La producción de microarrays de tejidos, las técnicas de inmunohistoquímica y la digitalización En el Human Protein Atlas

Biology
 

Summary

Microarrays de tejidos permite un método eficaz para obtener información simultánea de una multitud de tejidos. Piezas representativas de los tejidos se integran en un único bloque de parafina. Las secciones del bloque se utilizan para inmunohistoquímica y el análisis de patrones de expresión de proteínas. Exploración digital genera imágenes correspondientes para la distribución de datos.

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Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjöstedt, E., Pontén, F. Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas. J. Vis. Exp. (63), e3620, doi:10.3791/3620 (2012).

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Abstract

El microarray tisular (TMA) proporciona los medios de alto rendimiento para el análisis de múltiples tejidos y células. La técnica se utiliza en el proyecto Human Protein Atlas para el análisis global de los patrones de expresión de proteínas en tejidos humanos normales, el cáncer y líneas celulares. Aquí se presenta el conjunto de núcleos de 1 mm, recuperado de los tejidos al microscopio representativos seleccionados, en un único destinatario bloque de TMA. El número y tamaño de los núcleos en un bloque de TMA puede variar desde aproximadamente cuarenta 2 núcleos mm a cientos de 0,6 mm núcleos. La ventaja de utilizar la tecnología TMA es que gran cantidad de datos rápidamente se puede obtener utilizando un protocolo de inmunotinción único para evitar la variabilidad experimental. Es importante destacar que sólo cantidad limitada de tejido escaso es necesario, lo cual permite el análisis de grupos de pacientes grandes 1 2. Aproximadamente 250 secciones consecutivas (4 m de espesor) se puede cortar a partir de un bloque de TMA y utilizado para inmunohistoquímica staining para determinar los patrones específicos de expresión de la proteína por 250 anticuerpos diferentes. En el proyecto Human Protein Atlas, los anticuerpos se generan hacia todas las proteínas humanas y se utiliza para adquirir los perfiles correspondientes proteínas en tejidos humanos normales a partir de 144 individuos y los tejidos de cáncer en 216 pacientes diferentes, que representan a las 20 formas más comunes de cáncer en humanos. TMA secciones técnicas de inmunohistoquímica manchadas en portaobjetos de vidrio son escaneados para crear imágenes de alta resolución de la cual los patólogos pueden interpretar y anotar el resultado de la inmunohistoquímica. Imágenes junto con los correspondientes datos de anotación a base de la patología se hizo disponible al público para la comunidad investigadora a través del portal de la proteína humana Atlas ( www.proteinatlas.org ) (Figura 1) 3 4. El Atlas de Human Protein proporciona un mapa que muestra la distribución y abundancia relativa de las proteínas en el cuerpo humano. La versión actualsión contiene más de 11 millones de imágenes con los datos de expresión de proteínas para 12.238 proteínas únicas, que corresponden a más del 61% de todas las proteínas codificadas por el genoma humano.

Protocol

1. Cómo preparar los tejidos para la producción de microarrays de tejidos (Animación 1)

  1. Seleccione el material pertinente formol fija parafina incrustado (muestras de tejido o célula), incluyendo la sección de tejido correspondiente hematoxilina manchado.
  2. Marcar área correspondiente de la sección de tejido. Se recomienda tener un recién cortado la sección teñida con hematoxilina correspondiente al bloque de parafina.
  3. Diseño de la plantilla que se utiliza para la producción de TMA. Selección aleatoria de las muestras dentro de la plantilla para evitar los artefactos causados ​​por problemas técnicos, como la cobertura de los anticuerpos en toda la sección TMA y los problemas de seccionamiento. Agregar marcadores adicionales de orientación a la plantilla para la orientación.
  4. Organizar los tejidos de acuerdo a la plantilla.

2. Tejido Manual de Producción de microarrays (esencial para la filmación)

  1. Para poder obtener una longitud normalizada de los núcleos de tejido, marcar el estilete por ejemplo 4,5 mm (Figura 2). Guidelines de distancia entre ejes de la muestra:
    tamaño del núcleo de 0,6 mm - 0,8-1,0 mm
    centrales de tamaño 1.0 mm - 1,8-2,0 mm
    tamaño del núcleo de 1,5 mm - 2,0-3,0 mm
    núcleo de tamaño de 2,0 mm - 2,5-4,0 mm
    Se recomienda dejar 2,5-3,0 márgenes mm en cada lado del bloque de parafina para evitar el agrietamiento de la parafina.
    1. Montar los golpes seleccionados para ser utilizados. Comience por aflojar los tornillos de cabeza hueca hexagonal que sostiene el golpe en su lugar. El punzón está en posición correcta cuando la ranura en el centro punzón está firmemente colocado contra la barra de metal en el plástico de v-bloque. Fijar los tornillos y asegurarse de que el borde del clip metálico es horizontal.
    2. El golpe receptor (marcado en verde y rojo, específica para el distribuidor) debe ser colocado a la izquierda. El punzón donante (marcado en verde y azul, específico para el distribuidor), que tiene un diámetro ligeramente mayor, se debe colocar a la derecha (figura 3).
    1. Mueva los golpes a lo largo de los x-e y los ejes mediante el uso de los botones de ajuste XY. La perilla de ajuste de la derecha mueve los golpes a lo largo del eje X y el botón de ajuste de la izquierda se mueve los golpes a lo largo del eje.
      Hay una lectura micrómetro digital en ambos mandos de ajuste. Estos se activan cuando se mueve los mandos.
    2. Restablecer → pulse el botón ZERO / ABS.
      Cambio entre pulgadas y mm → pulse el botón IN / mm botón.
      El espacio entre los agujeros deben ser de 2,0 mm (medida entre los centros de los agujeros) cuando se utiliza un punzón 1 mm para una plantilla de 9x8.
    1. Para asegurarse de que no insista en el golpe demasiado abajo en el bloque, llegando a la bandeja y la destrucción de la perforadora, poner un casete sin la parafina en el soporte y fijar la posición de fondo del recipiente golpe a 1 mm por encima de la parte inferior de la bandeja mediante el tornillo de tope de profundidad en elesquina superior izquierda de la Z-guía (Figura 3).
    2. Coloque el bloque receptor en el soporte y utilizar la menor destornillador para apretar los tornillos. No apriete los tornillos demasiado apretada o la parafina podría liberarse de la cinta.
    3. Empuje el golpe receptor hacia abajo aproximadamente 5 mm en el bloque receptor y usar el mango en el golpe para hacer girar el punzón de ida y vuelta una vez (Figura 3). El agujero será de 5 mm de profundidad al empujar el punzón tan abajo en el bloque como sea posible.
    4. Aliviar la presión hacia abajo empuja lentamente, de modo que los resortes se puede mover el punzón hacia arriba. Utilice el estilete para vaciar el punzón y sacarles las semillas de parafina.
  2. Mover la torreta para cambiar a la donante punzón (Figura 3).
  3. Coloque el puente bloque donante con el bloque de donantes sobre el soporte del bloque receptor (Figura 3).
    1. Empuje la punción de los donantesh en el área seleccionada del bloque donante. Utilizar una correspondiente hematoxilina y eosina diapositiva manchado donde ha sido la región de interés marcado para localizar el tejido que es objeto de muestreo. Manual de mantener el bloque de los donantes en la posición con la mano izquierda y empuje el golpe con la mano derecha. Tenga en cuenta que no debe presionar sobre el estilete. El tope de profundidad no bloquea el movimiento de golpe en la posición adecuada para el bloque de los donantes, por lo que es importante que dejas de empujar cuando la segunda marca es visible en el estilete.
    2. Gire el mango en el golpe una vez (Figura 3). Suelte lentamente la presión a la baja, mientras que mantiene el bloque de los donantes en el puente de bloqueo de los donantes.
    3. El tejido del donante está preferiblemente perforada 0,5 mm más corta que el núcleo receptor. Este proceso se asegurará una alineación ajustable de los núcleos en la superficie del bloque receptor, evitando la pérdida de tejido representante valioso.
  4. Quitar el puente y el bloque de donantes. Hacerasegurarse de que el donante punzón está alineado con el agujero que se hizo anteriormente (punto 4). Debe ajustar la posición de perforación utilizando los tornillos de fijación si el golpe de los donantes y el agujero en el bloque receptor no están alineados.
  5. Cuidado empuje el punzón hacia abajo hasta que su punta alcanza la parte superior del agujero en el bloque receptor. Mientras se mantiene esta posición, utiliza el estilete para vaciar el núcleo de tejido en el agujero. La superficie del núcleo debe estar en alineación con la superficie del bloque.
  6. Vuelva a colocar el revólver con el punzón destinatario.
  7. Mover a la siguiente posición con los botones de ajuste XY.
  8. Repetir desde el punto 4c anteriores hasta que la matriz es completa.
  9. Cuando el bloque receptor de que se complete, afloje los tornillos en el soporte del bloque receptor. Hornee el bloque de 42 ° C durante 40 minutos. Colocar el bloque con el área de seccionamiento hacia abajo sobre un portaobjetos de vidrio. Colocar la placa de vidrio con el bloque en la parte superior de un soporte para tubos de ensayo (o de construcción adecuado) y el lugar en tél horno. Después de la cocción, quitar el soporte del tubo de ensayo del horno y aplanar la superficie del bloque por acariciando suavemente el portaobjetos de vidrio.
  10. Coloque el bloque con la placa de vidrio sobre una placa de enfriamiento durante 10 minutos.
    Para asegurar el tejido representante de todo el TMA un control de calidad en cada sección de 50 º se lleva a cabo.

3. Cómo TMA Sección (Animación 2)

  1. Cortar 4 micras de grosor, con un microtomo con el sistema de transferencia de la sección (SM 355S, Microm). El sistema puede ser utilizado con todos los microtomos rotativos de corriente. El sistema consta de un soporte de cuchilla con puente de transferencia integrado, un baño de agua caliente y una unidad de control. De la hoja de las secciones se deslizan sobre la superficie de transferencia húmedo a través de un puente de transferencia en el baño de agua.
  2. Las secciones se deben tomar de un baño de agua inmediatamente después de haber tendido, para evitar la fusión de los puntos sensibles del tejido (tejidos ej. ricas en lípidos como el pecho y el cerebro). Place la sección sobre un portaobjetos de vidrio SuperFrost. El tiempo de las secciones puede ser dejado en el agua depende del tipo de parafina encerado utilizado y la temperatura del agua. Nuestro uso de laboratorio de cera de parafina de HistoLab Products AB, que tienen un punto de fusión de 56-58 ° C y se recomienda una temperatura de baño de agua de 37-39 ° C.
  3. Colocar los portaobjetos en un soporte de diapositivas para el secado de la temperatura ambiente (TA) durante la noche.
  4. Los portaobjetos se cuecen en 50 ° C durante 12-24 horas. El uso de un micrótomo STS, sin que usted tenga para el transporte de la sección de la hoja de un baño de agua de forma manual, por ejemplo usando un pincel.

4. Prueba y Procedimiento de valoración de inmunohistoquímica (Animación 3)

Cada anticuerpo se somete a un procedimiento de ensayo normalizado utilizando especialmente diseñados TMA que contienen una mezcla de tejidos y diferentes tipos de células. El objetivo es evaluar un protocolo de inmunotinción individual y optimizado para cada anticuerpo. Inicialmente una dilución, basado en hormigaconcentración ibody de stock del anticuerpo primario se ensaya. El resultado de esta prueba de tinción se utiliza para guiar a otras diluciones y la optimización del protocolo.

  1. Desparafinización y la hidratación en etanol y xileno clasificado al agua destilada, se llevan a cabo antes de la inmunotinción.
  2. Un paso de bloqueo para saciar peroxidasa endógena se realiza en 0,3% de H 2 O 2 en etanol al 95% durante 5 minutos.
  3. El calor inducido Epítope (HIER) se lleva a cabo en un tampón de pH 6 recuperación, utilizando una caldera de presión (cámara de destape, Biocare Médica) como fuente de calor durante 4 minutos a 125 ° C. Después de completado de ebullición, las diapositivas permanecen en la caldera de presión y se deja enfriar a 90 ° C. El tiempo total de procesamiento para HIER es de aproximadamente 45 minutos.
  4. Si no hay ningún resultado concluyente se obtiene en la prueba inicial, las pruebas que se realicen más basado en el patrón de tinción observado 5 6. Un estudio piloto, dentro de la HPA de alto rendimiento de la configuración, mostróque la recuperación de antígenos más útil donde HIER pH 6, pero otros métodos de recuperación, tales como la pre-incubación con proteinasa, microondas y ebullición en tampón con un pH superior o inferior puede por supuesto ser utilizado. Al cambiar la condición de IHC, por ejemplo cambio de los tiempos de incubación de anticuerpos, los anticuerpos y diluciones diaminobencidina (DAB) los tiempos de incubación el patrón de tinción puede dar resultados más concluyentes.

5. Programa de tinción, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific)

Todas las incubaciones se realizan a temperatura ambiente y este protocolo también se puede utilizar en una configuración manual con los mismos reactivos.

  1. Enjuague con tampón de lavado.
  2. La incubación con Ultra bloque V durante 5 minutos.
  3. Enjuague con tampón de lavado.
  4. La incubación con el anticuerpo primario durante 30 minutos.
  5. Enjuague con tampón de lavado (x2).
  6. La incubación con peroxidasa de rábano picante etiquetada-polímero durante 30 minutos.
  7. Enjuague con tampón de lavado (x2).
  8. El desarrollo en la solución de DABdurante 10 minutos.
  9. Enjuague con tampón de lavado (x2).
  10. Contratinción de hematoxilina de Mayers 5 minutos *. Cuando se utiliza un método de tinción progresiva (por ejemplo, hematoxilina Mayers) la intensidad depende del tiempo y no hay diferenciación es necesaria. Una tinción regresiva por ejemplo, método hematoxilina de Harris requiere la diferenciación para eliminar el exceso de tinte de los tejidos con el fin de acentuar una estructura.
  11. * Enjuague con agua del grifo.
  12. Enjuague en agua de carbonato de litio, diluido 1:5 en solución saturada de 1 minuto *.
  13. Enjuague con agua del grifo durante 5 minutos *.
  14. Las diapositivas son deshidratados en etanol clasificado y las diapositivas se coverslipped (PERTEX, Histolab)

Todos los reactivos se aplican a un volumen de 300 l por diapositiva.
* Los pasos 10-14 se realizan en un instrumento histostaining (Autostainer XL, Leica) y cubreobjetos es, además, realizar en un sistema cubreportas (cubreportas automatizada CV5030, Leica).

6. Cómo escanearuna diapositiva

El método de escanear diapositivas depende del escáner digital que se utilizan, este protocolo sólo define cómo escanear una diapositiva con el análisis del sistema automatizado de Aperio XT (Aperio Technologies). En la proteína humana Atlas configuración 20 aumentos para el tejido y 40x para las células se utilizan. Exploración automatizados podrían encontrar problemas de foco debido a la heterogeneidad del tejido y el número de tejidos diferentes incluidos en un TMA.

  1. Limpiar el portaobjetos de vidrio de la suciedad, pegamento y comprobar si las burbujas de aire entre el cubreobjetos y la sección. En caso de que el aire vuelva a montar las burbujas de la diapositiva.
  2. Coloque la diapositiva en un bastidor y coloque el estante en el escáner digital. El tiempo para escanear un TMA a 20x de aumento es de aproximadamente 6 minutos. Un software de Aperio se utiliza para seleccionar el área de interés. La selección del punto de enfoque se realiza automáticamente en el software. Manualmente la selección del área de exploración y los puntos focales es también posible.
  3. Después de la imagen hcomo se ha generado se puede utilizar para la evaluación y la anotación de la tinción IHC. Las imágenes permanecen como un archivo de resultado del experimento y se puede distribuir a sus colegas para los debates y más utilizado para la publicación de los datos. Las imágenes se pueden ver en un software de libre disposición de Aperio.

7. Cómo buscar tu proteína favorita en el Atlas de proteínas humanas

  1. Vaya a www.proteinatlas.org.
  2. Introduzca el nombre de su proteína favorita, Ensembl Identificación, número de UniProt adhesión o la insulina HGNC por ejemplo el nombre.
  3. Ingresar a la página de resumen y desplácese hacia abajo para el tejido normal y el resumen de órganos. El panorama general muestra la expresión de proteínas en el páncreas.
  4. Haga clic en "datos de los tejidos más". Usted entra a los tejidos normales de ver donde se puede ver todos los tejidos incluidos ordenados por órgano.
  5. Haga clic en el páncreas para ver los resultados de IHC 3 anticuerpos dirigidos hacia la misma proteína. Para ver una altagh-resolución de imagen de páncreas clic en la imagen.
  6. Información adicional acerca de la expresión de proteínas en el tejido canceroso, células y otros datos de validación en el Atlas de proteínas humanas se pueden encontrar navegando por la web Human Protein Atlas.

8. Los resultados representativos

Animación 1. ¿Cómo preparar los tejidos para la producción de microarrays de tejidos. Haga clic aquí para ver la Animación 1 .

Animación 2. Cómo TMA sección. Haga clic aquí para ver la animación 2 .

3 Animación. La técnica de inmunohistoquímica se describe. Haga clic aquí para ver la animación 3 .

Figura 1
Figura 1. Esquema general del proceso dentro de la proteína humana Atlas de Uppsala.

Figura 2
Figura 2. Estilete de donantes marcada para la duración estandarizada de los núcleos de tejido, por ejemplo, 4,5 mm.

Figura 3
Figura 3. Microarrayer tejido manual.

Figura 4
Figura 4. Ejemplos de diferente calidad de las TMA producidos. (A) Una. Recta y alineada correctamente TMA con espacio suficiente entre las filas y columnas, así como a la orilla de la parafina (B) Un TMA con algunos de los núcleos demasiado cerca del borde resultante en dificultades probables cuando seccionamiento. (C) Un TMA que han sido horneados para too largo que resulta en una colapsada TMA sin la plantilla correcta.

Figura 5
Figura 5. Hematoxilina y eosina tiñen las TMA. (A) Una sección adecuadamente cortado con columnas rectas y alineados e hileras. Utilizando una cuchilla malo o sucio puede resultar en la división (B) o secciones comprimido (C).

Figura 6
Figura 6. La titulación de anticuerpos. (A) Reacción de las células de los ganglios linfáticos en el centro muestra un anticuerpo de forma óptima valora que resulta en una tinción citoplásmica específica (en marrón) sin fondo. (B) La sección de tejido muestra una tinción débil. Tinción negativa o débil se encuentra cuando la concentración de anticuerpo primario es demasiado baja o si la proteína diana no está presente en los tejidos immunostained. (C) La sección de tejido se overstained debido al uso de una concentración demasiado elevada de anticuerpo primario. El darca resultados de color en las dificultades que determinan la localización subcelular, debido a extenderse, la reactividad cruzada y falsos positivos.

Discussion

La inmunohistoquímica es de lejos la aplicación más utilizada de las TMA. La combinación de IHC y TMA se puede utilizar en varios entornos diferentes, por ejemplo, selección de alto rendimiento de los patrones de expresión de proteínas en los tejidos y las células 7 8 9 10, los estudios de biomarcadores de detección basados ​​en muestras de tejido de grandes cohortes de pacientes 11 12 y más básico de la biología del tumor estudios, incluidos los diferentes fenotipos y genotipos, las etapas de diferenciación, la progresión y metástasis 13. Una ventaja de usar TMA es que el material de grandes cohortes pueden ser analizados en un tiempo, ambos experimentos de ahorro de material biológico valioso y asegurar más reproducibles. Además, el uso de la tecnología TMA ahorra costos de reactivos y tiempo de procesamiento de laboratorio. Como un TMA sólo contiene una cantidad limitada de tejido, tejido heterogeneidad es un problema. Dependiendo del tipo de tejido y preguntas a ser tratadas, varias muestras puede ser necesario de la misma specimen. Para los tejidos tumorales, el uso de dos a cuatro núcleos de cada muestra se recomienda ya que se ha demostrado resultar en un alto grado de precisión en la representación de las secciones de tejido enteros 13 14. Dependiendo de la composición del tejido del diámetro de los troqueles (que van desde 0,6 mm a 2 mm) se puede ajustar. Los tejidos son complejos y se componen de ambos tipos de células de varios diferentes, las estructuras y la matriz extracelular. La composición de cada tipo de tejido diferente del que contiene una cantidad variable de grasa, los vasos sanguíneos, tejido conectivo, cartílagos, etc, pueda afectar la presión necesaria para la perforación y la recolección de núcleos separados. Por consiguiente, es de importancia para la práctica todos los pasos del procedimiento en el material que no es de ningún valor, antes de producir un TMA con tejidos definidos para los experimentos destinados.

Cuando seccionar una variedad de diferentes tejidos dentro de un bloque de TMA la composición del bloque podría influir en la capacidad de adquirir secciones de alta calidad. Certain tejidos, la piel, por ejemplo, la médula ósea, el cerebro de la grasa, y de mama, render la sección del bloque TMA difícil debido a los efectos de las diferencias en la textura que afectan cómo se extienden las secciones en el baño de agua y cómo diferentes durezas es cortado por la cuchilla, etc Por ello se recomienda a los tejidos de grupos con características similares, por ejemplo, el tejido ricas en lípidos en un TMA, en su caso. La mayoría de los tejidos de cáncer son en este sentido homogéneo, que facilita el corte de TMA cancerosas. Un método alternativo de seccionamiento para la estabilización de los núcleos de microarrays se puede emplear al manipular un TMA con tipos heterogéneos de tejidos. El uso de una cinta adhesiva puede ser útil para evitar la pérdida de núcleos y caer en la seccionada TMA. El uso de cinta adhesiva debe ser empleado con precaución, ya que la cinta puede influir en el espesor de los núcleos de sección y, posteriormente, también el resultado de la tinción inmunohistoquímica 15. En el Human Protein Atlas configurar una plantilla de TMA de 9x8 (con exclusión de los marcadores) núcleos arcorreo utilizado. Es de suma importancia para obtener el máximo número de secciones y mantener todos los tejidos representados en todo el bloque. Para guardar los reactivos y el tiempo de barrido, 2 secciones se colocan en un portaobjetos de vidrio que permite una plantilla máxima de 9x8.

El repositorio principal de información de proteína, 16 de Recursos Universal Protein incluye aproximadamente 20.300 entradas crítica de proteínas humanas, de los cuales sólo aproximadamente el 66% tienen evidencia a nivel de proteínas. También para una mayoría de los genes para los cuales existe evidencia de la existencia en el nivel de proteína, existe escasa o ninguna información en función de las proteínas y la distribución de expresión. Un reto importante para el futuro es analizar el patrón de distribución y abundancia relativa de estas proteínas desconocidas en diversos tipos de tejido humano. La información procedente de bases de datos tales como Uniprot, Ensembl, los datos publicados de PubMed se puede utilizar como una guía para establecer si los patrones de tinción inmunohistoquímica utilizando anticuerpos parasalas proteínas desconocidas representan los perfiles reales de proteína de la proteína objetivo previsto. Además, varias estrategias de validación se necesitan otros para asegurar la funcionalidad de anticuerpos, por ejemplo, la funcionalidad de anticuerpos en matrices de la proteína, el Western blot, inmunofluorescencia, inmuno precipitación y tire hacia abajo los experimentos. Tal vez la herramienta más importante para la validación de la funcionalidad de anticuerpo es el uso de anticuerpos pareadas, es decir, dos anticuerpos diferentes producido contra separadas, que no se solapan epítopos sobre la proteína diana mismo, para comparar ensayo específico resultado 17.

Con base en la información recopilada, los anticuerpos se ponen a prueba y se valora de acuerdo a las normas de IHC y la experiencia de probar y validar más de 35.000 los anticuerpos en el proyecto Human Protein Atlas. Durante más de 20% de todos los genes con los perfiles de proteínas, los datos de anticuerpos emparejados (2 o más anticuerpos hacia la no superposición epítopos en la misma proteína) se ha utilizado para determinar la mejor estimación uncompañero del patrón de expresión de la proteína correspondiente. Anticuerpos vinculados proporcionar una estrategia definitiva para la validación de técnicas de inmunohistoquímica específicos basados ​​en los patrones de expresión de la proteína. Esta estrategia es valiosa porque la multitud de diferentes tejidos incluidos en la proyección básica aumenta el riesgo de reactividad cruzada. También debe tenerse en cuenta que ciertos tejidos son en general más propensos a mostrar fondo tinción macrófagos por ejemplo, músculo liso, túbulos distales en el riñón y hepatocitos en el hígado. Otras cuestiones a considerar son las variaciones en las técnicas de procesamiento de tejidos a través del tiempo para los tejidos tomados de material de archivo, que puede dar lugar a falsos negativos o inadecuados patrones positivos de tinción por IHC. Este fenómeno se observa también en el análisis de gran sección. Controles negativos y positivos son vitales y deben ser utilizados siempre que sea posible. Para estudios más profundos, incluyendo los análisis funcionales, líneas celulares con expresión forzada y específica tumbar-de tr correspondientesanscripts (tecnología siRNA) puede ser utilizado para crear los controles. Para obtener resultados óptimos en IHC, es importante para probar y utilizar los sistemas de recuperación de antígeno, ya que la fijación con formalina induce diversas modificaciones químicas, por ejemplo, reticulación, la hidrólisis de bases de Schiff de enmascaramiento del antígeno 18.

En conclusión, basados ​​en anticuerpos proteómica que emplean la tecnología TMA y IHC es una poderosa estrategia para la generación de datos de expresión de proteínas en gran escala. El proyecto Human Protein Atlas se ha establecido para crear un mapa de la expresión de la proteína humana en tejidos humanos normales y cancerosas. El objetivo de este proyecto es presentar un primer borrador de un Atlas de la proteína humana integral para el año 2015. Además de proporcionar los perfiles de proteínas en órganos y tejidos normales, este esfuerzo también proporciona un punto de partida para proyectos de investigación biomédica, incluyendo los esfuerzos de descubrimiento de biomarcadores clínicos. El objetivo final es añadir una capa de información al lado en la parte superior de la secuencia del genoma humano que wiva a ser crucial para una comprensión más profunda de la biología que subyace a varios estados de la enfermedad, y proporcionar una base para el desarrollo de nuevas herramientas diagnósticas y terapéuticas.

Disclosures

No tenemos nada que revelar.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por becas de los Knut y Alice Wallenberg. El personal entero de la proteína humana centros de Atlas en Uppsala, Estocolmo y la India son reconocidos por sus esfuerzos para generar el Atlas de proteínas humanas. Los autores desean agradecer especialmente a Frank Hammar y Gustafsson Sofie para obtener ayuda con las fotos y Karlberg Elene para obtener ayuda con la producción de TMA en los rodajes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wash buffer Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-999-TT
Citrate buffer pH6 Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-250-Pm1X
Antibody diluent Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-UD
UltraVision LP HRP polymer Thermo Fisher Scientific, Inc. TL-125-HL
DAB plus substrate system Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-HDX
Ultra V Block Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-UB
Primary Antibody Enhancer Thermo Fisher Scientific, Inc. TL-125-PB
Mayers hematoxylin Histolab 01820
PERTEX Histolab 00871.0500
Manual tissue micro arrayer Estigen, Beecher Instrument MTA-1
Waterfall microtome Thermo Fisher Scientific, Inc. Microm HM 355S
Automated image scanner Aperio Technologies XT
Automated slide staining system Thermo Fisher Scientific, Inc. Autostainer 480S-2D
Automated slide staining system for deparafinization and dehydration Leica Microsystems Autostainer XL
Automated glass coverslipper Leica Microsystems CV5030
Decloaking chamber Biocare Medical DC2008INTEL

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References

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