 المتوسط.
  4. التأكسدي مسار الفوسفات البنتوز : [1 -- 13 C] ويمكن استخدام الجلوكوز كمصدر للكربون. إذا كان المسار غير النشطة ، وغير المسمى الألانين أن> 50 ٪ 12.
  5. تصليحي المسارات (على سبيل المثال ، PEP + CO oxaloacetate à 2) : 13 (2) وثاني أكسيد الكربون غير المسمى ركائز الكربون (مثل الجلسرين أو البيرينيهويمكن استخدام uvate) كمصدر للكربون. إذا كان المسار نشطا ، وسوف تكون العلامات اسبارتاتي المخصب بدرجة كبيرة ، مقارنة ب 13 ألانين وسيرين.
  6. إعادة سيترات - سينسيز : [1 -- 13 C] يمكن استخدامها البيروفات كمصدر للكربون. إذا كان الإنزيم نشطا ، هو المسمى في الغلوتامات β - الكربوكسيل المجموعة 3 ، 4.
  7. Citramalate المسار : [1 -- 13 C] البيروفات ، [2-13 C] الجلسرين ، أو [1 -- 13 C] ويمكن استخدام أسيتات كمصدر للكربون. إذا كان المسار غير نشطة ، ليسين والعلامات المبالغ آيسولوسين متطابقة 14.
  8. سيرين isocitrate لياز دورة : [1 -- 13 C] البيروفات أو [1 -- 13 C] يمكن استخدامها لاكتات كمصدر للكربون. إذا كان المسار نشطا ، وسوف يكون المسمى الكربون المركز الثالث في 15 سيرين.
  9. الاستفادة من العناصر الغذائية (مثل الأحماض الأمينية الخارجية) : وسيلة الثقافة مع ركائز الكربون المسمى بشكل كامل وغير المسماة الأحماض الأمينيةيمكن استخدامها. إذا كانت الخلايا بشكل انتقائي استخدام هذه المواد الغذائية تستكمل غير المسمى ، سوف نرى العلامات الهامة التخفيف من هذه الأحماض الأمينية في الكتلة الحيوية. ويمكن استخدام هذا الأسلوب للتحقيق الذي يفضل المكملات الغذائية من قبل الخلية 16.

6. ممثل النتائج

وأحيا دراسات الطاقة الحيوية الحديثة في استخدام الكائنات الحية الدقيقة مصالح ضوئي جديدة لإنتاج الطاقة الحيوية والتقاط ثاني أكسيد الكربون 2. في السنوات الماضية ، تم تطبيق عدد غير قليل 13C - الأيض التحليلات ، بما في ذلك تحليلات متقدمة التمويه - 13C الاستقلابية (13C - MFA) ، للتحقيق في الأيض المركزية في البكتيريا ضوئي ، وذلك لأن المعرفة البيوكيميائية من المسارات الأيضية المركزي ليس له ما يبرره في هذه الكائنات غير النموذجية 10 ، 11 ، 17-20. هنا ، نقدم مثالا للاكتشاف مسار بديل في آيسولوسين Cyanothece 51142 21. سماويothece 51142 لا تحتوي على انزيم (EC 4.3.1.19 ، ثريونين لياز الأمونيا) ، والذي يحفز تحويل ثريونين لketobutyrate - 2 في مسار آيسولوسين التوليف نموذجي. لحل المسار آيسولوسين ، نحن ننمو Cyanothece 51142 (20 مل) في المتوسط ​​22 ASP2 مع الجلسرين 54 مم (2 - 13C ،> 98 ٪). Cyanothece 51142 2 يستخدم الموقف الثاني المسمى الجلسرين كمصدر الكربون الرئيسية. نلاحظ أن ثريونين والألانين واحد يسمى الكربون ، بينما هو المسمى آيسولوسين مع ثلاثة من الكربونات. لذا ، لا يمكن توليف في Cyanothece 51142 تتأتى من الطريق التي تستخدمها ثريونين معظم الكائنات الحية (الشكل 4). من ناحية أخرى ، وآيسولوسين ليسين وأنماط وضع العلامات على أساس جزء متطابقة (M - 15) + وتفتيت (M - 159) +. على سبيل المثال ، فإن البيانات isotopomer من [M - 15] + (تحتوي على الأحماض الأمينية غير مجزأة) وتظهر العلامات متطابقة ليسين (= 0.01 M0 ، M1 = 0.03 ، 0.21 = M2 ، M3 = 00.69) وآيسولوسين (= 0.01 M0 ، M1 = 0.03 ، 0.24 = M2 ، M3 = 0.67). ومن ثم يجب توليفها ليسين وآيسولوسين من السلائف واحد (أي البيروفات وأسيتيل التميم). هذه الملاحظة بما يتفق مع انتقال الكربون المسمى في مسار citramalate لتخليق آيسولوسين. لتأكيد هذا المسار ، ونحن نبحث عن قاعدة بيانات معهد الجينوم المشترك والبحث عن وجود CIMA سينسيز citramalate (cce_0248) في Cyanothece.

الشكل 1
الشكل 1. تحليل المسارات ال 13 C - ساعدت الخطوات.

الشكل 2
الشكل 2. الأحماض الأمينية المستخدمة في الحصول على نمط توسيم سلائفها الأيضية. ACoA ، أسيتيل التميم ؛ AKG ، α - كيتوغلوتارات ؛ C5P ، ريبوز 5 فوسفات ؛ الاتصالات وتكنولوجيا المعلومات ، سترات ؛ E4P ، احميرار 4 - الفوسفات ؛ G6P والجلوكوز 6 فوسفات ؛ OAA ، oxaloacetate ؛ PEP ، الفسفوإينول ؛ PGA ، 3 - فسفوغليسرات ؛ البيرينيه ، بيروفات.

الشكل 3
الشكل 3. قمم GC لمدة 16 الأحماض الأمينية. وتصدع الأحماض الأمينية TBDMS derivatized بواسطة MS قسمين شظايا : (M - 57) + ، الذي يحتوي على حمض أميني بأكمله ، و (M - 159) + ، والذي يفتقر إلى مجموعة الكربوكسيل α من الأحماض الأمينية. ليسين وآيسولوسين ، وتتداخل مع + (M - 57) من قمم الإعلام الأخرى. نقترح استخدام جزء (M - 15) + لتحليل كامل العلامات الأحماض الأمينية. تم الكشف عن مجموعة + (f302) في معظم الأحماض الأمينية ، والذي يحتوي فقط على الأول (α - الكربوكسيل المجموعة) والكربونات الثاني في العمود الفقري من الأحماض الأمينية. لأن هذا قد MS الذروة غالبا ما تكون مرتفعة من الضوضاء إشارة إلى نسب (f302) + غير مستحسن لتحليل كمي لتدفقات الأيضية 7.

igure 4 "/>
الشكل 4. صفها التحولات في مسارات آيسولوسين في Cyanothece 51142 (معدلة من ورقتنا السابقة) 21.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتكون هذا البروتوكول للتغذية الخلية مع ركيزة وصفت وقياس الناتج أنماط العلامات النظائر في الأحماض الأمينية عبر GC - MS. منذ MS البيانات (م / ض النسب) تعطي فقط من المبلغ الإجمالي لوضع العلامات من الأيونات MS ، لدينا لتقييم توزيعات isotopomer من الأحماض الأمينية عن طريق فحص نسب م / ض على حد سواء + (M - 57) والأحماض الأمينية غير مجزأة مجزأة (أي (M - 159) + و (f302) +). وعلاوة على ذلك ، يمكننا القيام الثقافات الخلية عدة مع وسيلة مماثلة كيميائيا ولكن ركائز التي وسم أنماط مختلفة (1 الموقف الأول المسمى (2) ، الموقف الثاني المسمى ، الخ). يمكن أن تكون متكاملة للمعلومات حول وضع العلامات الأيضات من هذه التجارب لفك الكربون الانتقال الفعلي من خلال طرق المسارات الأيضية المركزية.

لتحليل المسارات ، واختيار ركيزة المسمى هو المهم. بصفة عامة ، ركائز الكربون المسمى منفردة هي EASهيئة الإنصاف والمصالحة ، لاستخدامها في تتبع مصير الكربون المسمى عندما يتسرب من خلال مسارات C 13 المركزية ، في حين متعددة الكربون المسمى ركائز قد اربكت الكربون البحث عن المفقودين. أيضا ، ركائز المسمى منفردة أكثر إفصاحا لتوضيح هياكل فريدة من نوعها في جزيء الأيضات من ركائز المسمى موحد. 4 على سبيل المثال ، سينسيز سيترات (إعادة) من نوع مختلف الفراغية يظهر رد فعل من سينسيز سترات عادية ، ويؤدي بالتالي إلى سترات والجزيئية شرليتي مختلفة . من ناحية أخرى ، ركائز مختلفة في مدى ملاءمتها للكشف عن المسارات المرتبطة بها. الجلوكوز هو أفضل للكشف عن نسبة الانقسام بين تحلل ومسارات البنتوز الفوسفات ، في حين البيروفات أو خلات هي الأفضل لتحليل دورة TCA وبعض المسارات من الأحماض الأمينية. وبالتالي ، فمن الضروري استخدام ركائز مختلفة للتحقيق في الصورة العامة للالأيض الخلوي.

