İnsan Protein Atlas içinde Doku Mikroarray'ler, İmmünohistokimya Boyama ve Sayısallaştırma Üretimi

Biology
 

Summary

Tuvar dokuların çok sayıda eşzamanlı bilgi elde etmek için etkili bir yöntem sağlar. Dokuların Temsilcisi parçaları tek bir parafin blok içine monte edilir. Bloktan bölümleri proteini ifade kalıpların immünhistokimya ve analiz için kullanılır. Dijital tarama veri dağıtımı için ilgili görüntüler oluşturur.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Kampf, C., Olsson, I., Ryberg, U., Sjöstedt, E., Pontén, F. Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas. J. Vis. Exp. (63), e3620, doi:10.3791/3620 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Doku mikroarray (TMA) teknolojisi, birden fazla doku ve hücrelerin yüksek verimlilik analizi için araçlar sağlar. Normal insan dokularında tekniği, kanser hücresi hatlarında ve protein salgılanma modellerini küresel analizi için insan proteini Atlas proje içinde kullanılmaktadır. Burada tek bir alıcı TMA blok içine mikroskopik olarak seçilmiş temsili dokulardan alınan 1 mm çekirdek montaj, sunuyoruz. Bir TMA blokta çekirdek sayısı ve büyüklüğü 0.6 mm çekirdek yüzlerce yaklaşık kırk 2 mm çekirdeklerinden değiştirilebilir. TMA teknolojisi kullanılarak bir avantajı verilerin bu büyük miktarda hızla deney değişkenliği önlemek için, tek bir immun protokol kullanılarak elde edilebilir. Önemli olarak, nadir doku sadece sınırlı bir miktarda hastaya büyük kusaklardaki analizi 1 2 olanak sağlayan, ihtiyaç duyulmaktadır. Yaklaşık olarak 250 ardışık bölümleri (kalın 4 mikron) bir TMA blok kesilmiş ve immünhistokimyasal staini için kullanılabilir250 farklı antikorları spesifik protein ekspresyonu belirlemek için ng. İnsan Protein Atlas proje içinde, bütün insan antikorları proteinleri doğru oluşturulur ve insan kanser 20 en yaygın formları temsil eden 216, farklı hastalar, 144 bireyler ve kanserli hem de dokulardan Normal insan dokularında karşılık gelen protein profilleri elde etmek için kullanılır. Cam lamlara İmmunohistokimyasal lekeli TMA bölümleri patologlar yorumlamak ve immünhistokimya sonuçlarının açıklama olabilir hangi yüksek çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için taranır. Araya gelen patoloji tabanlı açıklama verilerle Görüntüler İnsan Protein Atlas portalı (aracılığıyla araştırma toplumu için kamuya yapılan www.proteinatlas.org ) (Şekil 1) 3 4. İnsan Protein Atlas insan vücudunda dağıtım ve proteinlerin göreceli bolluk gösteren bir harita sunar. Mevcut verMisyonu ise, insan genomu tarafından kodlanan tüm proteinlerin fazla% 61'e karşılık gelen 12,238 eşsiz protein, protein ifade verileri ile 11 milyon görüntüleri içerir.

Protocol

1. Doku Mikroarray Üretim için dokular nasıl hazırlanır (Animasyon 1)

  1. Karşılık gelen hematoksilen lekeli doku bölümü de dahil olmak üzere ilgili formalin sabit parafin malzeme (doku ya da hücre örnekleri) seçin.
  2. Doku bölümünde ilgili bölümü işaretleyin. Bu parafin blok karşılık gelen bir yeni kesilmiş hematoksilen lekeli bölümü olması tavsiye edilir.
  3. TMA üretimi için kullanılan şablonu tasarlayın. Örneğin, bütün TMA bölümü ve kesit sorunlar üzerinde antikor kapsama gibi teknik sorunlardan kaynaklanan eserler önlemek için şablon içinde örnekleri Rastgele. Yönlendirme için şablonuna ek yönlendirme işaretleri ekleyin.
  4. Şablona göre dokuların düzenleyin.

2. Manuel Doku Mikroarray Üretim (çekim için Temel)

  1. , Doku çekirdek standart bir uzunluk elde stileyi örneğin 4.5 mm (Şekil 2) işaretlemek için edebilmek. GuidelÖrnek merkezleri arasındaki mesafe için ines:
    çekirdek büyüklüğü 0,6 mm - 0.8-1.0 mm
    Çekirdek boyutu 1.0 mm - 1.8-2.0 mm
    çekirdek büyüklüğü 1,5 mm - 2.0-3.0 mm
    Çekirdek boyutu 2.0 mm - 2.5-4.0 mm
    Bu parafin çatlamasını önlemek için parafin blok her iki tarafında 2.5-3.0 mm kenar boşluğu bırakmak önerilir.
    1. Kullanılmak üzere seçilen delgeçler monte edilir. Yerde yumruk tutan altıgen soket vida gevşeterek başlayın. Yumruk hub oluk sıkıca v-blok plastik metal çubuk karşı yerleştirildiğinde yumruk doğru konumlandırılmış. Vidaları ve metal klibin kenarı yatay olduğundan emin olmak.
    2. Alıcı yumruk sola yerleştirilmelidir (yeşil ve kırmızı, distribütör için özel olarak işaretlenmiş). Donör yumruk biraz daha büyük bir çapa sahip olan, (Şekil 3) sağa doğru konulmalıdır (yeşil ve mavi, distribütör için özel olarak işaretlenmiş).
    1. XY ayar dügmesini kullanarak x ve y eksenleri boyunca yumruklar taşıyın. Doğru ayar düğmesi x ekseni boyunca hareket yumruklar ve sol ayar düğmesi y ekseni boyunca yumruklar taşır.
      Ayarlaması kolları hem dijital bir mikrometre okuma vardır. Kolları hareket ettirirken Bu aktive edilir.
    2. Reset → SIFIR / ABS düğmesine basın.
      Inç ve mm arasında Shift → / aa IN düğmesine basın.
      Bir 9x8 şablon için bir 1 mm zımba kullanıldığında delikleri arasındaki boşluk 2.0 mm (delik merkezleri arasındaki ölçülen) olmalıdır.
    1. Kaset vurmak ve yumruk yok, sen blok içine çok aşağı yumruk itmeyin sağlamak için, tutucu içinde parafin olmadan bir kaset koydu ve kaset alt yukarıdaki 1 mm alıcı yumruk alt konumunu ayarlamak az derin stop vidasından kullanılarakZ-kılavuz sol üst köşesinin (Şekil 3).
    2. Tutucu alıcı blok koyun ve vidaları sıkıştırmak için küçük bir tornavida kullanın. Sıkı vidaları sıkıştırın etmeyin ya da parafin kasetinden kurtulacağım olabilir.
    3. Alıcı blok içine aşağı alıcı yumruk yaklaşık 5 mm itin ve (Şekil 3) kez ileri ve geri döndürmek için yumruk yumruk kolu kullanın. Mümkün olduğunca blok içine kadar aşağı yumruk iterken delik 5 mm derinliğinde olacaktır.
    4. Yaylar yumruk yukarı taşımak, böylece yavaş yavaş aşağı doğru iterek basıncını tahliye edin. Yumruk boşaltmak ve parafin çekirdek atmak için stileyi kullanın.
  2. Donör delme (Şekil 3) geçmek için taret taşıyın.
  3. Alıcı blok tutucu üzerinden donör blok (Şekil 3) ile donör blok köprü yerleştirin.
    1. Donör Nokt itindonör bloğun seçilen alana h. Karşılık gelen hematoksilen ve faiz bölgeye örnek olmaktır doku bulmak için imlenmiş eozin slayt kullanın. El sol elinizle pozisyonda donör blok tutun ve sağ elinizle yumruk itin. Eğer Stile üzerinde itmek gerektiğini unutmayın. Derinlik donör blok için uygun konumda yumruk hareketi engellemek değil, bu nedenle ikinci işareti Stile üzerinde görünür olduğunda bastırıyor durdurmak önemlidir.
    2. Bir kez yumruk (Şekil 3) kolu çevirin. Hala donör blok köprü donör blok tutarak yavaşça aşağı doğru basınç bırakın.
    3. Donör doku tercihen alıcı çekirdek daha kısa 0.5 mm delikli edilir. Bu proses değerli temsili doku kaybı kaçınarak, alıcının blok yüzeyinde göbeklerin ayarlanabilir bir uyum sağlar.
  4. Köprü ve donör blok çıkarın. Yapmakdonör yumruk (nokta 4) daha önce yapılmış delik ile uyumlu olduğundan emin olun. Siz donör yumruk ve alıcı blok delik uyumlu değilse ayarlayın vidaları kullanarak yumruk konumunu ayarlamak gerekir.
  5. Ucu alıcı blok deliğin üst ulaşıncaya kadar dikkatlice aşağı yumruk itin. Bu pozisyonda tutarken, deliğe doku çekirdek boşaltmak için stileyi kullanın. Çekirdek yüzeyi blok yüzeyi ile aynı hizada olacaktır.
  6. Alıcı yumruk taret geri hareket ettirin.
  7. XY ayar düğmeleri ile bir sonraki konuma gider.
  8. Dizi tamamlanana kadar yukarıdaki noktası 4c itibaren tekrarlayın.
  9. Tüm alıcı blok bittiğinde alıcı blok tutucu vidayı gevşetin. 40 dakika süreyle 42 ° C blok pişirilir. Cam bir slaytta aşağı bakacak kesit alanı ile blok koyun. Bir test tüpü sahibi (veya uygun başka inşaat) ve t yer üstüne bloğu ile cam slayt yerleştirindiye fırınlayın. Pişirme sonra fırından test tüpü tutucusunu çıkarın ve yavaşça cam slayt okşayarak tarafından blok yüzeyine düzleştirin.
  10. 10 dakika boyunca bir soğutma cam plaka üzerine kayar ile blok yerleştirin.
    TMA boyunca temsilcisi doku sağlamak için her 50. bölümünde bir kalite kontrolü yapılır.

3. Nasıl Bölüm TMAlar (Animasyon 2)

  1. Bölümüne transfer sistemi (HM 355S, Microm) ile bir mikrotom kullanarak 4 mikron kalınlığında kesitler kesin. Sistem tüm döner Mikrotomlar ile birlikte kullanılabilir. Sistemi entegre transferi köprü, ısıtılmış bir su banyosu ve bir kontrol ünitesi ile bir bıçak taşıyıcı oluşur. Bıçaklı bölümlerde su banyosuna bir transfer köprü ile ıslak transfer yüzeyi üzerinde kayar.
  2. Bölümler bunlar hassas doku noktalar (göğüs ve beyin gibi örneğin lipid zengin dokular) erimesi önlemek için, uzattığınız hemen sonra su banyosu alınmalıdır. PlaBir SuperFrost cam slayt üzerine ce bölümü. Bölümler su içinde bırakılabilir zaman parafin tipi kullanılan ve suyun sıcaklığı mumlu bağlıdır. ° C ve 37-39 arasında bir su banyosu sıcaklığında önermektedir ° C'de 56-58 arasında bir erime noktasına sahip HistoLab Products A, bizim laboratuar kullanımı parafin
  3. Gece boyunca oda sıcaklığında (RT) kurutma için bir kayar tutucuya slaytlar yerleştirin.
  4. Slaytlar 12-24 saat süreyle 50 ° C fırınlanır. Eğer bir fırça gibi kullanarak el bıçaklı bir su banyosuna bölümüne taşımak zorunda STS olmadan Mikrotom kullanma.

4. Test ve İmmünohistokimya için Titrasyon Prosedürü (Animasyon 3)

Her bir antikor doku ve farklı hücre tipleri bir karışımını içeren özel olarak tasarlanmış TMAlar kullanılarak standart bir test prosedürü tabi tutulur. Amaç her antikor için bireysel ve optimize immun protokolü değerlendirmektir. Karınca dayalı Başlangıçta bir seyreltme,Primer antikor ibody stok konsantrasyonları test edilir. Bu test boyamanın sonucu protokol daha dilüsyonları ve optimizasyon yönlendirmek için kullanılır.

  1. Damıtılmış su ksilen ve dereceli etanol içinde Deparaffinization ve hidratasyon İmmünoboyama önce gerçekleştirilir.
  2. Endojen peroksidaz gidermek için bir engelleme adım 5 dakika süreyle% 95 etanol içinde% 0.3 H2O 2 gerçekleştirilir.
  3. Isı Induced epitop Alım (Hier) 125 azından 4 dakika boyunca ısı kaynağı olarak bir basınç kazanı (Decloaking odacık, Biocare Medical) kullanılarak ° C'de, bir tampon, pH değeri alımı 6 gerçekleştirilir Kaynama tamamlandıktan sonra, kaydıraklar basınç kazanı kalır ve 90 soğumasına izin verilir ° C. Hier için toplam işlem süresi yaklaşık 45 dakikadır.
  4. Hiçbir kesin sonuç ilk testte elde edilirse, daha ileri testler gözlenen boyanma paterni 5 6 dayalı yapılır. Pilot çalışma, HPA yüksek verimli set-up içinde gösterdiBu Hier pH 6, ancak bu tür proteinaz, mikrodalga ve daha yüksek veya daha düşük bir pH ile tampon içinde kaynatma ile ön-inkübasyon gibi diğer yöntemler alma tabii kullanılabilir en yararlı antijeni alma. Antikor inkübasyon sürelerinde, antikor dilüsyonları ve diaminobenzidin (DAB), inkübasyon zaman değişiyor IHC durum örneğin değiştirerek boyama desen daha kesin sonuçlar verebilir.

5.. Boyama Programı, Autostainer 480 (Thermo Fisher Scientific)

Bütün inkübasyonlar, RT gerçekleştirilir ve bu protokol aynı reaktifleri ile manuel bir ayar olarak da kullanılabilir.

  1. Yıkama tamponu içinde çalkalayın.
  2. 5 dakika boyunca Ultra V bloğu ile inkübasyondan.
  3. Yıkama tamponu içinde çalkalayın.
  4. 30 dakika için primer antikor ile inkübasyondan.
  5. Yıkama tamponu (x2) yıkayın.
  6. 30 dakika etiketli turbu peroksidaz-polimer ile Kuluçka.
  7. Yıkama tamponu (x2) yıkayın.
  8. DAB çözüm geliştirilmesi10 dakika için.
  9. Yıkama tamponu (x2) yıkayın.
  10. 5 dakika için * Mayers hematoksilin Counterstaining. Progresif bir boyama yöntemi kullanılarak zaman (örn. Mayers hematoksilin) ​​yoğunluğu zaman bağlıdır ve herhangi bir farklılaşma gereklidir. Bir gerici boyama yöntemi örneğin Harris hematoksilen bir yapı vurgulamak amacıyla dokuların aşırı boya kaldırmak için farklılaşmayı gerektirir.
  11. Musluk suyu * yıkayın.
  12. Lityum karbonat suda durulayın, 1 dakika * için doymuş çözeltisi ila 1:5 seyreltilmiş.
  13. * 5 dakika için musluk suyunda yıkayın.
  14. Slaytlar dereceli etanol içinde susuz ve slaytlar (PERTEX, Histolab) dakika muamele edilir

Tüm reaktifler slayt başına 300 ul bir ses seviyesinde uygulanır.
* Adımlar 10-14 bir histostaining enstrüman (Autostainer XL, Leica) yapılır ve coverslipping ayrıca bir coverslipper sistemi (otomatik cam coverslipper CV5030, Leica) yapılır.

6. Tarama nasılBir Slayt

Tarama slayt yöntemi kullanılmaktadır dijital tarayıcı bağlıdır, bu protokolü sadece otomatik tarama sistemi Aperio XT (Aperio Teknolojileri) kullanarak slayt tarama nasıl tanımlar. Için İnsan Protein Atlas set-up 20x büyütme, doku ve hücreler için 40x kullanılır. Otomatik bir tarama doku heterojen bir TMA dahil çeşitli dokularda sayısına bağlı olarak odak sorunlarla olabilir.

  1. Kir, tutkal ve cam slayt temizleyin ve coverslip ve bölüm arasında hava kabarcığı olup olmadığını kontrol edin. Hava kabarcıkları gerilemek slayt halinde.
  2. Rafa slayt koyun ve dijital tarayıcı rafa yerleştirin. 20x büyütmede TMA tarama süresi yaklaşık 6 dakikadır. Aperio gelen bir yazılım ilgi alanını seçmek için kullanılır. Odak noktası seçimi yazılım içinde otomatik olarak yapılır. Elle tarama alanı ve odak noktalarının seçiminde de mümkündür.
  3. Görüntü saat sonraoluşturulan olarak değerlendirilmesi ve IHC lekelenmesi açıklama amacıyla kullanılabilir. Görüntüler deney sonucunda dosya olarak kalır ve tartışmalar için arkadaşları dağıtılmış olabilir ve daha fazla veri yayımlama için kullanılır. Görüntüleri Aperio bir serbestçe kullanılabilir yazılım görülebilir.

7. Nasıl İnsan Protein Atlas Sık Protein ara ile

  1. Gidin www.proteinatlas.org.
  2. Favori protein, Ensemble'da id, UniProt üyelik numarası veya HGNC adı örneğin insülin adını girin.
  3. Özet sayfası girin ve normal doku ve organ özeti gidin. Genel pankreas protein ifadesini gösterir.
  4. "Fazla doku veri" tıklayın. Sen bütün dokularda organı sıralaması dahil görebileceğiniz normal dokuları görüntülemek girin.
  5. Aynı protein yönelik 3 antikorları için İHK sonuçları görmek için pankreas tıklayın. Bir hi görüntülemek içingörüntü üzerinde pankreas tıklayın gh-çözünürlüklü görüntü.
  6. Kanserli doku, hücre ve İnsan Protein Atlas içinde başka doğrulama, veri protein ekspresyonu ile ilgili ek bilgiler İnsan Protein Atlas web sitesinde gezinirken bulunabilir.

8. Temsilcisi Sonuçlar

Animasyon 1. Nasıl doku mikroarray üretimi için dokuların hazırlanması. Animasyon 1 görmek için buraya tıklayın .

Animasyon 2. Nasıl bölümüne TMAlar için. Animasyon 2 görmek için buraya tıklayın .

Animasyon 3. Immünhistokimya tekniği tarif edilmiştir. Animasyon 3 görmek için buraya tıklayın .

Şekil 1
Şekil 1. Insan proteini Atlas Uppsala içinde işlemi Genel şeması.

Şekil 2
Doku çekirdek standart uzunluğu için işaretlenmiş Şekil 2. Donör stileyi 4.5 mm gibi.

Şekil 3
Şekil 3. Manuel doku microarrayer.

Şekil 4
Şekil 4. Üretilen TMAlar farklı kalite örnekleri. (A) düz ve düzgün satır ve sütun gibi parafin kenarına arasında yeterli boşluk ile TMA hizalanır. (B) çekirdek bazıları ile bir TMA çok kesit zaman olası güçlüklere yol kenarına yakın. (C) bir TMA t pişirilir edilmiş olduğuoo uzun doğru şablonu olmadan çökmüş TMA sonuçlanır.

Şekil 5,
Şekil 5. Hematoksilen ve eozin TMAlar. Düz ve hizalı sütun ve satır ile (A) düzgün kesilmiş bölümü. Kötü ya da kirli bıçak kullanarak yarma (B) veya sıkıştırılmış bölümleri (C) neden olabilir.

Şekil 6
Şekil 6. Antikorların titrasyon. (A) lenf düğümü hücreleri Reaksiyon merkezi geçmişi olmayan özel bir sitoplazmik boyanması (kahverengi gösterildiği gibi) ile sonuçlanan bir optimum titre antikoru gösterir. (B) doku bölümü zayıf bir boyama gösterir. Negatif ya da zayıf bir boyama primer antikorun konsantrasyonunu hedef protein immunohistokimyasal dokularda mevcut değildir çok düşük olduğunda veya bulunur. (C) doku bölümü primer antikorun çok yüksek konsantrasyonda kullanılması nedeniyle overstained edilir. D, taşmak reaktivite ve yanlış pozitiflik geçmeye nedeniyle Subselüler yerini belirlemede zorluklar içinde gemi renk sonuçlar.

Discussion

İmmünohistokimya tarafından bugüne kadar TMAlar için en sık kullanılan bir uygulamadır. IHC ve TMAlar kombinasyonu 11 12 ve daha fazla bazik tümör biyolojisi geniş bir hasta kohortlarında doku örnekleri dayalı dokularda protein ifadesini 7 8 kalıpları ve hücreler 10 9, belirteç buluş çalışmaların örneğin yüksek verimli tarama teknikleri, birkaç farklı ayar kullanılabilmektedir farklı fenotipleri / genotipleri, farklılaşma aşamaları, ilerleme ve metastazı 13 de dahil olmak üzere çalışmalar. TMAlar kullanmanın bir avantajı, büyük kohort malzeme hem de değerli biyolojik malzeme tasarrufu sağlanması ve daha tekrarlanabilir deneyler, bir anda analiz edilebilir. Ayrıca, TMA teknoloji kullanımı reaktif maliyetlerini ve laboratuvar işlem zamandan tasarruf sağlanır. Bir TMA sadece bir doku sınırlı miktarda içerdiğinden, doku heterojen bir konudur. Doku ve ele alınması gereken soru türüne bağlı olarak, birkaç örnek aynı specime gelen gerekebilirn. Bütün bu doku bölümlerini 13 14 temsili doğruluğu, yüksek derecede neden olduğu gösterilmiştir olarak tümör dokuları için, her örnek 2-4 çekirdek kullanılması tavsiye edilir. Doku bileşimine bağlı olarak delgeçler (0.6 mm ila 2 mm kadar) ve çapı ayarlanabilir. Dokular karmaşık ve hem de birkaç farklı hücre tipleri, yapıları ve ekstraselüler matriks vardır. Yağ değişken miktarda içeren her farklı doku tipi kompozisyonu, kan damarları, bağ dokusu, kıkırdak dokusu gibi, ayrı çekirdek delme ve toplanması için gerekli basınç etkileyecektir. Bu deneyler için amaçlanan tanımlandığı dokuları ile TMA üretiminde daha önce, herhangi bir değer olmayan malzeme üzerine prosedürü tüm adımları uygulamaya önem taşımaktadır.

Bir TMA blok içinde farklı dokularda çeşitli kesitler zaman blok kompozisyonu yüksek kalite bölümleri kazanmak yeteneğini etkileyebilir. Certain dokular, örneğin deri, kemik iliği, yağ, beyin ve meme, bölümleri su banyosunda germek nasıl etkileyen doku farklılıkları etkisi nedeniyle zor TMA blok kesit ve nasıl farklı sertlik vermekteyiz bıçak vb tarafından kesilir uygulanabildiği takdirde Dolayısıyla benzer özelliklere sahip grup dokulara tavsiye edilir, bir TMA içine yağ bakımından zengin doku gibi. Kanser dokularının çoğunda bu anlamda homojen, hangi kanser TMAlar bir kesit kolaylaştırır. Dokular heterojen türleri ile TMA tutarken mikroarray çekirdeği stabilize edilmesi için alternatif bir kesit yöntemi uygulanabilir. Bir yapışkan bant kullanımı kesitli TMA çekirdek ve fall-out kaybı önlemek için yararlı olabilir. Bant kesitli çekirdek kalınlığı etkileyen ve daha sonra da İHK boyama 15 sonuç çünkü yapışkan bant kullanımı, dikkatli kullanılmalıdır. 9x8 İnsan Protein Atlas set-up bir TMA şablonu (işaretleri hariç) çekirdek are kullanılabilir. Bu bölümden maksimal numarası almak ve blok boyunca temsil edilen bütün dokulara tutmak için önemlidir. Reaktifler ve tarama zamanı kaydetmek için, 2 gözlü 9x8 maksimum şablon sağlayan bir cam slayt yerleştirilir.

Protein bilgi için büyük deposu, Universal Protein Resource 16 sadece yaklaşık% 66 protein düzeyinde kanıta sahip olan yaklaşık 20.300 yorumlanan insan proteini girişlerini içerir. Ayrıca protein düzeyi üzerindeki varlığını kanıt olduğu genlerin bir çoğunluğu için, kıt veya protein fonksiyonu ve ifade dağıtımı konusunda herhangi bir bilgi yoktur. Gelecek için önemli bir zorluk dağılımı ve insan dokusu, çok çeşitli şekillerde bu bilinmeyen proteinlerin göreceli bolluk analiz etmektir. Böyle Uniprot, Ensemble'da, PubMed yayımlanan veri olarak veritabanlarından bilgi immünohistokimyasal boyanma antikorları kullanarak eğer kurmak için bir kılavuz olarak kullanılabilirservislerinde bilinmeyen proteinleri amaçlanan hedef protein fiili proteini profilleri temsil eder. Ayrıca, diğer bazı doğrulama stratejileri protein dizileri, Western Blot, immünfloresan, immüno-yağış ve açılan deneylerde Örneğin antikor işlevsellik için, antikor işlevselliği sağlamak için gereklidir. Belki antikor işlevselliği doğrulama için en önemli araç eşleştirilmiş antikorlar kullanmak, yani iki farklı antikor testi-spesifik sonuç 17 karşılaştırmak için, aynı hedef proteini ayrı, örtüşmeyen epitoplara kaldırdı.

Derlenen bilgilere göre, antikorlar IHC standartları ve İnsan Protein Atlas projesinde 35.000 antikorlar üzerinde test edilmesi ve tanınması gelen deneyim göre test edilmiş ve titre edilir. Protein profilleri ile tüm genlerin% 20'den, eşleştirilmiş antikorlar (aynı protein örtüşmeyen epitopları doğru 2 veya daha fazla antikor) veri en iyi Esti belirlemek için kullanılmıştırgelen protein ifade deseninin dostum. Eşleştirilmiş antikorlar özel immünhistokimya bazlı protein ekspresyonu doğrulanması için nihai bir strateji sunmak. Temel tarama dahil farklı dokuların çok sayıda çapraz reaksiyon riskini artırır, çünkü bu strateji değerlidir. Bu belli dokularda genel olarak örneğin makrofajlar, düz kas, böbrek distal tübüller ve karaciğerde hepatositlerde boyama arka plan göstermek için daha fazla eğilimli olduğu da unutulmamalıdır. Yanlış negatif ya da uygunsuz pozitif IHK boyanma neden olabilir arşiv malzemesi alınan dokular için zamanla doku işleme teknikleri farklılıklar, düşünülmesi gereken ek sorunları. Bu olgu, aynı zamanda büyük bir bölümü analiz görülür. Hem negatif hem pozitif kontroller çok önemlidir ve mümkün olduğunda kullanılmalıdır. İlgili tr fonksiyonel analiz, zorla ifade ile hücre hatları ve özel knock-down gibi derin çalışmalar içinanscripts (siRNA teknolojisi) denetimler oluşturmak için kullanılabilir. Formalin fiksasyonu çeşitli kimyasal değişiklikler, çapraz bağlama antijen 18 maskeleme Schiff bazları hidroliz gibi indükler yana IHC optimum sonuçlar için, bu, antijen alma sistemleri test etmek ve kullanmak önemlidir.

Sonuç olarak, TMA teknolojisi ve IHC kullanıldığı antikor bazlı proteomiks büyük bir ölçekte proteini ifade verilerinin üretilmesi için güçlü bir strateji. İnsan Protein Atlas projesi normal insan dokularının ve kanser insan protein ekspresyonunda bir harita oluşturmak için kurulmuştur. Bu projenin amacı, 2015 yılında kapsamlı bir İnsan Protein Atlas ilk taslağını sunmak. Normal organ ve dokularda protein profilleri sağlamanın yanı sıra, bu çaba da klinik biyomarker bulma çabaları da dahil olmak üzere biyomedikal araştırma projeleri için bir başlangıç ​​noktası sağlar. Nihai hedef, insan genom dizisi üstüne bir sonraki bilgi katmanı eklemek olduğunu wiçeşitli hastalık durumları altta yatan biyolojinin daha derin bir anlayış için çok önemli olacak ve yeni tanı ve tedavi araçları geliştirmek için bir temel teşkil edeceğiz.

Disclosures

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

Bu çalışma Knut ve Alice Wallenberg temelden bağışları ile desteklenmiştir. Uppsala, Stockholm ve Hindistan İnsan Protein Atlas merkezlerinin tüm kurmayları İnsan Protein Atlas oluşturmak için çabaları için kabul edilmiştir. Çekerken, yazarlar, özellikle TMA üretimi ile yardım için fotoğraf ve Elene Karlberg yardım için Frank Hammar ve Sofie Gustafsson teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wash buffer Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-999-TT
Citrate buffer pH6 Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-250-Pm1X
Antibody diluent Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-UD
UltraVision LP HRP polymer Thermo Fisher Scientific, Inc. TL-125-HL
DAB plus substrate system Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-HDX
Ultra V Block Thermo Fisher Scientific, Inc. TA-125-UB
Primary Antibody Enhancer Thermo Fisher Scientific, Inc. TL-125-PB
Mayers hematoxylin Histolab 01820
PERTEX Histolab 00871.0500
Manual tissue micro arrayer Estigen, Beecher Instrument MTA-1
Waterfall microtome Thermo Fisher Scientific, Inc. Microm HM 355S
Automated image scanner Aperio Technologies XT
Automated slide staining system Thermo Fisher Scientific, Inc. Autostainer 480S-2D
Automated slide staining system for deparafinization and dehydration Leica Microsystems Autostainer XL
Automated glass coverslipper Leica Microsystems CV5030
Decloaking chamber Biocare Medical DC2008INTEL

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Battifora, H. The multitumor (sausage) tissue block: novel method for immunohistochemical antibody testing. Lab Invest. 55, 244-244 (1986).
  2. Kononen, J., Bubendorf, L., Kallioniemi, A. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nat. Med. 4, 844-844 (1998).
  3. Berglund, L., Bjorling, E., Oksvold, P. A genecentric Human Protein Atlas for expression profiles based on antibodies. Mol. Cell Proteomics. 7, 2019 (2008).
  4. Uhlen, M., Bjorling, E., Agaton, C. A human protein atlas for normal and cancer tissues based on antibody proteomics. Mol. Cell Proteomics. 4, 1920 (2005).
  5. Paavilainen, L., Edvinsson, A., Asplund, A. The impact of tissue fixatives on morphology and antibody-based protein profiling in tissues and cells. J. Histochem. Cytochem. 58, 237-237 (2010).
  6. Paavilainen, L., Wernerus, H., Nilsson, P. Evaluation of monospecific antibodies: a comparison study with commercial analogs using immunohistochemistry on tissue microarrays. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. 16, 493-493 (2008).
  7. Kampf, C., Andersson, A. C., Wester, K. Antibody-based tissue profiling as a tool for clinical proteomics. Clinical Proteomics. 1, 285-285 (2004).
  8. Ponten, F., Jirstrom, K., Uhlen, M. The Human Protein Atlas - a tool for pathology. J. Pathol. 216, 387-387 (2008).
  9. Andersson, A. C., Stromberg, S., Backvall, H. Analysis of protein expression in cell microarrays: a tool for antibody-based proteomics. J. Histochem. Cytochem. 54, 1413-14 (2006).
  10. Stromberg, S., Bjorklund, M. G., Asplund, C. A high-throughput strategy for protein profiling in cell microarrays using automated image analysis. Proteomics. 7, 2142 (2007).
  11. Jogi, A., Brennan, D. J., Ryden, L. Nuclear expression of the RNA-binding protein RBM3 is associated with an improved clinical outcome in breast cancer. Mod. Pathol. 22, 1564 (2009).
  12. Magnusson, K., De Wit, M., Brennan, D. J. SATB2 in combination with cytokeratin 20 identifies over 95% of all colorectal carcinomas. Am. J. Surg. Pathol. 35, 937 (2011).
  13. Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O. P. Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research. Int. J. Cancer. 94, 1 (2001).
  14. Rimm, D. L., Camp, R. L., Charette, L. A. Tissue microarray: a new technology for amplification of tissue resources. Cancer J. 7, 24 (2001).
  15. Catchpoole, D., Mackie, N., McIver, S. Tape transfer sectioning of tissue microarrays introduces nonspecific immunohistochemical staining artifacts. Biotech. Histochem. (2010).
  16. UniProt. Nucleic acids research. 39, D214 (2011).
  17. Uhlen, M., Oksvold, P., Fagerberg, L. Towards a knowledge-based Human Protein Atlas. Nature Biotechnol. 28, 1248 (2010).
  18. Leong, A. S., Leong, T. Y. Standardization in immunohistology. Method Mol. Cell Biol. 724, 37 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics