Une unité fonctionnelle du moteur dans la boîte de culture: La co-culture d'explants de la moelle épinière et les cellules musculaires

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Neuroscience

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Summary

Les cellules musculaires en culture sont un modèle inadéquat de récapituler les muscles innervés

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Arnold, A. S., Christe, M., Handschin, C. A Functional Motor Unit in the Culture Dish: Co-culture of Spinal Cord Explants and Muscle Cells. J. Vis. Exp. (62), e3616, doi:10.3791/3616 (2012).

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Abstract

Homme cellules musculaires primaires en culture en monocouche aneurally rarement contrat spontanément en raison, en l'absence d'une composante du nerf, la différenciation cellulaire est limitée et la stimulation des neurones moteurs est une manquante. Ces limitations entravent l'étude in vitro de nombreuses maladies neuromusculaires dans les cellules musculaires en culture. Surtout, les contraintes expérimentales de monocouches, les cellules musculaires en culture peuvent être surmontés par l'innervation fonctionnelle des fibres musculaires avec des explants de moelle épinière dans les co-cultures.

Ici, nous montrons les différentes étapes nécessaires à la réalisation efficace, innervation correcte de l'homme des cellules musculaires primaires, menant à une contraction de la différenciation et la fibre selon la méthode développée par Askanas 2. Pour ce faire, les cellules musculaires sont co-cultivées avec des explants de moelle épinière d'embryons de rat chez ED 13,5, avec les ganglions de la racine dorsale encore attaché aux tranches de la moelle épinière. Après quelques jours, le muscle fibres de commencer à contrat et devenir contre-striée par innervation par neurites fonctionnels saillie à partir des explants de moelle épinière qui se connectent à des cellules musculaires. Cette structure peut être maintenue pendant de nombreux mois, tout simplement par un échange régulier du milieu de culture.

Les applications de cet outil précieux sont nombreux, car il représente un modèle fonctionnel pour des analyses multidisciplinaires de développement musculaire humaine et l'innervation. En fait, un complet de novo d'installation de la jonction neuromusculaire se produit dans une boîte de culture, ce qui permet une mesure facile de nombreux paramètres à chaque étape, dans un contexte fondamental et physiologique.

Pour ne citer que quelques exemples, génomique et / ou des études protéomiques peuvent être effectuées directement sur les co-cultures. En outre, les effets pré-et post-synaptique peut être évalué précisément et séparément à la jonction neuromusculaire, parce que les deux composants proviennent d'espèces différentes,rat et l'homme, respectivement. Le nerf-muscle de co-culture peut également être effectuée avec des cellules musculaires humaines isolées chez des patients souffrant de maladies neuromusculaires du muscle ou 3, et peut donc être utilisé comme un outil de dépistage pour les médicaments candidats. Enfin, aucun équipement spécial, mais un habitué BSL2 installation est nécessaire pour reproduire une unité motrice fonctionnelle dans une boîte de culture. Cette méthode est donc précieuse tant pour le muscle ainsi que les communautés de recherche neuromusculaire pour des études physiologiques et mécaniste de la fonction neuromusculaire, dans un contexte normal et la maladie.