13 C - النظيرالوسم هو تقنية مفيدة لتحديد المسارات الوظيفية في الكائنات الحية الدقيقة. ومع ذلك ، فإن هذا الأسلوب له العديد من القيود. أولا ، هي مناسبة فقط لتحليل استقلاب الكربون باستخدام ركائز العضوية ، لأنه لا يمكن حل مباشرة في عملية الأيض الأيض ذاتية التغذية إذا تم استخدام ثاني أكسيد الكربون 2 كمصدر وحيد للكربون. ثقافات ذاتية التغذية باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 تسمية جميع الأحماض الأمينية بالقدر نفسه كإدخال 12 CO 2 / 13 2 CO الخليط 23. وهذا يجعل من الصعب تحليل المسارات ، وتحليل عملية التمثيل الغذائي لابد من الاستدلال على ذلك من إعادة ترتيب ذرات الكربون C 13 في الأيضات بواسطة المسارات الأيضية المختلفة ، وثانيا ، تعرض هذه الورقة النتائج النوعية فقط التمييز بين "نشطة" و "غير نشطة" المسارات. الكمي الدقيق لعملية التمثيل الغذائي يتطلب نهجا نمذجة متطورة (أي ، وثالثا ، يقتصر نطاق التحليل الأيض C - 13 من التحديات التقنية في تحديد وفرة منخفضة وغير مستقرة الأيضات. يمكن أن يكون أوسع شبكة الأيضية بحث عن طريق تحليل الأيضات مجانا إلى جانب الأحماض الأمينية. قياس الأيضات الحرة يتطلب درجة عالية من الكفاءة وطرق استخراج المستقلب منصات عالية الحساسية التحليلية. وقد استخدمت LC - MS ، MS - FT مجلس النواب ، وMS - CE لتحديد أنماط توسيم الأيضات مجانا ، وتوفير مزيد من التبصر في الأيض الخلوي 2. من الأفضل القيام الرابع ، 13 تحليل المسارات C - ساعدت في الحد الأدنى من المتوسط ​​، وذلك لأن بالإضافة إلى ذلك من غير المسمى المكملات الغذائية يؤدي إلى انخفاض تركيزات العلامات زورا وجعل الكمية 13 C - MFA الدراسات يست مباشرة بذلك. أيضا ، قد تستخدم خلايا الأحماض الأمينية الخارجية على نطاق واسع للبروتين synthesiق ، وبالتالي تعطي اشارات ضعيفة جدا لوضع العلامات الأحماض الأمينية هذه proteinogenic 24. إذا كان مطلوبا أو متوسطة غنية لزراعة الخلايا ، وقياس الأيضات الخلايا ، بدلا من الأحماض الأمينية ، يمكن أن تقلل بشكل فعال في وضع العلامات تدخل البيانات التي تنشأ من المغذيات الخارجية الكربون غير المسمى.

أخيرا ، يجري نشر عدد متزايد من تسلسل الجينوم للأنواع الجراثيم غير نموذجية في كل عام. ومع ذلك ، فقد تخلفت عن التوصيف الوظيفي لهذه الأنواع حتى وراء وتيرة التسلسل الجيني. C - 13 التوسيم النهج يمكن أن تلعب دورا هاما في تأكيد واكتشاف المسارات الأيضية في الكائنات غير نموذجية عديدة. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن تكون متكاملة مع المعلومات العلامات النمذجة الأيضية (13 C - MFA) لتدفقات الكربون المطلقة في فك الكائنات الحية الدقيقة 25. ولذلك ، يمكن استخدام هذه التقنية على نطاق واسع في تحليل النظم البيولوجية المتصلة الوقود الحيوي ، ايكولوجكال والتطبيقات الطبية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذه الدراسة عن طريق منحة شهادة NSF (MCB0954016) والطاقة الحيوية وزارة الطاقة بحوث غرانت (DEFG0208ER64694).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TBDMS Sigma-Aldrich 19915 -
THF Sigma-Aldrich 34865 -
Labeled carbon substrate Cambridge Isotope Laboratories Depend on the experimental requirement Website: http://www.isotope.com
Gas chromatograph Agilent Technologies Hewlett-Packard, model 7890A -
GC Columns J&W Scientific DB5 (30m) -
Mass spectrometer Agilent Technologies 5975C -
Reacti-Vap Evaporator Thermo Fisher Scientific, Inc. TS-18825 For drying amino acid samples

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
  2. Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev. 28, 362-375 (2009).
  3. Tang, Y. J. Investigation of carbon metabolism in Dehalococcoides ethenogenes strain 195 via isotopic and transcriptomic analysisa. J. Bacteriol. 191, 5224-5231 (2009).
  4. Tang, Y. J. Pathway confirmation and flux analysis of central metabolic pathways in Desulfovibrio vulgaris Hildenborough using GC-MS and FT-ICR mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 189, 940-949 (2007).
  5. Dauner, M., Sauer, U. GC-MS analysis of amino acids rapidly provides rich information for isotopomer balancing. Biotechnology Progress. 16, 642-649 (2000).
  6. Wittmann, C. Fluxome analysis using GC-MS. Microbial Cell Factories. 6, 6-6 (2007).
  7. Antoniewicz, M. R., Kelleher, J. K., Stephanopoulos, G. Accurate assessment of amino acid mass isotopomer distributions for metabolic flux analysis. Anal. Chem. 79, 7554-7559 (2007).
  8. Wahl, S. A., Dauner, M., Wiechert, W. New tools for mass isotopomer data evaluation in 13C flux analysis: mass isotope correction, data consistency checking, and precursor relationships. Biotechnology and Bioengineering. 85, 259-268 (2004).
  9. Shaikh, A., Tang, Y. J., Mukhopadhyay, A., Keasling, J. D. Isotopomer distributions in amino acids from a highly expressed protein as a proxy for those from total protein. Analytical Chemistry. 80, 886-890 (2008).
  10. Tang, K. -H., Feng, X., Tang, Y. J., Blankenship, R. E. Carbohydrate metabolism and carbon fixation in Roseobacter denitrificans OCh114. PLoS One. 4, e7233-e7233 (2009).
  11. Tang, K. -H. Carbon flow of Heliobacterium modesticaldum is more related to Firmicutes than to the green sulfur bacteria. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
  12. Feng, X. Characterization of the Central Metabolic Pathways in Thermoanaerobacter sp. X514 via Isotopomer-Assisted Metabolite Analysis. Appl. Environ. Microbiol. 75, 5001-5008 (2009).
  13. Feng, X. Mixotrophic and photoheterotrophic metabolisms in Cyanothece sp. ATCC 51142 under continuous light. Microbiology. 156, 2566-2574 (2010).
  14. Tang, Y. J. Flux analysis of central metabolic pathways in Geobacter metallireducens during reduction of soluble Fe(III)-NTA. Appl. Environ. Microbiol. 73, 3859-3864 (2007).
  15. Tang, Y. J., Meadows, A. L., Kirby, J., Keasling, J. D. Anaerobic central metabolic pathways in Shewanella oneidensis MR-1 reinterpreted in the light of isotopic metabolite labeling. Journal of Bacteriology. 189, 894-901 (2007).
  16. Zhuang, W. Q. Selective utilization of exogenous amino acids by Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and the enhancement resulted to dechloronation activity. Appl. Environ. Microbiol. Forthcoming (2011).
  17. Feng, X., Tang, K. -H., Blankenship, R. E., Tang, Y. J. Metabolic flux analysis of the mixotrophic metabolisms in the green sulfur bacterium Chlorobaculum tepidum. J. Biol. Chem. 285, 35104-35112 (2010).
  18. McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Carbon dioxide fixation as a central redox cofactor recycling mechanism in bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
  19. McKinlay, J. B., Harwood, C. S. Calvin cycle flux, pathway constraints, and substrate oxidation state together determine the H2 biofuel yield in photoheterotrophic bacteria. MBio. 2, (2011).
  20. Erb, T. J. Synthesis of C5-dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The ethylmalonyl-CoA pathway. PNAS. 104, 10631-10636 (2007).
  21. Wu, B. Alternative isoleucine synthesis pathway in cyanobacterial species. Microbiology. 156, 596-602 (2010).
  22. Reddy, K. J., Haskell, J. B., Sherman, D. M., Sherman, L. A. Unicellular, aerobic nitrogen-fixing cyanobacteria of the genus Cyanothece. J. Bacteriol. 175, 1284-1292 (1993).
  23. Shastri, A. A., Morgan, J. A. A transient isotopic labeling methodology for 13C metabolic flux analysis of photoautotrophic microorganisms. Phytochemistry. 68, 2302-2312 (2007).
  24. Tang, Y. J. Invariability of central metabolic flux distribution in Shewanella oneidensis MR-1 under environmental or genetic perturbations. Biotechnol Prog. 25, 1254-1259 (2009).
  25. Zamboni, N., Fendt, S. M., Ruhl, M., Sauer, U. 13C-based metabolic flux analysis. Nature Protocols. 4, 878-892 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics