प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माउस sciatic तंत्रिका और पूरे पर्वत स्नायु विश्लेषण द्वारा पुनर्जनन के बाद आकलन क्रश

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Neuroscience

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Summary

इस रिपोर्ट में हम sciatic तंत्रिका के लिए माउस को कुचलने के लिए एक विधि का वर्णन. इस विधि आसानी से उपलब्ध रक्तवाहिका संदंश का उपयोग करता है और आसानी से और reproducibly पूरा sciatic तंत्रिका कुचलने के उत्पादन. इसके अलावा, हम एक विधि का वर्णन करने के लिए पूरे मांसपेशी तंत्रिका पुनर्जनन sciatic तंत्रिका को कुचलने के बाद के विश्लेषण के लिए उपयुक्त है mounts तैयार.

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Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis. J. Vis. Exp. (60), e3606, doi:10.3791/3606 (2012).

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Abstract

परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) के उत्थान व्यापक रूप से दोनों मानव रोग के लिए अपनी प्रासंगिकता के लिए और मजबूत पुनर्योजी पीएन जिससे संभवतः CNS के एक उत्थान की विफलताओं को रोशन न्यूरॉन्स द्वारा घुड़सवार प्रतिक्रिया को समझने अध्ययन किया है. Sciatic तंत्रिका क्रश (अक्षतंतुविच्छेद) के 2 कृन्तकों में परिधीय तंत्रिका चोट का सबसे आम मॉडल में से एक है. बीच में आता है कुचल सभी axons लेकिन श्वान सेल बेसल laminae संरक्षित कर रहे हैं ताकि उत्थान 3,4 इष्टतम है. इस अन्वेषक ठीक एक से बढ़ अक्षतंतु की क्षमता दोनों श्वान सेल और बेसल 4 laminae के साथ बातचीत करने के लिए अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. चूहे आम तौर पर से प्रयोगात्मक तंत्रिका कुचलने के लिए पसंदीदा पशु मॉडल किया गया. वे व्यापक रूप से उपलब्ध हैं और उनके lesioned sciatic तंत्रिका मानव तंत्रिका घावों 5,4 के एक उचित सन्निकटन प्रदान करता है. चूहा तंत्रिका की तुलना में आकार में छोटे हालांकि, माउस तंत्रिका इसी तरह के कई गुण हैं. सबसे महत्वपूर्ण हालांकि समझौता ज्ञापनों,ई मॉडल ट्रांसजेनिक लाइनों की व्यापक उपलब्धता की वजह से तेजी से मूल्यवान हैं अब व्यक्तिगत तंत्रिका उत्थान 6, 7 के लिए महत्वपूर्ण अणुओं के एक विस्तृत विच्छेदन के लिए अनुमति देता है. पिछले जांचकर्ताओं कई तरीकों का इस्तेमाल किया है एक तंत्रिका क्रश या चोट सहित सरल angled संदंश, ठंडा संदंश, रक्तवाहिका संदंश, संवहनी clamps, और अन्वेषक डिजाइन 8,9,10,11,12 clamps के उत्पादन के लिए. जांचकर्ता भी चोट सीवन, कार्बन कणों और फ्लोरोसेंट 13,14,1 मोती सहित साइट अंकन के विभिन्न तरीकों का इस्तेमाल किया है. हम हमारे लिए सही और लगातार क्रश ठीक रक्तवाहिका संदंश और बाद में कार्बन कुचलने साइट अंकन का उपयोग कर साइट के अंकन के साथ reproducibly पूरा sciatic तंत्रिका कुचलने प्राप्त विधि का वर्णन करता है. हमारे sciatic तंत्रिका कुचलने प्रक्रिया के विवरण के भाग के रूप में हम भी शामिल है मांसपेशी पूरी की एक अपेक्षाकृत सरल विधि माउंट हम बाद में उत्थान यों का उपयोग करें.

Protocol

1. पशु विषय

1.1. उपचार

  1. सभी पशु प्रक्रियाओं स्थानीय संस्थान पशु की देखभाल और आचार समिति के अनुमोदन के साथ और और स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों का उपयोग समिति और राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार किया जाना चाहिए, दर्द और तकलीफ को कम करने के लिए किए गए उपायों के साथ.
  2. हमारे चूहे 12 घंटे एक रिवर्स प्रकाश और अंधेरे चक्र पर तापमान नियंत्रित शर्तों के तहत रखे थे, खिलाया माउस चाउ और पानी यथेच्छ जबकि.
  3. वयस्क उत्थान के अध्ययन के लिए, चूहों की उम्र के कम से कम 6 सप्ताह हो सकता है जब sciatic तंत्रिका क्रश किया जाता है. इस उम्र में समय है, जिस पर polyneural neuromuscular जंक्शनों की छंटाई जगह ले परे है.
  4. इन प्रयोगों में 6-8 सप्ताह, हम पुराने C57BL / 6 चार्ल्स नदी से प्राप्त चूहों का इस्तेमाल किया. जब sciatic तंत्रिका को कुचलने के बाद (यानी: अक्षतंतु विकास की दर) उत्थान माउस उपभेदों की तुलना में एक ही हो सकता है, axonal उत्थान में मतभेद के रूप में नहीं किया गया है चाहिएविभिन्न जन्मजात 15,16 उपभेदों के बीच एड. यदि आनुवंशिक रूप से चालाकी से चूहों के लिए इस्तेमाल किया जा, littermate नियंत्रण सबसे उपयुक्त हैं.

1.2. सर्जिकल तैयारी

  1. पशु intraperitoneal इंजेक्शन के माध्यम से (100 मिलीग्राम / किग्रा) ketamine और xylazine के (10 मिलीग्राम / किग्रा) के एक कॉकटेल का उपयोग सर्जरी के लिए गहरा संवेदनाहृत हैं. प्रत्येक जानवर भी meloxicam का एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन (10 मिलीग्राम / किग्रा) के लिए पोस्ट ऑपरेटिव दर्द को कम प्राप्त करता है.
  2. दोनों hindquarters ध्यान से एक शल्य चिकित्सा (Roboz, आर सी 5903) कतरनी और लोभशातन के नायर बालों को हटाने की क्रीम (स्थानीय फार्मेसी में पाया) के साथ पूरा हो गया है का उपयोग कर के बाल काटे कर रहे हैं.
  3. त्वचा शुद्ध है बाँझ कपास इत्तला दे दी applicators और betadine शल्य साफ़ (फिशर साइंटिफिक, 19,066,452) का उपयोग कर.
  4. नेत्र मरहम (फिशर साइंटिफिक, 19,082,795) आँखों बाँझ कपास इत्तला दे दी applicators का उपयोग करने के लिए लागू किया जाता है.
  5. माउस एक स्वच्छ स्टेनलेस स्टील प्लेट पर रखा गया है, जिसके तहत एक पूर्व गर्म homeot रखा गया हैhermic कंबल प्रणाली (हार्वर्ड उपकरण, 507222F). पशु तापमान 37 पर बनाए रखा है डिग्री सेल्सियस
  6. सभी अंग नीचे हिंद अंग संतुलित स्थिति है कि घुटने संयुक्त शरीर (चित्र 1, एक पैनल) के साथ एक सही कोण बनाता है ध्यान रखा के साथ, टेप कर रहे हैं.
  7. शल्य चिकित्सा के क्षेत्र में एक बाँझ कपड़ा के साथ कवर किया जाता है. सभी उपकरणों आटोक्लेव या गर्म मनका (ललित विज्ञान उपकरण, 18000-45) बंध्याकरण और सर्जन एक मुखौटा, गाउन, और बाँझ दस्ताने पहनता है द्वारा निष्फल रहे हैं.

2. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य Sciatic तंत्रिका क्रश

  1. तैयारी के बाद, midline (चित्र 1) के पार एक अर्द्ध परिपत्र चीरा त्वचा में किया जाता है. त्वचा धीरे अंतर्निहित मांसलता से dissected किया है, और अधिक जोड़कर प्रक्रिया के दौरान जिस तरह से बाहर रहना. यह नम रखा जाता है की प्रक्रिया के दौरान 0.1 एमएल बाँझ खारा (Hospira, 0409-4888-20) के अनुप्रयोगों का उपयोग कर.
  2. Gluteus maximus और मछलियां femori की में पूर्वकाल सिर बीच प्रावरणीय विमान खोलनाsciatic तंत्रिका (चित्रा 1, पैनल एक) का पता चलता है. एक शल्य नियंत्रण के लिए, contralateral sciatic तंत्रिका और उजागर किया जाना चाहिए जुटाए, लेकिन बरकरार रह गए. gluteal मांसलता है तो फिर से विरोध किया और एक 6-0 लट में रेशम, गैर - absorbable sutures के (Roboz, SUT-1073-11) के का उपयोग sutured.
  3. प्रयोगात्मक sciatic तंत्रिका तो एक ही फैशन में दृश्य (चित्रा 1, पैनल बी) को कम करने के लिए जगह में retractors के साथ संपर्क में है. retractors के पहले निष्फल रहे हैं उपयोग करने के लिए.
    नोट: हालांकि retractor प्रणाली व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, वे अक्सर काफी महंगा है. हम एक संतोषजनक प्रतिकर्षक सस्ती हार्डवेयर की आपूर्ति और कीट पिंस (सामग्री अनुभाग देखें) का उपयोग कर प्रणाली बनाने के लिए सक्षम थे.
  4. sciatic तंत्रिका फिर धीरे आसपास के संयोजी iridectomy कैंची का उपयोग करने के ऊतकों से मुक्त है.
  5. ठीक एक 5/45 (ललित विज्ञान उपकरण, 11251-35) संदंश का प्रयोग, तंत्रिका एक सुपर ठीक रक्तवाहिका संदंश के नीचे जबड़े (ललित विज्ञान बहुत पर रखा गया हैरास, 13020-12). तीन fascicles क्रमिक रूप से एक दूसरे के ऊपर (चित्र 1, इनसेट बी) पर गठबंधन नहीं कर रहे हैं. रक्तवाहिका संदंश उनके टिप से 1.5 मिमी पर एक निशान के साथ उत्कीर्ण किया गया है. नितंबीय के बाह्यतम भाग कुचलने से पहले इस चिह्न के साथ लाइन में रखा गया है. यह एक समान चौड़ाई की एक क्रश सुनिश्चित करता है, और है कि तंत्रिका रक्तवाहिका संदंश के जबड़े से परे का विस्तार नहीं जब कुचल बल की वजह से चपटा करता है. यदि तंत्रिका तंत्रिका संदंश टिप से परे फैली हुई है केवल आंशिक रूप से कुचल दिया जाएगा.
  6. कुचलने सीधा तंत्रिका किया जाता है, तीसरे पैर की अंगुली से 45 मिमी के रूप में एक धागा है कि sciatic तंत्रिका के पथ करीब से मापा. तंत्रिका एक बार 15 सेकंड के लिए रक्तवाहिका संदंश 3 क्लिक में कुचल है. देखभाल करने के लिए तंत्रिका खिंचाव नहीं लिया जाता है. जब hemostats फिर से खोल रहे हैं, पूरे तंत्रिका कुचलने साइट पर पारभासी होना चाहिए.
  7. रक्तवाहिका संदंश की दूसरी जोड़ी (पहले के समान) है कि पूर्व डूबा में किया गया हैपाउडर कार्बन (फिशर साइंटिफिक, C272-500) कुचलने साइट चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. तंत्रिका ही क्रश साइट पर 15 सेकंड के लिए 3 क्लिक्स को कुचल दिया है. नहीं अंकन कार्बन प्रारंभिक कुचलने की सीमा से परे का विस्तार करना चाहिए. यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है अगर कुचलने साइट का सटीक अंकन की आवश्यकता है. कार्बन पाउडर का उपयोग करने से पहले, पराबैंगनी प्रकाश में जोखिम के दो घंटे के लिए निष्फल है, और उसके बाद बाँझ तकनीक का उपयोग करते हुए नियंत्रित किया जाता है.
    1. कार्बन में संदंश पूर्व डुबकी लेकिन शल्य साइट पर बड़े पैमाने पर कार्बन रोकना, संदंश पाउडर कार्बन में खोल रहे हैं, फिर धीरे से (लेकिन नहीं क्लिक) बंद बंद, और hemostats के बाहर पर कार्बन से मिटा बाँझ धुंध का उपयोग . संदंश कम से कम 3x बढ़ाई सत्यापित करने के लिए कि पेराई सतहों पाउडर कार्बन में समान रूप से लेपित हैं के तहत की जाँच कर रहे हैं. यदि आवश्यक हो, तो वे फिर से डूबा जाता है और साफ हो.
  8. gluteal मांसलता फिर से विरोध किया है और contralateral पक्ष के रूप में एक ही रास्ते में sutured.
  9. अंत में, त्वचा चीरा 9 मिमी पलटा क्लिप (; +५,००,३४५ एप्लायर विश्व प्रेसिजन उपकरण, 500,346) का उपयोग बंद कर दिया है. यदि 9 मिमी पलटा क्लिप आंदोलन, छोटे पलटा क्लिप या 6-0 sutures के (Roboz, SUT-1073-11) के प्रतिबंधित पाए जाते हैं बजाय के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

3. पोस्ट ऑपरेटिव केयर

  1. प्रक्रिया के बाद, पशुओं के लिए एक हीटिंग पैड पर 37 में रखा जाता है डिग्री सेल्सियस तक वे आंदोलन के लक्षण दिखाने के लिए.
  2. वे तो उनके घर पिंजरे, जहां पानी और भोजन Hydrogel और गीला भोजन के रूप में फर्श पर आसानी से सुलभ हैं वापस चले गए हैं.

4. अर्ध पतला तैयारी के

  1. Pentobarbital की एक ज्यादा (300 मिलीग्राम / किग्रा) के बाद पैर मांसलता sciatic तंत्रिका * बेनकाब करने के लिए हटा दिया है. बगल में शेष तंत्रिका के साथ, पीछला भाग 2% और 30 मिनट के लिए 0.1 एम बर्फ पर फॉस्फेट बफर में 2% gluteraldehyde paraformaldehyde में डूब जाता है.
    यदि पूरे माउंट मांसपेशी तैयारी को पूरा *, मांसपेशियों फसलsciatic तंत्रिका को उजागर करने से पहले एड.
  2. तंत्रिका ध्यान से केवल प्रॉक्सिमल अंत संभाल लिया देखभाल के साथ हटा दिया जाता है. तो तंत्रिका तीन अतिरिक्त घंटे के लिए एक ही लगानेवाला के बाद निश्चित है.
  3. निर्धारण के बाद तंत्रिका 0.1 एम फॉस्फेट बफर में तीन बार से rinsed है.
  4. इस तंत्रिका 2% आज़मियम tetroxide में एक घंटे के लिए 0.1 एम फॉस्फेट बफर में डूब जाता है.
  5. यह तंत्रिका फिर तेजी से ध्यान केंद्रित इथेनॉल में अनुक्रमिक विसर्जन (50%, 70%, 80%, 95%, 100%, 100%, 100%) द्वारा निर्जलित है. प्रत्येक विसर्जन 15 मिनट है.
  6. निर्जलित तंत्रिका propylene ऑक्साइड में दो बार हर तीन मिनट के लिए incubated रहे है.
  7. तो तंत्रिका propylene ऑक्साइड के एक 1:1 मिश्रण में डूब जाता है और कम से कम 6 घंटे के लिए 812 एम्बेड (आमतौर पर रातोंरात).
  8. तो तंत्रिका propylene ऑक्साइड की एक 2:1 मिश्रण में डूब जाता है और 812 रातोंरात एम्बेड.
  9. अंत में, तंत्रिका शुद्ध एम्बेड 812 में छह घंटे के लिए डूब जाता है, तो उपयुक्त ढालना और बीए में एम्बेडेड48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ked के.
  10. 1.0 माइक्रोन वर्गों बाहर तंत्रिका स्टंप से कुचलने एक गिलास और toluidine नीले रंग के साथ चाकू दाग के साथ एक Ultracut UCT ultramicrotome (Leica) का उपयोग कर साइट से एक निर्धारित दूरी पर काट रहे हैं. पतली वर्गों को भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा फैटी की परीक्षा के लिए उत्पादन किया जा सकता है.

5. पूरे पर्वत बलवान तैयारी

  1. पहले चूहों pentobarbital की एक ज्यादा (300 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ बलिदान कर रहे हैं और हिंद अंग घुटनों पर हटा रहे हैं.
  2. हिंद अंग में चार की मांसपेशियों को विश्लेषण के लिए हटा रहे हैं: tibialis पूर्वकाल (टीए), प्रसारिणी digitorum (edl का) longus, soleus, और peroneus longus.
  3. सभी मांसपेशियों को सावधान विच्छेदन के माध्यम से हटा रहे हैं और अपने संयोजी ऊतक के माध्यम से एक काले (फिशर साइंटिफिक NC9492579) के लेपित पकवान sylgard टिकी. वे पीबीएस में से rinsed कर रहे हैं, और फिर 30 मिनट के लिए 4% paraformaldehyde में तय की.
  4. प्रादेशिक सेना तो पीबीएस में से rinsed है, अक्टूबर में एम्बेडेड (फिशर साइंटिफिक, 14-373-65), और जल्दी से एसीटोन और शुष्क बर्फ के स्नान में जमे हुए है.
    1. यह -80 डिग्री मामले में पतली सेक्शनिंग पूरे माउंट तैयारी में विफल रहता है के लिए सी में संग्रहीत किया जाता है. सामान्य में, प्रादेशिक सेना भी पर्याप्त पूरी लिए mounts मोटी है.
  5. Edl का,, soleus, और peroneus longus पीबीएस में 3 x 10 मिनट, 0.1 एम * ग्लाइसिन (फिशर साइंटिफिक, AC12007-0010, पीबीएस में पतला) में रखा के लिए धोए 30 मिनट के लिए, और 3 एक्स 10 मिनट पीबीएस में फिर से धोए. वे तो बर्फ ठंड -20 पर वास्तव में 5 मिनट के लिए 100% मेथनॉल डिग्री सेल्सियस में बुझती हैं, पीबीएस में 3 एक्स 10 मिनट से rinsed, और fluorescently अल्फा (1:200 पतला पीबीएस में) 30 मिनट के लिए संयुग्मित bungarotoxin में नहाया. मांसपेशियों पीबीएस में 3 x 10 मिनट, 2% BSA में एक ब्लॉक 1 घंटे (KPL, 50-61-00) और 0.2% Triton एक्स 100 (डॉट वैज्ञानिक शामिल, 9002-93-1) के बाद के लिए धोए हैं पीबीएस में, और रात भर incubated रहे जबकि प्राथमिक वही 2% BSA/0.2% ट्राइटन ब्लॉक में पतला एंटीबॉडी के एक कॉकटेल में डिग्री सेल्सियस 4 में कमाल.
    * जीएलycine और अवरुद्ध समाधान मांसपेशी कटाई के रूप में एक ही दिन पर किया जाता है और कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट के लिए पूर्व उभारा उपयोग करने के लिए.
    1. , एक माउस मोनोक्लोनल synaptic पुटिका मार्कर (DSHB SV2, 1:1000 पतला), और rhodamine संयुग्मित अल्फा, axons और neuromuscular synapses के निशान, हम एक माउस मोनोक्लोनल neurofilament मार्कर (1:1000 पतला, Covance, SMI-312R) का एक संयोजन का उपयोग करें bungarotoxin - (सिग्मा Aldrich, 1:200 पतला). प्रतिक्रियाशील श्वान कोशिकाओं निशान हम विरोधी गैप 43 - खरगोश (Novus बायोलॉजिकल, NB300-143, 1/500 पतला) का उपयोग करें. प्राथमिक एंटीबॉडी IgG1 उप प्रकार विशिष्ट fluorescein संयुग्मित बकरी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी और DyLight 649 संयुग्मित गधा विरोधी खरगोश (जैक्सन ImmunoResearch, 1:200 पतला) के साथ देखे हैं.
  6. अगले दिन, मांसपेशियों पीबीएस में 3 एक्स 10 मिनट के लिए से rinsed कर रहे हैं, और माध्यमिक एंटीबॉडी में incubated 1:200 पतला (2% BSA/0.2% ट्राइटन अवरुद्ध समाधान में). वे तो Pbs, के लिए 2 एक्स 10 मिनट से rinsed, और एक और 10 मिनट में पीबीएस में कुल्ला DAPI में विसर्जन 5 मिनट (विआयनीकृत पानी में 300 एनएम पतला Invitrogen, D3571) द्वारा llowed.
  7. प्रत्येक मांसपेशी तो एक काले sylgard (फिशर साइंटिफिक, NC9492579) लेपित पेट्री डिश पर विच्छेदित है. शुरू tendons अपनी प्रविष्टि बिंदुओं पर मांसपेशियों में हटा रहे हैं, और दूर इंटीरियर मांसपेशी फाइबर (चित्रा 3, पैनल एसी) छीलने से तो मांसपेशियों को पतला कर रहे हैं. देखभाल करने के लिए मांसपेशियों की बाहरी सतह endplate बैंड (चित्रा 3, पैनल लोमो) सहित, की रक्षा के लिए लिया जाता है. परिणामस्वरूप मांसपेशियों (वेक्टर प्रयोगशालाओं, एच 1000) vectashield और 22 (फिशर साइंटिफिक, 12-550-15) के साथ अधिक स्लाइड पर बढ़ रहे हैं x 40 मिमी ग्लास (फिशर साइंटिफिक, 12-548-5C) coverslips स्पष्ट नेल पॉलिश द्वारा सील दोनों पक्षों पर. जब ठीक से बैंड संपर्क endplate coverslip स्लाइड पर घुड़सवार.

6. पुनर्जनन मापने

  1. उत्थान में सभी तीन मांसपेशियों (peroneus, EDL, और soleus) के अनुमान लगाया जा सकता है. हम अक्सर पूर्वतंत्रिका को कुचलने के बाद चौदह दिन amine के उत्थान, एक समय जिस पर NMJs का एक बड़ा प्रतिशत फिर से innervated कर रहे हैं. दोनों पहले और बाद में समय अंक भी उपयुक्त हैं, वैज्ञानिक सवाल पूछा जा रहा है पर निर्भर करता है. प्रत्येक मांसपेशी में, पूरे endplate बैंड फिर से स्फूर्तिदान जांच की है. केवल एन चेहरा सतह NMJs रन बनाए हैं. इस फैशन में, मांसपेशियों प्रति कम से कम 200 NMJs जल्दी से जांच की जा सकती है.
  2. मांसपेशी स्कोर फिर से स्फूर्तिदान हम एक "फिर से स्फूर्तिदान अनुपात का निर्धारण. विभाजक किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना neuromuscular जंक्शनों के रूप में α-bungarotoxin बाध्यकारी और श्वान सेल अंतर 43 immunoreactivity के द्वारा लेबल की संख्या है. अंश पुनः innervated रूप में neurofilament/SV2 immunoreactivity द्वारा लेबल NMJs है की संख्या है. यदि जरूरत, NMJs को या तो (SV2 द्वारा α-bungarotoxin की अधूरी कवरेज) आंशिक रूप से या पूरी तरह (α bungarotoxin की SV2 द्वारा पूर्ण कवरेज) फिर से innervated के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है. फिर से innervated और किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना NMJs के उदाहरण के लिए चित्रा 3, पैनल जी और एच देखें.

7. प्रतिनिधि परिणाम

चित्रा 1
चित्रा 1 हिंद अंग शरीर रचना की तंत्रिका को कुचलने के लिए महत्वपूर्ण योजनाबद्ध एक अर्द्ध परिपत्र चीरा त्वचा अंतर्निहित मांसलता खुलासा किया गया है बी gluteal मांसलता अलग किया गया है, और sciatic तंत्रिका से पता चला (2.4 कदम ऊपर).. एक तीर लगभग कुचलने साइट अर्थ. Retractor नियुक्ति एक सामान्य गाइड के रूप में दिखाया गया है, और प्रत्येक शिएटिक और कुचलने के लिए रक्तवाहिका संदंश के दृष्टिकोण के दृश्य को कम करने की सर्जरी के दौरान समायोजित (इनसेट) बी: शिएटिक के कुचलने से पहले ही रक्तवाहिका संदंश के निचले जबड़े पर नियुक्ति (2.5 ऊपर कदम). अलग fascicles में चिह्नित कर रहे हैं प्रदर्शित करने के लिए कि वे आसन्न क्षैतिज हैं, लेकिन नहीं खड़ी कुचलने के दौरान,. हालांकि तीन fascicles इस चित्र में लेबल कर रहे हैं, एक भी एक चौथा गुच्छा, peroneal का जोड़ शाखा देख सकते हैं. के लिए एक अधिक विस्तृत sciatic तंत्रिका की शाखाओं में बंटी पैटर्न के ड्राइंग संरचनात्मक कुचलने की बात करने के लिए बाहर का fascicles, चूहा, 188 चित्र 17 की ग्रीन एनाटॉमी के लिए उल्लेख कृपया.

चित्रा 2
चित्रा 2. एक कार्बन चिह्नित सीटू और toluidine नीले दाग कुचल sciatic तंत्रिका की अर्द्ध पतली वर्गों में क्रश साइट. बगल में एक क्रश साइट (बाएं पिछले अंग) का एक उदाहरण है. काले कार्बन कुचलने साइट अर्थ. तारांकन tibial तंत्रिका कि जांघ मांसलता innervates और कुचलने सर्जरी के दौरान एक उपयोगी मील का पत्थर के रूप में कार्य करता है की एक शाखा के निशान. sciatic तंत्रिका की पिंडली की हड्डी से सम्बन्धित विभाजन नीले, हरे रंग में peroneal में उल्लिखित है, और पीला बी. अर्ध पतली वर्गों में पिडली का hemostatic बल के साथ एक पूर्ण प्रदर्शन को कुचलने का प्रदर्शनपी एस सी अर्ध पतली एक अधूरा angled संदंश के साथ प्रदर्शन को कुचलने के प्रदर्शन वर्गों. दोनों छवियों में degenerating माइलिन प्रोफाइल तीर के साथ में चिह्नित कर रहे हैं. पैनल में सी तीर संरक्षित माइलिन प्रोफाइल के उदाहरण और बख्शा axons की एक क्लस्टर के निशान. स्केल बार 10 माइक्रोन है.

चित्रा 3
चित्रा 3 साबुत माउंट मांसपेशी योजनाबद्ध और प्रतिनिधि NMJs के एसी. Edl का, (ए) (बी) peroneus longus, और soleus (सी) के पिछले अंग से हटाने के बाद मांसपेशियों का गाया छवियों. दिखाया स्नायु सही हिंद अंग से कर रहे हैं. घुटने और टखने संरचनात्मक अभिविन्यास भी संदर्भ के लिए शामिल हैं. की tendons सफेद रंग रहे हैं और एक ठोस काला लाइन में उल्लिखित जब पेशी के शीर्ष पर तैनात है. वे एक काला धराशायी लाइन में रेखांकित कर रहे हैं जब वे पेशी के नीचे का विस्तार है. कटौती लाल डैश्ड पंक्तियों में दिखाया जाता है.मांसपेशी कटौती साइटों, के रूप में नीले तीर द्वारा संकेत से दूर खुली है, और बाद में पतला. Thinning के बाद, मांसपेशियों पिन से टिकी, tendons की बनी हुई है चारों ओर काटने से अलग है लोमो. गाया छवियों संयोजी ऊतक और thinning के बाद हटाने के बाद पूरे आरोह मांसपेशियों से. endplate बैंड प्रत्येक पेशी पर रेखांकित कर रहे हैं: जी एच. soleus sciatic तंत्रिका (D) फिर से innervated और किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना (एच) neuromuscular जंक्शनों प्रदर्शन को कुचलने के बाद चौदह दिन पूरे माउंट मांसपेशी. इन पैनलों में, NMJs, axons है, और श्वान कोशिकाओं के रूप में कल्पना की जाती है 5.5.1 खंड में ऊपर वर्णित है. Acetylcholine रिसेप्टर्स लाल कर रहे हैं, axons हरे, और नीले श्वान सेल प्रक्रियाओं. में पैनल जी, तीर NMJ के क्षेत्रों में किया गया है कि फिर से एक अक्षतंतु द्वारा innervated संकेत मिलता है. पैनल में एच तीर गैप 43 सकारात्मक श्वान सेल प्रक्रियाओं से संकेत मिलता है. नोट axons की अनुपस्थिति. स्केल बार 10 माइक्रोन है.

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Discussion

हम एक के कुचलने साइट का सटीक अंकन के साथ मज़बूती से पूरा sciatic तंत्रिका कुचलने प्राप्त विधि प्रस्तुत किया है. जैसा कि पहले उल्लेख किया है, sciatic तंत्रिका कुचलने चूहों और चूहों में परिधीय तंत्रिका चोट का एक आम मॉडल है. हालांकि कुचलने के प्रत्येक विधि अपने फायदे और नुकसान है, हमने पाया कि इस विधि का एक पूरा क्रश है कि आसानी से विशेष उपकरण (जैसे विशेष clamps, आदि) की एक न्यूनतम के साथ चिह्नित किया गया था का उत्पादन किया.

क्रश तरीके

सबसे आम माउस sciatic तंत्रिका को कुचलने के लिए इस्तेमाल साधन नहीं 5 angled संदंश है. हालांकि यह संभव है इस पद्धति का उपयोग करने के लिए एक पूरी कुचलने प्राप्त है, हमने पाया है कि इस उपकरण विशेष रूप से एक नया उपयोगकर्ता के हाथों में एक चर को कुचलने (बहुत कम बल छोड़ने बख्शा या axons भी महान तंत्रिका फाड़), का उत्पादन किया.

अन्य कम आम तरीकों को कुचलने का उत्पादन किया धमनीविस्फार छोटे क्लिप, तरल नाइट्रोजन में ठंडा संदंश, और specially, calibrated, गैर दाँतेदार clamps के 9,12,5,7 निर्मित. इन उपकरणों के प्रत्येक मज़बूती से एक पूरी तरह से कुचलने का उत्पादन कर सकते हैं. हम रक्तवाहिका संदंश चुना है क्योंकि साधन प्राप्त करने के लिए आसान है, एक विश्वसनीय कुचलने का उत्पादन, और क्रश साइट का स्पष्ट अंकन के लिए अनुमति देता है. रक्तवाहिका संदंश का एक दोष यह है कि हम आसानी से कुचलने के दौरान उत्पादित बल उपाय नहीं कर सकते. हालांकि, एक बार परीक्षण, रक्तवाहिका संदंश मज़बूती से एक पूरी तरह से कुचलने का उत्पादन होगा, और आसानी से एक समान संदंश द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है अगर संदंश क्षतिग्रस्त हो जाते हैं.

कोई बात नहीं एक क्रश प्रदर्शन, शायद कुचलने प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा तंत्रिका कुचलने की संपूर्णता को सत्यापित करने के लिए चुना विधि है. यह एक उपन्यास उपयोगकर्ता के हाथों में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. तंत्रिका चोट साइट (चित्रा 2) बाहर की अर्ध - पतली विश्लेषण ऐसा करने के लिए एक सीधा तरीका प्रदान करता है और एक पूरा क्रश (चित्रा 2, पैनल बी) या एक अधूरी क्रश (चित्रा 2, पैनल सी) प्रकट कर सकते हैं.

18 durations. हालांकि, अब कुचलने बार या कुचल कि काफी नीचा श्वान सेल अन्तर्गर्भाशयकला दर और / या उत्थान की सफलता में बदल जाएगा.

चिह्नित तरीके

क्रश साइट के लिए दो व्यवहार्य तरीकों पाउडर कार्बन से अन्य अंकन sciatic तंत्रिका 13,19 के परितंत्रिकाकला के माध्यम से एक 10-0 सीवन, और FluoSpheres आण्विक जांच, यूजीन, या 1 के द्वारा उत्पादित कर रहे हैं 1 लाइनों में उत्थान में vivo. हमारे प्रयोजनों के लिए हम अतिरिक्त लाभ के साथ आसानी से किया जा रहा बाद अर्द्ध पतली या इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म मूल्यांकन में देखा पर्याप्त और सस्ती कार्बन अंकन मिला. इसके अलावा, हमने पाया है कि कार्बन अंकन कम से कम छह सप्ताह यह अब अवधि प्रयोगों के लिए उपयुक्त बनाने के लिए बनी रहती है.

क्रश के बाद पुनर्जनन का विश्लेषण

एक पूरी जांचपोस्ट को कुचलने के उत्थान के tion के कार्यात्मक, electrophysiologic है, और रूपात्मक आकलन 5,16 जोड़ती है. उत्थान के बाद morphological आकलन शायद सबसे आम हैं. ये आकलन उन है कि विकास की विलंबता, axonal वृद्धि की दर और 16 reinnervation की विशिष्टता का आकलन में अलग किया जा सकता है. इस रिपोर्ट में, हम एक पूरी माउंट मांसपेशी प्रक्रिया है कि जल्दी रूपात्मक उत्थान (चित्रा 3) का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रस्तुत है. इस विश्लेषण में किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना अल्फा bungarotoxin और श्वान सेल गैप-43 के द्वारा लेबल NMJs मात्रा और फिर से innervated जंक्शनों neurofilament, SV2, और अल्फा bungarotoxin द्वारा लेबल के रूप में की तुलना में कर रहे हैं. गैप-43 वितंत्रीभवन के बाद श्वान कोशिकाओं के द्वारा स्पष्ट रूप से upregulated है और अच्छी तरह से neuromuscular 20 जंक्शन पर टर्मिनल श्वान कोशिकाओं किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना पहचान. हालांकि गैप-43 के axons द्वारा व्यक्त की है, neurofilament के सहवर्ती उपयोग श्वान कोशिकाओं से आसानी से गैप-43 सकारात्मक axons अलग पहचानता है. इसके अलावा,क्योंकि मांसपेशी के भीतर गहरे NMJs प्रतिरक्षी (के रूप में छोटे अणु अल्फा bungarotoxin तुलना में) द्वारा आसानी से नहीं लेबल किया जा सकता है श्वान सेल गैप 43 immunoreactivity महत्वपूर्ण बात यह एक neuromuscular जंक्शन के किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना स्थिति की पुष्टि करता है और सटीकता को बेहतर बनाता है जब किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना NMJs गिनती.

यह विधि एक सरल और कुशल एक ही बार में पूरे मांसपेशी endplate बैंड के reinnervation स्थिति का आकलन विधि प्रदान करता है. अन्य (23) तेरा 1 CFP / S100 GFP चूहों का इस्तेमाल किया है कि एक्सप्रेस सियान axons और श्वान कोशिकाओं में GFP sciatic तंत्रिका 2 कुचलने के बाद पूर्वकाल tibialis की फिर से स्फूर्तिदान पालन करने में फ्लोरोसेंट प्रोटीन. एक चेतावनी है, ध्यान दिया जाना चाहिए यद्यपि. इस विधि neurofilament और SV2 के लिए फिर से स्फूर्तिदान यों immunoreactivity पर निर्भर करता है. यह संभव है कि अक्षतंतु परिणाम लेकिन बेरोक SV2 के बाद अभिव्यक्ति 21 में देरी किया जा सकता है किया जा सकता है. इसलिए, कुछ प्रयोगों में यह महत्वपूर्ण हो सकता है कि देरी उत्थान की पुष्टि की और न घमनाया phenotype के लिए SV2 खाता (यानी पूर्व synaptic भेदभाव) की अभिव्यक्ति को presynaptic elayed.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम में एनआईएच K08NS065157 (TAF के लिए) इसके अलावा अनुदान द्वारा समर्थित किया गया, musculoskeletal विकारों के लिए पेन केंद्र, गठिया के राष्ट्रीय संस्थान से पुरस्कार संख्या P30AR050950, Musculoskeletal और त्वचा रोग (TAF और स्टीवन एस Scherer) के इस काम का समर्थन किया. अंत में, श्राइनर्स बाल चिकित्सा अनुसंधान केंद्र बीज धन (TAF) इस काम का समर्थन किया. हम शुरू में उसकी सहायता के लिए चित्रा 1 के नमूने के उत्पादन में पूरे माउंट प्रक्रिया और एमी ए किम प्रदर्शन के लिए डॉ. युवा जिन बेटा स्वीकार करना होगा.

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