Protocol

1. Préparation de la culture primaire de cellules musculaires humaines

  1. Mettre en place des cultures de cellules musculaires humaines, selon la technique explantation-re-explantation 4. Tout d'abord, éliminer les obstacles non-tissu musculaire à partir des biopsies. Puis, incorporer 1 mm explants musculaires 3 dans un caillot de plasma, ce qui permet de sortir de fibroblastes des explants.
  2. Les explants incorporés sont transférées sur un plat de plasma gélatine revêtue et laisser croître dans un milieu de croissance normale (MEM supplémenté avec 25% support 199, 10% de sérum bovin foetal [FBS], 1% de pénicilline / streptomycine, 10 pg / ml d'insuline, 10 ng / ml de facteur de croissance épidermique humain [EGF], 12,5 ng / ml de facteur humain de croissance des fibroblastes [FGF]) dans une monocouche. Les cellules qui émergent à partir des explants dans ces conditions sont des cellules musculaires. Ces cellules vont continuer à croître dans une monocouche après le retrait des explants.
  3. Culture des cellules aneurally sur 0,1% de gélatine recouvertes de plaques en milieu de croissance normal. Les cellules peuvent êtreaneurally cultivées et amplifiées selon les besoins. Il est préférable d'utiliser des cellules musculaires à un passage entre 3 et 8 pour effectuer les co-cultures. Il est essentiel pour innerver myotubes jeunes, après ce point, les co-cultures ont un risque élevé d'échec. En outre, les myotubes ne devrait pas être trop grand et trop épais.
  4. Deux jours avant l'innervation est prévu, plaque les cellules musculaires sur 35 mm boîtes de culture tissulaire (ou plaques à 6 puits) à une densité de 500.000 cellules par boîte de milieu de croissance normal. A cette densité, les cellules sont à confluence du bon de commencer la fusion, le lendemain, et l'innervation ultérieure le jour d'après. En utilisant ces conditions, les myotubes sont à la bonne étape pour l'innervation optimale et donc la contraction des fibres ultérieure.
  5. Le jour suivant, remplacer le milieu de croissance normale avec un milieu de fusion composée d'MEM supplémenté avec 25% support 199, 5% de FBS, 10 pg / ml d'insuline et de 1% de pénicilline / streptomycine.

2. Isolati sur des explants embryonnaires de rat de la moelle épinière

Toute la procédure d'isoler les explants de moelle épinière est effectuée sous une loupe binoculaire, dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS, Gibco / Invitrogen ref 14170) contenant 10% de sérum de veau fœtal (FBS).

  1. Il est crucial que les embryons de rat sont entre ED 13 et 14, un stade de développement différent mettrait en péril l'ensemble de la procédure. Sacrifiez une femme enceinte avec du CO 2 et de recueillir la chaîne embryon entier dans un milieu HBSS. Isoler chaque embryon et les décapiter pour l'euthanasie.
  2. Disséquer le cordon médullaire embryon à partir du reste du corps d'une seule pièce et enlever de muscle entourant et du tissu conjonctif. Soyez très prudent de garder les ganglions de racine dorsale (DRG) rattachés à la moelle épinière afin d'assurer l'innervation fonctionnelle.
  3. Couper chaque moelle épinière transversalement de manière que chaque explant contient au moins deux DRG attaché (explants de 1 mm 3).
ove_title "> 3. Innervation des cellules musculaires humaines avec des explants embryonnaires de rat de la moelle épinière

  1. Retirer le milieu de fusion de la culture des cellules musculaires, en laissant une fine couche de support sur la monocouche.
  2. Placez les explants attentivement sur la couche de cellules musculaires, cinq explants régulièrement espacés par boîte de 35 mm.
  3. Ajouter très lentement, goutte à goutte milieu de fusion, sur chaque explant. Il est nécessaire d'ajouter moyenne pour les cellules musculaires pour survivre, mais pas trop afin de permettre aux explants d'adhérer d'abord et prendre contact avec les cellules. Si le milieu n'est pas ajouté correctement (trop fort ou trop moyennes), les explants va flotter et ne parviendra pas à innerver les cellules musculaires.
  4. Une fois que les explants de commencer à respecter, le haut le milieu de fusion à 2 ml par boîte de 35 mm, et mis les petits plats très soigneusement de nouveau dans l'incubateur.

4. Entretien des hétérologues nerf-muscle co-cultures

  1. Changer le milieu de fusion deux fois par semaine.
_title "> Résultats représentatifs 5.

Dès que deux jours après l'innervation, il est possible de voir les neurites émanant de chaque explant et établir des contacts avec les cellules musculaires, représentés par les structures sur le bouton-like (figure 1).

Dès 4-6 jours après l'innervation, quelques fibres individuelles va commencer à se contracter.

Les contractions persistent pendant plusieurs mois, maintenu en changeant simplement le milieu de culture deux fois par semaine.

Après environ 2 semaines, l'explant la moelle épinière se dégénère, mais l'innervation est conservée. Ceci est normal. Une fine couche de composant nerf reste à la surface de la couche de cellules musculaires. Ce réseau nerveux est suffisante pour maintenir la fonctionnalité de l'unité motrice.

Si les explants flottent dans le milieu de la journée après l'innervation, ils ne seront jamais respecter. Cela se produit lorsque la couche de cellules musculaires estpas suffisamment confluentes, ou lorsque le milieu est ajouté trop rudement. Parfois, les explants adhère, mais pas de neurites vont émerger. Cela est probablement dû à l'absence de GHM qui s'y rattachent. Dans ce cas aussi, l'innervation ne sera pas établie. Manipuler les plats très attentivement la première semaine, comme les explants peuvent encore se détachent facilement. Pour échanger les médias de fusion, ajoutez le liquide goutte à goutte avec une vitesse minimale pour éviter le détachement des cellules.

Figure 1
Figure 1. Moelle épinière explants-cellules musculaires des co-cultures à partir du jour 1 au jour 15.

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Discussion

Un outil physiologique in vitro pour étudier la fonction des cellules musculaires dans le contexte normal et pathologique est du plus haut intérêt pour les myologues, parce que les cultures de cellules musculaires ne sont généralement pas récapituler l'importance de plusieurs cellules et des cellules de type de connexions. L'ajout de purifier les neurones moteurs dans les cellules musculaires ne suffit pas pour parvenir à une unité motrice fonctionnelle puisque la présence de cellules de Schwann est nécessaire pour l'innervation pour être efficace 5 et il n'est pas topologiquement (3D + distribution spéciale) pertinente Le protocole décrit ici a été utilisée avec succès pour mettre en place des cellules musculaires innervés in vitro et les résultats dans une maturation complète NMJ qui peuvent être facilement évalués.

Les modèles murins sont maintenant disponibles pour de nombreuses maladies neuromusculaires. Malheureusement, bon nombre de ces modèles sont limités en termes de traduction de la maladie chez des patients humains, par exemple les modèles de souris pour l'amyotrophie spinale, Duchennedystrophie musculaire ou la sclérose latérale amyotrophique. L'amyotrophie spinale est causée par une mutation dans le gène SMN1, qui peuvent en partie être atténuées par la présence d'un gène SMN secondes dans le génome humain 6. En revanche, le génome des souris ne contient qu'un seul gène de SMN, et sa suppression est embryonnaire létale 7. Ainsi, afin de développer des modèles de souris épinière atrophie musculaires, un être humain SMN2 copie a été introduit artificiellement dans les souris knock-out SMN 8,9. Ces animaux représentent toujours le plus proche modèle génétique pour la pathologie humaine, mais le phénotype observé chez les souris est due à l'expression d'un gène SMN2 que les souris normalement n'expriment pas 10. Dans le cas de la dystrophie musculaire de Duchenne, les souris mdx ont un gène de la dystrophine muté similaire à des patients humains, mais le résultat est beaucoup moins sévère par rapport aux symptômes observés chez les patients 11. Le modèle de souris le plus largement utilisé pour amyotrophic la sclérose latérale, les souris SOD1, autant déçu par un aperçu révélateur de la mécanismes de la maladie et les approches thérapeutiques 12,13. Par conséquent, la moelle épinière des explants-cellules musculaires des co-cultures pour étudier la fonction, les caractéristiques génomiques et protéomiques du muscle provenant de patients, dans un cadre tout à fait physiologique, représentent un outil précieux pour étudier ces maladies complexes. En outre, ce modèle hétéro-espèces contribue à la discrimination entre les neurogènes et myogènes mécanismes pathologiques. 3,14,15

La co-culture présentée ici a également certaines limites. Par exemple, des expériences d'immunohistochimie sur les cellules musculaires sont difficiles à réaliser sur cette structure, parce que la terminaison nerveuse incarnée par l'explant couvre l'appareil JNM postsynaptique. Ce système peut également être utilisé pour évaluer les effets neurotrophiques ou myotonique de médicaments dans un système de culture intégrée et relativement mature, mais il ne permet pas de haut-débitde dépistage, comme le volume serait beaucoup trop grand. Curieusement, l'homologue du nerf-muscle co-culture avec à la fois le nerf et les composants musculaires provenant uniquement de la souris ou rat n'est pas fonctionnel et ne parvient pas à entraîner des contractions musculaires. Récemment, toutefois, homologue innervation entre les cellules de souris satellites du muscle et des explants de moelle épinière de souris a été réalisée avec succès par la modification de la date de la récolte d'embryons (Callizot, Steinschneider et ses collègues, résultats non publiés). De nouveaux progrès dans l'établissement de protocoles de routine pour homologue des co-cultures pourrait contribuer à surmonter la limitation des espèces qui existe pour cette technique aujourd'hui.

Malgré ces limites, que nous décrivons ici une méthode qui permet l'étude de nombreux aspects de muscle et de la physiologie du neurone moteur; une technique qui n'est pas difficile à réaliser, ne nécessite aucun matériel spécial et que les résultats dans la moelle épinière stable explants-musculaire co- cultures qui peuvent facilement être entretenus et Studied pendant de nombreux mois.

Certains aspects du protocole sont d'une importance particulière et ont besoin de soins spéciaux afin d'assurer une innervation correcte. Tout d'abord, les embryons de rat doivent être entre 13 et 14 ED de l'âge. Deuxièmement, 500.000 cellules par 35 mm plat assure le bon niveau de la confluence des cellules pour faciliter l'adhésion des explants qui sont ajoutés aux cellules musculaires immédiatement lorsque la fusion cellulaire commence. Enfin, comme l'a souligné dans le protocole, l'ajout du support après le dépôt des explants sur les cellules musculaires est la partie la plus difficile de cette procédure et doit être effectuée avec un soin extrême.

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Disclosures

Nous n'avons rien à communiquer.

Acknowledgments

Notre travail est soutenu par le Fonds national suisse (FNS), l'initiative suisse en biologie des systèmes (SystemsX.ch), la Muscular Dystrophy Association aux Etats-Unis (MDA), l'Association française Contre les Myopathies (AFM), le Royaume-mitochondrial Disease Foundation (UMDF), la Fondation Gebert Rüf-Programme des maladies rares (GRF), la Société suisse pour la recherche des maladies musculaires (SSEM / FSRMM), le Swiss Life "Jubiläumsstiftung für Forschung Volksgesundheit und medizinische", la Roche Research Foundation et l'Université de Bâle.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS GIBCO, by Life Technologies 14170
MEM GIBCO, by Life Technologies 31095
Medium 199 GIBCO, by Life Technologies 31153
Fetal Bovine Serum Fetal Clone Perbio SH30066.03
Insuline Sigma-Aldrich I9278
Human EGF Sigma-Aldrich E9644
Human FGF Sigma-Aldrich F0291
Penicillin/streptomycin solution GIBCO, by Life Technologies 15140

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References

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Comments

1 Comment

  1. Hello,
    I was curious as to why it is necessary for the embryos to be E13-E14. Is this because at this stage in development the DRG are still visibly attached to the spinal cord? If this is the case, could E15 embryos be utilized, since they also display such characteristics? Why is it so essential to use only E13-E14 embryos?
    Thank you

    Reply
    Posted by: Arjun R.
    June 27, 2013 - 3:23 PM

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