דגם גופיים Organotypic הקרני של הרפס סימפלקס סוג אפיתל החריף וירוס אני זיהום

Published 11/03/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

במאמר זה יתאר וידאו השימוש חדש

Cite this Article

Copy Citation

Alekseev, O., Tran, A. H., Azizkhan-Clifford, J. Ex Vivo Organotypic Corneal Model of Acute Epithelial Herpes Simplex Virus Type I Infection. J. Vis. Exp. (69), e3631, doi:10.3791/3631 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

keratitis הרפס הוא האחת הפתולוגיות החמורות ביותר הקשורות לוירוסים מסוג 1 (HSV-1) הרפס סימפלקס. keratitis הרפס הוא כיום הגורם המוביל לשניהם נגזרו קרנית וזיהום הקשור בעיוורון בעולם המפותח. מצגת טיפוסית של הרפס קרטיטיס כוללת דלקת של האפיתל של הקרנית ולפעמים עמוקים יותר סטרומה ואנדותל בקרנית, מה שמוביל למחל קרנית קבועות כגון צלקות, דלילים, ואטימות 1.

זיהום קרני HSV-1 הוא למד באופן מסורתי בשני סוגים של מודלי ניסויים. במבחנת מודל, שבי monolayers תרבית של תאי אפיתל קרניים נגוע בצלחת פטרי, מציע פשטות רמה גבוהה של replicability, ניסויים מהירים, ועלויות נמוכות יחסית. מצד השני, in vivo מודל, שבי חיות כמו ארנבים או עכברים מחוסנות באופן ישיר בקרנית, מציע פיסיולוגי מתוחכם ביותרמערכת, אבל יש עלויות גבוהות יותר, ניסויים ארוכים יותר, טיפול בבעלי חיים הכרחיים, ובמידה רבה יותר של השתנות.

במאמר זה וידאו, אנו מספקים הדגמה מפורטת של דגם חדש vivo לשעבר של זיהום HSV-1 אפיתל קרני, המשלב את היתרונות של שניהם במבחנה במודלי vivo. מודל vivo לשעבר מנצל קרניות שלמות שמרו organotypically בתרבות ונגועה בHSV-1. השימוש במודל vivo לשעבר מאפשר למסקנות מאוד מבוססות מבחינה פיזיולוגית, ובכל זאת היא לא זולה ודורשת מחויבות זמן דומים לזה של מודל במבחנה.

Protocol

כל ריאגנטים והציוד נרכשו סטרילי או עוקרו לפני ההליך. מאמר זה מתאר את השלבים של הקמת מודל vivo לשעבר מתחיל בעין מראש enucleated. בניסויים שלנו, אנו משתמשים בעיניים שלמות טריות מ( 8-12 wks) ארנבות בקנים צעירות (PEL-freez ביולוגי, רוג'רס, AR). בנוסף, אנו משתמשים בקרניות של אדם שנלקחו מבנק העין המקומי. אם ביצוע enucleation עצמך, לטפל כדי למנוע ניזק לקרנית או גובל במהלך ההליך. פרוטוקולי enucleation ארנב ניתן למצוא במקום אחר 2.

חלק 1: כריתתן Corneoscleral

  1. הרטב את הרצועה צרה של גזה עם PBS ולעטוף איתו את גלגל העין כדי להקל מחזיק אותו במהלך ההליך.
  2. השתמש באזמל חד לעשות חתך משיק בלובן העין, במרחק של כ 0.5 סנטימטרים מימבוס.
  3. השתמש במספריים חדים להרחיב את החתך ולחלוטין בלו גכפתור orneoscleral.
  4. ברגע שכפתור corneoscleral מבודד, להקניט את הקשתית תוך החזקת חישוק scleral עם מלקחיים. למנוע ניזק האנדותל או הפעלת לחץ מוגזם על הקרנית.

חלק 2: מבוא של קרנית לתרבות Organotypic

  1. קרניות Explanted מתורבתות במדיום החיוני המינימאלי (MEM) בתוספת חומצות האמין שאינם חיוניות (1X), L-גלוטמין (2 מ"מ), פניצילין (200 U / ml) וסטרפטומיצין (200 מיקרוגרם / מ"ל). סוכן נגד פטריות, כגון amphotericin, ניתן גם להוסיף במידת צורך.
  2. הכן את פתרון agarose 1% במדיום התרבות ולשמור אותו מוכן בשעת 55 ° C.
  3. יש לשטוף היטב את הקרנית ב PBS המכיל פניצילין סטרילי (200 U / ml) וסטרפטומיצין (200 מיקרוגרם / מ"ל).
  4. הנח את צד אפיתל הקרני לתוך היטב של צלחת מקום סטרילי.
  5. הוסף הבינוני agarose המכיל לקעירות האנדותל של הקרנית מספיק כדילמלא אותו לחלוטין. אפשר ~ 1 דקות לagarose כדי לחזק.
  6. הנח את הקרנית עם התמיכה בצד אפיתל ג'ל פיגום לתוך צלחת תרבית רקמה 35 מ"מ ולהוסיף התרבות הבינונית שיכסו את פני שטח האפיתל.
  7. הקרנית עלולה להיות מתורבתת בדרך זו ליותר משבוע, עם שינויים בינוניים כל 48 שעות.

חלק 3: זיהום בHSV-1 וטיפול בתרופות ניסיוניות

  1. הוסף 1 מ"ל של מדיום המכיל את הכמות הרצויה של וירוס לתוך צלחת תרבית רקמת 35 מ"מ. אנחנו בדרך כלל להדביק עם 1x10 4 pfu של הזן KOS HSV-1 לקרנית. כייל המניות שלנו נקבעים על ידי ביצוע מבחנים פלאק על CV-1 monolayers.
  2. הנח את הקרנית ביחד עם צד אפיתל agarose הפיגום לתוך מדיום וירוס המכיל.
  3. הנח את הקרנית לרקמות תרבות חממה להדביק לשעה 1 עם נדנדה לסירוגין כל 10-15 דקות.
  4. לאחר השעה 1, לשאוב וירוסי contaiנינג הבינוני ולשטוף 2-3 פעמים עם PBS להסיר כל חלקיקים נגיפיים שיורית.
  5. הנח את הקרנית חזרה למקומה הקודם ולהוסיף מדיום התרבות טרי כדי לכסות את פני השטח האפיתל.
  6. טיפולים ניסיוניים עשויים להיות נכתבו לפני או אחרי הזיהום, בהתאם לאופי של הניסוי.
  7. מדיום תרבות משתנה כל שעה 48.

חלק 4: אוסף דוגמאות

  1. בינוני לניתוח assay פלאק. מערבב היטב הבינוני ולהשתמש בו באופן מיידי לבדיקת שלט או חנות ב-80 ° C לשימוש מאוחר יותר אם איסוף דגימות בנקודתי זמן שונות.
  2. דנ"א, רנ"א, חלבונים, או תאי האפיתל מקרנית
    1. הסר את agarose הפיגום ולשטוף היטב עם קרנית PBS.
    2. בלו הטבעת של רקמת scleral מהקרנית על מנת להבטיח שחומר אפיתל קרני רק תיאסף.
    3. Uלשיר אזמל, לגרד מתאי האפיתל של הקרנית למאגר המתאים, תלוי בסוג של חומר להיות מבודדים. לבידוד של DNA ו-RNA, אנו משתמשים בערכת הדם ורקמות DNeasy וקיט RNeasy מיני, בהתאמה (Qiagen, Hilden, גרמניה). לאוסף של lysates חלבון, אנו משתמשים במאגר Laemmli. לניתוח cytometry זרימה של תאי אפיתל קרניים, אנחנו מראש דגירת הקרניות בכמות קטנה של טריפסין כדי לשחרר את התאים, ואחר כך לשלוף אותם לטריפסין עם אזמל. מאחר שמגרד את האפיתל של הקרנית אינו מניב כמויות שווות של רקמה, חשוב לכלול פקדים מתאימים בעת ניתוח הדגימות. אנו משתמשים rRNA 18S כתעתיק התייחסות בqRT-PCRs, GAPDH כגן התייחסות בqPCRs, וnucleolin כבקרת טעינה לכתמים מערביים.
  3. דגימות רקמה לאימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence
    1. הסר את agarose הפיגום ולשטוף את התירסEA גם עם PBS.
    2. בהתאם למטרת הניסוי שלך, השתמש בקרנית לעשות בלוק פרפין רקמה או גוש רקמה קפוא, כפי שמוצג בסרטון. אנו עוקבים אחר נהלים סטנדרטיים בעת הכנת חלקי רקמת קרנית.

נציג תוצאות

רוב השיטות הזמינות ללימוד תאים בתרבית רקמה ניתן להתאים בקלות לשימוש בקרניות נגועות בvivo לשעבר HSV-1. מוצג כאן הם תוצאות יציגות לכמה מהטכניקות הישימות ללימוד זיהום HSV-1 הנפוצות ביותר - qPCR (1D איור), qRT-PCR (האיור 1B), מערבי כתם (האיור 1F), assay פלאק (התרשים 1C), ו הרקמה immunofluorescence (האיור 1E).

איור 1
איור 1. הניתוח של קרניות נגועות HSV-1 לשעבר vאיבו. (א) ייצוג סכמטי של מודל vivo לשעבר של הזיהום חריף בקרנית אפיתל HSV-1. (BF) ניתוח של קרניות הנגועות בשיטה שתוארה במאמר זה וידאו. קרניות ארנב Explanted היו נגועות ב1x10 4 / קרנית pfu של הזן KOS HSV-1 ותרבית בנוכחות (Paa) או העדרה (מוק) של חומצת phosphonoacetic (400 מיקרוגרם / מ"ל), מעכב ידוע של שכפול HSV. (ב) RNA סה"כ נאסף בנקודתי הזמן המצוין, ושעתוק נגיפי הוערך על ידי qRT-PCR עם פריימרים לפולימרז HSV-1. Primers נגד 18S rRNA שמש כנקודת התייחסות. n = 3. ברי שגיאה מצביעים ± SEM. (ג') הבינוניים תרבות נאסף בגיל 48 HPI, וייצור חלקיקים מדבק הוערך על ידי assay פלאק על משטחי CV-1. (ד ') ה-DNA סה"כ נאספה בגיל 48 HPI, ושכפול הגנום נגיפי הוערך ב assay qPCR עם פריימרים לגנום HSV-1. יחסי הציבורimers נגד GAPDH שמשו כנקודת התייחסות. n = 3. ברי שגיאה מצביעים ± SEM. (E) מוק הקרניות שטופלו היו פלאש קפוא ב 48 HPI, נותח, ונותחו על ידי immunofluorescence העקיף לנוכחות של חלבון נגיפי מוקדם (ICP8) בתוך האפיתל הנגוע. גרעיני counterstained עם Hochst 33258. (F) lysates החלבון נאספו בגיל 48 HPI, והביטוי של חלבון נגיפי (ICP0) הוערך על ידי כתם מערבי. BCA assay שמש כדי להבטיח טעינה שווה של דגימות. HPI = שעתי זיהום הודעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה יתאר וידאו שיטה ללימוד הזיהום חריף בקרנית אפיתל HSV-1 במודל vivo לשעבר. המודל הזה הוא קרש קפיצה שימושית בין במבחנה במודלי vivo, משום שהיא מאפשרת לאימות פיזיולוגית מדויקת-תוצאות תרביות תאים, ובכך מגבילה את כמות הניסויים בבעלי חיים שהם צריכים לבצע. בנוסף, מודל vivo לשעבר מספק הזדמנות ייחודית ורבת ערך כדי ללמוד זיהום הרפס אפיתל בקרניות אנושיות שלמות. מפורטות להלן כמה שיקולים שצריך לקחת בחשבון בעת ​​שימוש במודל זה:

  • חשוב להדגיש, כי הגישה שתוארה במאמר זה וידאו לא אמורה להיות מודל של keratitis הרפס, אלא הוא מודל של הזיהום חריף בקרנית אפיתל HSV-1. keratitis הרפס הוא תוצאה של מספר תהליכים מבלבלים, כוללים זיהומים, דלקות, וim המארחmune תגובה לווירוס. אנטיגן ספציפי לסוג CD4 + וCD8 + T תגובות תא הן מרכיב משמעותי בפתוגנזה של keratitis הרפס, שלא ניתן לשחזר במודל זה, משום שקרניות explanted אינן כפופות לחדירה על ידי תאים של מערכת החיסון. מסיבה זו, הם לא לפתח הכיבים הדנדריטים אפיתל הטיפוסיים וחוסר מעורבות סטרומה נצפתה קלסי בkeratitis הרפס סטרומה 3. לכן, בקיע מחומרת המחלה והדמית fluorescein של כיבי קרנית אינו אפשרי במודל vivo לשעבר. בנוסף, ברוב המקרים של הרפס קרטיטיס נגרמים על ידי הפעלה מחדש נגיפית מהשהיה. מאז הגישה שלנו מסתמכת על זיהום ישיר של קרניות explanted עם וירוס אקסוגני, זה מודלים חריפים זיהום HSV-1 קרנית ולא מחלה מחדש. מסיבות אלה, המודל מוצג כאן הוא אינו מתאים להבנת הפתולוגיה הכוללת של המחלה, אלא shולד לשמש ללמוד שכפול נגיפי ואינטראקציות וירוסים מארחים אך ורק באפיתל הקרני.
  • הרפס תוצאות גופיים keratitis מודל תשואות עם שונות גדולות יותר בניסויי מבחנת תרבית רקמה. זה כנראה בשל עובדה שכל קרנית נאספת מארנב אחר ועשוי להיות מעובד בצורה שונה במקצת. קרניות אדם להראות שונות גדולות עוד יותר של תוצאות מאשר קרניות ארנב, מכיוון שהם מגיעים מתורמים בגיל משתנה, גזע, ומצבו בריאותי, ונשמרות לכמויות שונות של נתיחה שלאחר מות הזמן. עם זאת, עם שימוש בלפחות חמש קרניות לטיפול ניסיוני, שהיינו מסוגלות להפיק נתונים סטטיסטיים אמינים-.
  • השיטה המסורתית לculturing explanted קרניות 4-5 מציעה להשתמש במדיום התרבות רק כדי לכסות את גובל של הקרנית. מצאנו כי הגדלת הכמות בינונית לכיסוי אפיתל לחלוטין מניבה תוצאות עקביות יותר,כנראה עקב מזעור ההבדלים בין הגישה של הקרניות בודדות לתרופות הבינוניות וניסיוניות הכלולות בו.
  • בעת שימוש בקרניות ארנב לכל יישום ניצול נוגדנים, חשוב לזכור שנוגדנים מסורתיים עם מאפיינים ייחודיים ל, עכבר, עכברוש אנושי, וכו 'עשויים לא צולב מגיב נגד אנטיגנים ארנבים. בנוסף, נוגדנים נגד ארנב שניים כמובן לא ניתן להשתמש ביישומים אלה. מסיבות אלה, אנו משתמשים קרניות אדם בניסויים המעורבים מכתים נוגדן יעדים סלולריים.
  • כאשר איסוף תאי האפיתל לניתוח cytometry זרימה, הנסיין חייב להיות זהיר לגבי ההשפעות של טריפסין על חלבוני קרום בכריכה. לפיכך, לזיהוי של חלבונים על פני שטח, זה עשוי להיות מועיל להשתמש באמצעים אחרים מוציאים את התאים, כגון collagenases או פרוטאזות הלא טריפסין.
  • מודלים של בעלי חי keratitis הרפס להסתמך על שריטה בקרנית לפני החיסון עםהווירוס. אנחנו כבר מסוגלים להגיע לרמות עקביות של זיהום ללא שורט קרניות explanted. זה ככל הנראה בשל היעדר שכבת הדמעות והמצמוץ שמהירות לחסל את הווירוס מהמשטח הקרני בחי.

שינויים אפשריים של מודל keratitis vivo לשעבר הרפס לא בחנו במאמר זה וידאו:

  • הנדסה גנטית של תאי אפיתל קרניים לפני זיהום HSV-1 באמצעות שיטות משלוח DNA משמשים בתרבית תאים ובמחקר בריפוי גנטי, כגון transfection, משלוח נגיפי, ומחסל גן 6.
  • שימוש בביטוי GFP-HSV-7-8 ינואר או נוגדני FITC-מצומדות אנטי HSV 9-10 חזותיים כדי להעריך את היקף הזיהום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

התמיכה של בנק עין אריות דלאוור העמק הייתה רבה ערך עבור עבודה זו. נוגדן חד שבטי עכבר העיקרי נגד ICP8 היה מתנה מסוג ד"ר דוד Knipe (הספר לרפואת הארוורד). אנו מודים גם לד"ר סטיבן ג'נינגס (דרקסל מכללה לרפואה של אוניברסיטה) ופיטר ד"ר Laibson (צוואות Eye Institute) לדיונים מועילים ואת המומחיות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Minimum Essential Medium (MEM) Mediatech, Inc. 10-010-CV
Non-Essential Amino Acids (100x solution) Mediatech, Inc. 25-025-CI
L-Glutamine Mediatech, Inc. 25-005-CI
Penicillin G Sodium Salt Sigma-Aldrich P3032
Streptomycin Sulfate Salt Sigma-Aldrich S9137
Agarose Invitrogen 15510-027
Phosphate Buffered Saline (PBS) Prepared in Lab N/A
Trypsin EDTA (1x) Mediatech, Inc. 25-053-CI
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Laemmli Buffer Prepared in Lab N/A
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound Tissue-Tek 4583
Whole Rabbit Eyes (Young) Pel-Freez Biologicals 41211-2
Human Corneas and Whole Eyes Local Supplier N/A
12 Well Porcelain Spot Plate Avogadro’s Lab Supply 1877
35 mm Tissue Culture Dish Falcon BD 353001
6 Well Cell Culture Plate Greiner Bio-One 657160
Cryomold Intermediate Tissue-Tek 4566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kaye, S., Choudhary, A. Herpes simplex keratitis. Prog. Retin. Eye Res. 25, 355-380 (2006).
  2. Holmberg, B. J. Enucleation of exotic pets. Journal of Exotic Pet Medicine. 16, 88-94 (2007).
  3. Remeijer, L., Osterhaus, A., Verjans, G. Human herpes simplex virus keratitis: the pathogenesis revisited. Ocul. Immunol. Inflamm. 12, 255-285 (2004).
  4. Foreman, D. M., Pancholi, S., Jarvis-Evans, J., McLeod, D., Boulton, M. E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. Exp. Eye Res. 62, 555-564 (1996).
  5. Xu, K. P., Li, X. F., Yu, F. S. Corneal organ culture model for assessing epithelial responses to surfactants. Toxicol. Sci. 58, 306-314 (2000).
  6. Klausner, E. A., Peer, D., Chapman, R. L., Multack, R. F., Andurkar, S. V. Corneal gene therapy. J. Control Release. 124, 107-133 (2007).
  7. Halford, W. P. ICP0 antagonizes Stat 1-dependent repression of herpes simplex virus: implications for the regulation of viral latency. Virol. J. 3, 44 (2006).
  8. Bhattacharjee, P. S. Effective treatment of ocular HSK with a human apolipoprotein E mimetic peptide in a mouse eye model. Invest Ophthalmol Vis. Sci. 49, 4263-4268 (2008).
  9. Novitskaya, E. S. Difficulties imaging herpes simplex keratitis with fluorescein isothiocynate-labeled anti-HSV-1 antibodies in an ex vivo model. Cornea. 28, 421-425 (2009).
  10. Sharma, A., Shimeld, C. In vivo immunofluorescence to diagnose herpes simplex virus keratitis in mice. Br. J. Ophthalmol. 81, 785-788 (1997).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats