Immunohistological Маркировка микротрубочек в Сенсорные дендритов нейронов, трахеи, и мышцы в Drosophila Личинка стенки тела

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Чтобы понять, как сложные формы клеток, например, нейронных дендритов, достигаются в процессе развития, важно, чтобы быть в состоянии точно организации микротрубочек анализа. Здесь мы опишем надежной immunohistological метод маркировки для изучения организации микротрубочек дендритных разветвление дендритов нейронов сенсорных, трахея, мышцы и другие

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Yalgin, C., Karim, M. R., Moore, A. W. Immunohistological Labeling of Microtubules in Sensory Neuron Dendrites, Tracheae, and Muscles in the Drosophila Larva Body Wall. J. Vis. Exp. (57), e3662, doi:10.3791/3662 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Чтобы понять, как различия в сложной формы ячейки достигнута, важно точно следовать микротрубочек организации. Тела дрозофилы личиночной стены состоит из нескольких типов клеток, которые являются моделями для изучения клеток и тканей морфогенеза. Например трахеи используются для изучения морфогенеза трубки 1, и дендритные разветвление (DA) сенсорных нейронов личинки дрозофилы стали основной системы для выяснения общих и нейрон-класс-специфические механизмы дендритных 2-5 дифференциация и перерождение 6 .

Форма дендритов ветви могут существенно различаться между нейроном классы, и даже между различными ветвями одного нейрона 7,8. Генетические исследования в нейронах Д. А. предполагают, что дифференциальные цитоскелета организация может лежать в основе морфологических различий в дендритные формы филиала 4,9-11. Мы обеспечиваем надежный метод маркировки для иммунологическихssay в естественных условиях микротрубочек организации в Д.А. сенсорного нейрона дендритов беседки (рис. 1, 2, фильм 1). Этот протокол иллюстрирует вскрытие и иммунной первой взрослой личинки, этап, когда активной сенсорной вырост дендрита нейрона и ветвление организации происходит 12,13.

В дополнение к окрашиванию сенсорных нейронов, этот метод позволяет достичь надежной маркировки организации микротрубочек в мышцах (Видео 2, 3), трахеи (рис. 3, Movie 3), и других тканей стенки тела. Он ценен для следователей желающих анализировать микротрубочек организации на местах в стенке тела при исследовании механизмов, ткани контроля и формы клеток.

Protocol

1. Подготовка реагентов

Примечания Перед началом: Разбор и иммуногистохимического окрашивания осуществляется в магнитных камеры и личинка возлагали вниз, используя специальную форму контакта насекомого. Подробные инструкции по строительству магнитной камеры, и подготовка этих выводов можно найти в соответствующих ссылок 14,15. Короче говоря, отверстие 1x1cm квадратных разрезается на магнитных листа и покровного прикреплена к задней части листа, чтобы сделать небольшую камеру. Стенками камеры герметизированы эпоксидным клеем, после этого клей установил камеру несколько раз промывают 70% этанолом перед использованием. Препарирование контакты насекомых готовы, сгибая в нужную форму, а затем наклеиваются на металл вкладку 14,15. В качестве альтернативы металла вкладку, мы использовали перевернутый с плоской головкой стали канцелярская кнопка с ручкой из отсечки желтый наконечник. Использование этого магнитного расположения камеры позволяет тщательный контроль ОвеГ контактный позиционирования и растяжения тканей во время вскрытия.

Чтобы управлять экспрессией гена-репортера в различных подмножеств Д. А. следователи нейроны могут использовать несколько различных Gal4 линий (обобщены Шимоном и его коллеги 16). Многие из этих линий можно получить в общественных центрах акций. В этом представительном протокол, мы осуществляем иммунной линии, в которых два противоположных класса DA нейрона совместно называются: самый простой класс я и самый сложный класс IV (P10-Gal4 17,18, UAS-mCD8:: Kusabira-оранжевый (КО)).

  1. Подготовка Ca + +-бесплатный HL3.1 солевой
    1. В мм: 70 NaCl, 5 KCl, 20 MgCl 2, 10 NaHCO 3, 5 HEPES, 115 сахарозы и 5 трегалозу; рН 7,2 19. Фильтр-стерилизовать и хранить при температуре 4 ° C. Примечание: Ca + +-бесплатное решение предотвращает сокращение мышц во время вскрытия.
  2. Подготовка 2x буфера PHEM
    1. В мм: 130 ТРУБЫ, 60 HEPES, 20 EGTA, 4 MgSO4, рН 7,0. Фильтр-стерилизовать и хранить при температуре 4 ° C.

      Примечание: Эти материалы не растворяются, пока рН подходы 7.0.

  3. Подготовка фиксирующие только что непосредственно перед фиксацией.
    1. Для того чтобы подготовить 25 мл раствора, первый параформальдегида 2g смеси, 100 мкл 1М NaOH и 10 мл воды в 50 мл трубки Falcon.
    2. Встряхните фиксатором в 55 ° С водяной бане с шейкер, пока раствор не станет прозрачным. (Общий объем составит около 11,5 мл.)
    3. Прохладный фиксатором на льду.
    4. Добавить 12.5ml 2x буфера PHEM.
    5. Отрегулируйте рН до 7,0 с помощью 1М HCl.
    6. Заполните раствор водой до объема 25 мл.
    7. Фильтры решения с использованием ватмана.

2. Личинки вскрытия

Обратите внимание, перед началом: микротрубочек сетей, и особенно те, в сенсорных дендритов, будет пробой быстро после начала вскрытия. Переменный токhieving быстрого вскрытия менее чем за пять минут с последующей немедленной фиксации являются ключевыми факторами в успехе этого протокола.

  1. Вымойте личинки в воде и быстро переместить их в это падение, используя цикл волос.
  2. Восток личинки спинной стороной вверх и брюшной стороны на стекле. Примечание: Это направление заключается в изучении нейронов вентральной кластера. Изучить спинной нейронов кластера, инвертировать ориентации.
  3. Использование центра насекомых-контактный к контакту переднем конце близ устья крючков. Место контактный близко к концу для лучшего результата.
  4. Место каплю физиологического раствора в HL3.1 вскрытия камеры.
  5. Вырезать очень заднего конца личинки прочь с microscissors. Примечание: Этот шаг открывает отверстие на заднем конце тела личинки, которая позволит доступ для microscissors (шаг 2.7).
  6. Захватите с пинцетом области кишечника, который сейчас торчат из диафрагмы на заднем конце личинки. Аккуратно вытащить весь кишечник.
  7. Местокончика одного лезвия microscissors через диафрагму и разрезать вдоль вентральной срединной линии по отношению к передней.
  8. Использование угол контакта, контакт теперь свободна углов, задних, а затем передние. Одновременно мягко растянуть открытых личиночной филе.

3. Фиксация, блокирование, окрашивания и монтажа личинок филе

Примечания Перед началом: Все фиксации и окрашивания шаги осуществляются в рассечение камеры. Во время этого процесса, будьте осторожны, чтобы не сбить насекомое контакты проведения личинки так как это может привести к повреждению тканей. Чтобы предотвратить эксперимент от высыхания, все делайте окрашивание шаги в небольшой контейнер Tupperware окружении смоченной ткани.

  1. Аспирируйте Ca + +-бесплатный HL3.1 буфер, используя желтый наконечник. Сразу же добавить фиксатор с использованием другого pipetteman.
  2. Аккуратно пипетку вверх и вниз, смешать с фиксатором оставшиеся следы Ca + +-бесплатный HL3.1 буферв камере. Сразу аспирата, а затем добавить свежий фиксатором в камеру.
  3. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут.
  4. Вымойте 6x 10 минут в PBST (0,1% Тритон Х-100 в PBS).
  5. Блок с 5% сыворотки козьего в PBST в течение 20 мин при комнатной температуре.
  6. Замените блокирующий раствор с первичными антителами разводят в 5% сыворотки козьего в PBST. Первичных антител использовали с помощью мыши анти-α-тубулина (DM1A) и крысы анти-CD8 (5H10), как разбавленный 1 / 1000.

    Примечание: следователь, возможно, пожелают заменить мышь анти-α-тубулина (DM1A) с мышью против Futsch (22C10) 20,21 разбавленного 1 / 1000 в некоторых обстоятельствах (см. обсуждение).

  7. Выдержите в течение ночи (по крайней мере 16 ч) при 4 ° C.
  8. Вымойте 6x 10 минут в PBST.
  9. Добавить вторичных решение антител разводят в 5% сыворотки козьего в PBST. Вторичные антитела, используемые Alexa Fluor 488 антимышиного IgG и Cy3 осла анти-IgG крысы. Держите выборка охватывала для предотвращения флуорофорафото-отбеливание 22.
  10. Инкубируйте либо при комнатной температуре в течение двух часов или на ночь при 4 ° C следует один час при комнатной температуре.
  11. Вымойте 6x 10 минут в PBST.
  12. Место личиночной филе на слайде кутикулы стороной вниз, смонтировать в 80% глицерина, и печатью сторон покровным лаком для ногтей для 'быстрый' горе.
    Примечание: Для улучшения очистки ткани, и постоянный стабильный образец, смонтировать в DPX, как описано выше 23.

4. Представитель Результаты:

Флуоресцентные окрашивание рассматривается в соответствии с конфокальной микроскопии. На рисунках 1-2, различных отраслей в дендритных беседки имеют различные цитоскелета организации. На рисунке 1 показана область вала IV класса DA нейронов на 1-м этапе личиночного возраста. Вся беседка отмечен mCD8:: KO и регистрируется с помощью анти-CD8 антител и флуоресцентного вторичные (Cy3). Тубулина определяется с помощью анти α-тубулина антител и фторescent вторичные (Alexa Fluor 488). Основные отрасли являются позитивными для тубулина, некоторые тонкие ветки стороне тубулина-отрицательными. Фильм 1 представляет собой набор серийных срезов через аналогичный окрашивание класса я Д. А. нейрона. На рисунке 2 показана область вала IV класса DA нейронов окрашивали антителами против Futsch и CD8 на 1-м этапе личиночного возраста. Основные отрасли Futsch-инфицированным, некоторые тонкие ветки стороне Futsch-отрицательными. Рисунок 3. Трахеи в личиночной стенкой тела показывают сложную организацию микротрубочек. Фильмы 2 и 3 показаны серийные участки окрашивания через стенки тела мышцы и трахеи.

Рисунок 1
Рисунок 1. Рис. 1 показана область вала IV класса DA нейронов на 1-м этапе личиночного возраста. Вся беседка отмечен mCD8:: KO и регистрируется с помощью анти-CD8 антител и флуоресцентного вторичные (Cy3). Тубулина определяется с помощью анти-и-Tubuliн антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa 488). Панели переменного тока последовательного конфокальной Z-секций (0.5μm), С ^-С ", одного меченых антител с панели C. Пример ветви с (желтые стрелки) или без (фиолетовая стрелка) микротрубочки выделены. Красной выделить наконечники стрел микротрубочек в основной эпителиальных клеток.

Рисунок 2
Рисунок 2. Рис. 2 показаны аналогичные область беседке класса IV да нейрона окрашивали антителами против Futsch и CD8 на 1-м этапе личиночного возраста. Вся беседка отмечен mCD8:: KO и регистрируется с помощью анти-CD8 антител и флуоресцентного вторичные (Cy3). Futsch определяется с помощью анти-Futsch антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa 488). Основные отрасли Futsch-инфицированным, некоторые тонкие ветки стороне Futsch-отрицательными. Пример ветви с (желтые стрелки) или без (фиолетовая стрелка) Futsch выделены.


Рисунок 3. Трахея окрашивали анти-тубулина протокол, описанный выше. Это личинка третьего возраста и расчлененным, как описано выше 23,24. Movie 3 показан увеличенный серийных срезов с поля отмечены площади.

Фильм 1. Последовательный разделов трассировки тубулина окрашивания всей дендритных беседки из класса я нейрона. Вся беседка отмечен mCD8:: KO (Magenta) и регистрируется с помощью анти-CD8 антител и флуоресцентного вторичные (Cy3). Тубулина (зеленый) определяется с помощью анти-α-тубулина антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa Fluor 488). Масштаб: с одной стороны видеоизображения соответствует 46.88μm в разделе. Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Фильм 2. Последовательный разделов трассировки тубулина окрашивания в совет директорову стены мышцы третьего взрослой личинки. Тубулина определяется с помощью анти-α-тубулина антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa Fluor 488). Масштаб: с одной стороны видеоизображения соответствует 46.88μm в разделе. Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Фильм 3. Последовательный разделов трассировки тубулина окрашивания в стенке тела трахеи третьей взрослой личинки, отмеченные площади рис.3. Тубулина определяется с помощью анти-α-тубулина антитела и флуоресцентные вторичные (Alexa Fluor 488). Масштаб: с одной стороны видеоизображения соответствует 46.88μm в разделе. Щелкните здесь для просмотра фильмов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Чтобы понять, как клеточный комплекс форм достигается очень важно быть в состоянии точно организации микротрубочек анализа. Здесь мы опишем надежной immunohistological метод маркировки для анализа организации микротрубочек дендритных разветвление нейрона сенсорными дендритов. В дополнение к окрашиванию сенсорных нейронов, этот метод позволяет достичь надежной immunohistological окрашивание трахея, мышцы и другие ткани стенки тела.

Мы используем этот протокол для изучения организации микротрубочек в разработке сенсорных дендриты нейронов DA. Эти дендриты очень чувствительны к травме или стресса 25, а сломать быстро после начала вскрытия 23. Вскрытие должно быть проведено в течение пяти минут или меньше. Микротрубочек в трахее и других тканей стенки тела являются более стабильными. Этот протокол адаптирован от используемых подготовить личиночной филе для анализа нервно-мышечном соединении 14,15, и оптимизирован для быстрого еixation после быстрого вскрытия.

При анализе дендриты нейронов Д.А., надежные анти-тубулина окрашивания в вышележащие мышцы, и основные клетки эпителия 26 может привести к сложным окрашиванием (рис. 1, Movie1). Поэтому осторожность трассировки дендритных окрашивание через несколько последовательных секций (Movie1) могут потребоваться для полного анализа микротрубочек организации в Д.А. нейрона дендритов беседке. Моноклональные антитела к конкретным гомолог дрозофилы из MAP1B, Futsch 20,21, также может быть использован для обозначения микротрубочек цитоскелета в дрозофилы периферической нервной системы 5,9,20. Futsch выражается только в нейронах и, следовательно, она производит менее сложный узор, чем окрашивание α-тубулина (рис. 2). GFP-меченых эндогенного-Тау была также использована в качестве маркера дендритных Д. А. нейрона микротрубочек 27. Использование этих маркеров является эффективным, но следует отметить, что в аксон-концов из-йэлектронной нервно-мышечном соединении Futsch специально этикетки комплекте микротрубочек 28. Точные пространственные отношения между Futsch, Тау и микротрубочек в дендритах DA еще не полностью описана. В этом протоколе мы обратились эндогенной организации микротрубочек. Кроме того, можно маркировать микротрубочек использованием гиперэкспрессия GFP меткой Тау или тубулина. Следует проявлять осторожность в отношении вызывающие непредвиденные фенотипов, когда гиперэкспрессия подходы используются 29.

В наших руках, иммуногистохимического окрашивания микротрубочек в нейронах Д. А. и других тканей стенки тела лучше всего достигается, когда вторичные антитела используются для обнаружения анти-тубулина первичное антитело связывается с легко визуализировать флуорофора, такие как Alexa Fluor 488. Следовательно, при использовании трансгенных инструменты для обозначения DA нейронов в концерте с анти-тубулина маркировки, например, через систему Gal4/UAS, LexA системы, или в MARCM 23 и MARCM производных, мы предпочитаем маркеров белков сиз спектральных пересекается с этим вторичные, такие как mCD8:: Вишня и mCD8:: KO.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Мы благодарим RIKEN для финансирования. P10-Gal4 был своего рода подарок Алена Винсент (Университет Поля Сабатье, Тулуза, Франция).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps Dumont 11251-20
Microscissors Fine Science Tools 15000-08
Mouse anti-α-tubulin (Clone: DM1A) Sigma-Aldrich T9026 Dilution 1/1000
Mouse anti-Futsch (Clone: 22C10), supernatant Developmental Studies Hybridoma Bank 22C10 Dilution 1/1000
Rat anti-CD8 (Clone: 5H10) Caltag MCD0800 Dilution 1/1000
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG Invitrogen A-11001 Dilution 1/500
Cy3 anti-Rat IgG Jackson ImmunoResearch 712-166-150 Dilution 1/200

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schottenfeld, J., Song, Y., Ghabrial, A. S. Tube continued: morphogenesis of the Drosophila tracheal system. Curr. Opin. Cell. Biol. 22, 633-639 (2010).
  2. Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).
  3. Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136, 1049-1061 (2009).
  4. Moore, A. W. Intrinsic mechanisms to define neuron class-specific dendrite arbor morphology. Cell. Adh. Migr. 2, 81-82 (2008).
  5. Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129, 2867-2878 (2002).
  6. Nishimura, Y. Selection of Behaviors and Segmental Coordination During Larval Locomotion Is Disrupted by Nuclear Polyglutamine Inclusions in a New Drosophila Huntington's Disease-Like Model. J. Neurogenet. 24, 194-206 (2010).
  7. Ramon y Cajal, S. Histology of the nervous system of man and vertebrates, 1995 translation. Oxford University Press. (1911).
  8. London, M., Hausser, M. Dendritic computation. Annu. Rev. Neurosci. 28, 503-532 (2005).
  9. Jinushi-Nakao, S. Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape. Neuron. 56, 963-978 (2007).
  10. Li, W., Gao, F. B. Actin filament-stabilizing protein tropomyosin regulates the size of dendritic fields. J. Neurosci. 23, 6171-6175 (2003).
  11. Ye, B. Differential regulation of dendritic and axonal development by the novel Kruppel-like factor Dar1. J. Neurosci. 31, 3309-3319 (2011).
  12. Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons. Neuron. 63, 788-802 (2009).
  13. Sugimura, K. Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons. J. Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).
  14. Budnik, V., Gorczyca, M., Prokop, A. Selected methods for the anatomical study of Drosophila embryonic and larval neuromuscular junctions. Int. Rev. Neurobiol. 75, 323-365 (2006).
  15. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
  16. Shimono, K. Multidendritic sensory neurons in the adult Drosophila abdomen: origins, dendritic morphology, and segment- and age-dependent programmed cell death. Neural. Dev. 4, 37-37 (2009).
  17. Colomb, S., Joly, W., Bonneaud, N., Maschat, F. A concerted action of Engrailed and Gooseberry-Neuro in neuroblast 6-4 is triggering the formation of embryonic posterior commissure bundles. PLoS One. 3, 2197-2197 (2008).
  18. Dubois, L. Collier transcription in a single Drosophila muscle lineage: the combinatorial control of muscle identity. Development. 134, 4347-4355 (2007).
  19. Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18, 377-402 (2004).
  20. Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klambt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26, 357-370 (2000).
  21. Zipursky, S. L., Venkatesh, T. R., Teplow, D. B., Benzer, S. Neuronal development in the Drosophila retina: monoclonal antibodies as molecular probes. Cell. 36, 15-26 (1984).
  22. Brent, J., Werner, K., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (25), e1108-e1108 (2009).
  23. Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics. J. Vis. Exp. (57), e3111-e3111 (2011).
  24. Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila Larval NMJ Dissection. J. Vis. Exp. (24), e1107-e1107 (2009).
  25. Tao, J., Rolls, M. M. Dendrites have a rapid program of injury-induced degeneration that is molecularly distinct from developmental pruning. J. Neurosci. 31, 5398-5405 (2011).
  26. Yamamoto, M., Ueda, R., Takahashi, K., Saigo, K., Uemura, T. Control of axonal sprouting and dendrite branching by the Nrg-Ank complex at the neuron-glia interface. Curr. Biol. 16, 1678-1683 (2006).
  27. Mattie, F. J. Directed microtubule growth, +TIPs, and kinesin-2 are required for uniform microtubule polarity in dendrites. Curr. Biol. 20, 2169-2177 (2010).
  28. Pawson, C., Eaton, B. A., Davis, G. W. Formin-dependent synaptic growth: evidence that Dlar signals via Diaphanous to modulate synaptic actin and dynamic pioneer microtubules. J. Neurosci. 28, 11111-11123 (2008).
  29. Williams, D. W., Tyrer, M., Shepherd, D. Tau and tau reporters disrupt central projections of sensory neurons in Drosophila. J. Comp. Neurol. 428, 630-640 (2000).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics