Выделение фибробластов крысы Портала

Biology
 

Summary

Техника для изоляции портал фибробластов из печени крыс описана. Печень будут перфузии и усваивается

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion. J. Vis. Exp. (64), e3669, doi:10.3791/3669 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Фиброз печени определяется избыточным отложением внеклеточного матрикса активированным миофибробласты. Есть несколько предшественников печени миофибробластов, в том числе печеночных звездчатых клеток, фибробластов портала и костного мозга, полученные фибробласты 1. Звездчатых клеток печени были наиболее изученных, но портал фибробласты чаще рассматривается как важный вклад в миофибробластов бассейна, в частности, в желчные фиброз 2. Портал фибробластов пройти распространение в ответ на повреждения эпителия желчных, потенциально играет ключевую роль в ранней стадии рубцевания желчных 3-5. Метод выделения портал фибробластов позволит в пробирке изучение этой популяции клеток и привести к более глубокому пониманию роли портал фибробласты играют в желчных фиброза.

Портал фибробласты были выделены с помощью различных методов, включая результат 6, 7 и ливерсия перфузии с ферментативного пищеварения следует выбор размера 8. Преимущество пищеварения и техника выбора размера по сравнению с результатом техники является то, что клетки могут быть изучены без необходимости перехода в культуре. Здесь мы описываем модифицированную версию оригинальной методике, описанной Круглов и Dranoff 8 для изоляции портал фибробластов из печени крыс, что приводит к относительно чистой популяции первичных клеток.

Protocol

Вся процедура осуществляется при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Подготовка растворов фермента

  1. Подготовить фермент решения в соответствии с таблицей 1 и стерильный фильтр, используя 0,22 мкм фильтр. Хранить раствор 1 и раствора 2 при комнатной температуре и решение 3 на 4 ° C до момента использования. Все решения и оборудование, вступая в контакт с изолированными клетками должны быть стерильными.

2. Подготовка перфузии оборудование

  1. Премьер-перфузии системы HBSS минус Ca 2 + / Mg 2 +, который нагревается до 37 ° C. Примечание: Для того, чтобы перфузат 37 ° C, когда он приходит в печени, HBSS нагревают на водяной бане установить до 37 ° C. После того, как она проходит через перфузии насос, он проходит через конденсатор оболочке стекла, который подключен к системе циркуляционного воды до 40 ° С (рис. 1).
  2. Стерилизовать в хирургическомолы в стакан с 70% этанола.

3. Перфузии печени

  1. Обезболить взрослых мужчин Sprague-Dawley крыс при внутрибрюшинном введении Nembutal (50-100 мг / кг массы тела при необходимости получить адекватное обезболивание).
  2. Поместите животное в положении лежа на пластиковый лоток и устранить конечностей к лотку с ленты.
  3. Очистите живота с 70% этанола.
  4. Сделайте небольшой надрез в коже на животе по средней линии. Проанализируйте кожу от фасции, сделав большой U-образный вырез на животе. Сокращение брюшных мышц с помощью ножниц по той же форме, чтобы выставить в брюшную полость.
  5. Вынести воротной вены, используя 2 ватные тампоны, чтобы аккуратно двигаться брюшной полости с правой стороны.
  6. Пройти два стерильных шелка 2,0 швов под воротной вены и галстук свободно.
  7. Вводить иглу воротной вены с 16-18 катетер калибровочных IV и закрепить катетер в положении, затянув свободно тиред швов на предыдущем шаге (рис. 2).
  8. Вводите разбавленных гепарина через катетер (1 мл гепарина 5000 ЕД USP / мл разбавляют 4 мл HBSS минус Ca 2 + / Mg 2 +). Печени следует побелить.
  9. Подключите катетер для перфузии системы. Заливать с HBSS минус Ca 2 + / Mg 2 + со скоростью 20 мл / мин в течение 10 минут. Секут IVC уступает печени, чтобы дренаж крови и перфузат. Аспирируйте объединенных кровь из брюшной полости.
  10. Изменение перфузии жидкости 0,3% коллагеназы решения (150 мг 2 типа коллагеназы в 500 мл HBSS плюс Ca 2 + / Mg 2 +) и заливать в течение 25 минут. Держите печени влажный, покрывая его с ранее расчлененных брюшной клапаном. Положите крышку чашки Петри на брюшной клапаном и положение тепла лампы на площади для поддержания внутрибрюшного температуре около 37 ° C.

4. Подготовка йэлектронной желчевыводящих путей

  1. Удалить печени, подняв его из брюшной полости с пинцетом и поместить ее в стерильную чашку культуры ткани заполнены L-15 Лейбовиц холодный СМИ.
  2. Работа в капот культуре тканей, снимите капсулу печени и нежно дразнить паренхимы печени, кроме щипцами. Перемещение в печень через несколько блюд заполнены L-15 Liebovitz медиа, продолжая дразнить от паренхимы, пока, наконец, остается изолированной желчевыводящих путей. Паренхимы печени является загар цветные, а остальные желчевыводящих путей белый.
  3. Поместите изолированных желчных протоков в 50 мл сокол трубки, заполненной 10 мл пенициллина / стрептомицина (10000 ЕД / мл пенициллина и 10000 мкг / мл стрептомицина), выйти на лед на 15 минут.

5. Выделение доли фибробластов портал

  1. Поместите желчных протоков в стерильные трубки 50 мл сокол и пропустить через мясорубку с стерильными ножницами.
  2. Добавьте небольшое количество фермента зольution № 1 в трубу (около 5 мл) и продолжают рубить желчевыводящих путей, пока не достигнет консистенции раствора.
  3. Залить раствор в стерильный стеклянный флакон. Промыть сокол трубки с оставшийся раствор № 1, затем залить его в стеклянную бутылку. Инкубировать при температуре 37 ° C при встряхивании на 100 оборотов в минуту в течение 30 минут.
  4. Фильтрация суспензии через стакан покрыты одним слоем нейлоновой сетке (30-микронного размера пор).
  5. Передача любой ткани, оставшиеся на начало сетки стерильной стеклянной бутылке промывкой сетки с ферментного раствора № 2. Начните с заливки половины (25 мл) раствора в стерильный 15 см блюдо Петри. Осторожно снимите сетку из стакана, держа края сетки без загрязнения центральной части, а затем обращения сетки и погружения его в раствор в чашке Петри, чтобы удалить оставшиеся ткани в сетку. Откажитесь от сетки. Перенесите раствор в чашке Петри в стерильную стеклянную бутылку. Промойте чашки Петри с Ремаining 25 мл раствора № 2 и перенести его на той же стеклянной бутылке. Инкубировать при температуре 37 ° C при встряхивании на 100 оборотов в минуту в течение 30 минут.
  6. В то же время, принимать фильтрат в стакан и залить в трубу 50 мл сокола. Центрифуга на 1600 оборотов в минуту (460 х г) в течение 5 минут при комнатной температуре.
  7. Аспирируйте СМИ и ресуспендируют осадок в 25 мл раствора № 3.
  8. Принять решение с шагом 5,5 и фильтровать во второй стерильный стакан покрытый 30-микронной сетки.
  9. Откажитесь от сетки. Центрифуга фильтрата при 1600 оборотов в минуту в течение 5 минут при комнатной температуре. Аспирируйте и ресуспендируют осадок с 25 мл раствора № 3, как это сделано в пункте 5.7.
  10. Смешайте 2 фракций от шагов, 5.7 и 5.9 и центрифуги снова в 1600 оборотов в минуту в течение 5 минут при комнатной температуре.
  11. Аспирируйте СМИ и ресуспендируют осадок в 10 мл средства массовой информации портала культуры фибробластов (DMEM/F12 с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина / стрептомицина, гентамицина 0,3% и 0,2% Fungizone).
  12. Граф клетки для жизнеспособности и пластина в блюдах культуры тканей. В зависимости от нужного приложения, от 0,5 до 5 х 10 6 клеток на 10-см пластины культуры ткани подходят. От взрослого Sprague-Dawley крыс, мы обычно получаем 2 до 10 млн. жизнеспособных клеток.
  13. Замените культуру средств массовой информации на следующий день, чтобы удалить не соблюдают мусора. После этого, замените питательные среды каждые 2 дня.

6. Представитель Результаты

Первичная портал фибробластов изолированы от взрослых печени крыс показано в 1, 3 и 7 дней после изоляции (рис. 3). Обратите внимание, что клетки удлиненные, с морфологией, типичной для фибробластов. Клетки могут быть окрашены с анти-эластиновых антител (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, штат Северная Каролина), чтобы подтвердить чистоту. Портал фибробластов пройти myofibroblastic дифференциация в культуре. Это может быть продемонстрировано с помощью иммунной для α-актин гладких мышц (α-SMA, A2547, Sigma, Сент-Луис, штат Миссури).

0,3% раствор коллагеназы Тип 2 коллагеназы 150 мг HBSS с Ca 2 + / Mg 2 + 500 мл Решение № 1 (проназой) Бычий сывороточный альбумин 50 мг Коллагеназы 2 типа 25 мг Проназой 18 мг ДНКазы 3 мг DMEM/F12 47,5 мл Pen / Strep 1 мл Эмбриональной телячьей сыворотки 1,5 мл Решение № 2 Бычий сывороточный альбумин 50 мг (Гиалуронидазы) Коллагеназы 2 типа 25 мг Гиалуронидаза 22 мг ДНКазы 3 мг DMEM/F12 47,5 мл Pen / Strep 1 мл Эмбриональной телячьей сыворотки 1,5 мл Решение № 3 ДНКазы 3 мг RPMI среду 1640 50 мл

Таблица 1. Фермент решений.

Рисунок 1
Рисунок 1. Перфузии создана. А. Вода циркуляционный для утепления колонке. B. Колонка содержащая перфузии СМИ. С. кран управления насосом отток. Д. насоса приток. Е. переменной скоростью перистальтического насоса. Ф. Термос с Bio-Clean моющего средства. Г. тепла лампы. H. Водяная баня для СМИ потепление перфузии.

Рисунок 2
ФигуRe 2. В месте перфузии. А. IV катетер, введенный в воротной вене, обеспеченных шва и подключен к перфузии трубки через кран. В. стекло пипеткой подключен к термос и стены всасывания для удаления перфузии жидкости дренаж из перерезанных IVC. I. кишечника. Л. печени.

Рисунок 3
Рисунок 3. Фазового контраста и иммунофлюоресценции пятно крысы портал фибробласты в культуре. Портал фибробластов культивировали в течение 1, 3 и 7 дней после изоляции были зафиксированы и окрашены для эластина, α-SMA и DAPI.

Discussion

Портал фибробласты играют важную роль в желчных фиброза. Здесь мы опишем модификацию оригинального протокола опубликованы Круглов и Dranoff 8 для изоляции портал фибробластов из печени крыс, предоставляя простой способ изучить этот популяции клеток в пробирке.

Этот подход использует пищеварения протеазы и размера на основе фильтрации. Основным преимуществом метода является то, что относительно чистые популяции клеток могут быть получены без перехода в культуре, что позволило изучение экспрессии генов или функциональное поведение клетки через несколько дней после изоляции. Этот метод также предоставляет возможности выделения клеток из здоровых и больных печень.

Одним из наиболее важных шагов в этом протокол ферментативного переваривания печеночной паренхимы. Для обеспечения успешного пищеварения, важно, чтобы убедиться, что кровь полностью вытекла из печени на начальной perfuСион, убедившись, что там даже побледнение печени. Для облегчения этой задачи можно использовать ватный тампон, чтобы массируют печень при перфузии. За-переваривания паренхимы печени приводит к низкой доходности жизнеспособных клеток, а при пищеварении, будет трудно отделить от паренхимы печени желчевыводящих путей. Поскольку препараты проназой есть различия в ферментативной активности между различными партиями, оптимизация количества, используемого может потребоваться, когда существует низкий выход жизнеспособных клеток.

Этот протокол может быть изменен для изоляции портал фибробластов из печени мыши или молодых печени крыс с помощью меньшего калибра IV катетер, чтобы вводить иглу воротной вены, уменьшая объем перфузионные растворы в пропорции к весу животного, а также снижение скорости перфузии печени до 10 мл / мин.

Портал фибробласты в культуре подвергаются myofibroblastic дифференциация в 10-14 дней, о чем свидетельствует α-SMA бывшийВыражение 9. Различные маркеры используются для различения портал фибробластов из печеночных звездчатых клеток, в том числе fibulin-2, IL-6, эластин, нуклеозид трифосфат diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), cofilin-1 и нейронов белки, такие как 2 синаптофизин, 6, 10, 11 . Мы обнаружили, что эластин является хорошим маркером для портала фибробластов, даже после myofibroblastic дифференциации, в то время как NTPDase2 теряется после портал фибробласты подверглись культуры через несколько дней 9. Таким образом, мы, как правило подтвердить изоляции портал фибробластов с помощью иммунофлуоресценции для окрашивания эластина.

Ограничение этого метода является то, что сразу после портал изоляции фибробластов, есть небольшая часть загрязняющих клеток, включая клетки Купфера и желчных клеток. Портал фибробластов перерастет эти загрязняющие клетки в течение 2-3 дней, однако, что дает относительно чистой населения (> 98%) 9.

СиNCE портал фибробласты в культуре подвергаются myofibroblastic дифференциация на ткани пластической культуры, мы обычно изучить эти клетки в течение 7 дней изоляции. Клетки хранятся в портал культуры фибробластов среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, как описано в разделе методов. Однако, эти клетки выживут в питательной среде, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки в течение нескольких дней. Мы обычно не используют низкие сыворотке СМИ по крайней мере 24 часов после изоляции. После портал фибробластов пройти myofibroblastic дифференциации, их можно пассировать в несколько раз и все как замороженные запасы миофибробласты.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа финансировалась NIH R01 DK05823 (в RGW), F32 DK083213 (для JWW), F30 DK081265 (в АОТ), а также грант от Фреда и Сюзанна Biesecker детской печени центра (в RGW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Type 2 Collagenase Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) LS004177
Pronase Roche (Indianapolis, IN) 70290120
Hyaluronidase Sigma (St. Louis, MO) H3506
Deoxyribonuclease Sigma D4527
DMEM/F12 Invitrogen (Carlsbad, CA) 11320
HBSS without Ca2+/Mg2+ Mediatech (Manassas, VA) 21-021-CM
HBSS with Ca2+/Mg2+ Mediatech 21-020-CM
Leibovitz's L-15 Invitrogen 11415
RPMI Medium 1640 Invitrogen 11875
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
Fetal Bovine Serum Gemini Bio (West Sacramento, CA) 900-108
Nitex Nylon Mesh 30 μm Genesee Scientific (San Diego, CA) 57-105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Parola, M., Marra, F., Pinzani, M. Myofibroblast - like cells and liver fibrogenesis: Emerging concepts in a rapidly moving scenario. Mol. Aspects Med. 29, 58-66 (2008).
  2. Dranoff, J. A., Wells, R. G. Portal fibroblasts: Underappreciated mediators of biliary fibrosis. Hepatology. 51, 1438-1444 (2010).
  3. Tuchweber, B. Proliferation and phenotypic modulation of portal fibroblasts in the early stages of cholestatic fibrosis in the rat. Lab Invest. 74, 265-278 (1996).
  4. Beaussier, M. Prominent contribution of portal mesenchymal cells to liver fibrosis in ischemic and obstructive cholestatic injuries. Lab Invest. 87, 292-303 (2007).
  5. Kinnman, N., Housset, C. Peribiliary myofibroblasts in biliary type liver fibrosis. Front Biosci. 7, d496-d503 (2002).
  6. Kinnman, N. The myofibroblastic conversion of peribiliary fibrogenic cells distinct from hepatic stellate cells is stimulated by platelet-derived growth factor during liver fibrogenesis. Lab Invest. 83, 163-173 (2003).
  7. Uchio, K. Cellular retinol-binding protein-1 expression and modulation during in vivo and in vitro myofibroblastic differentiation of rat hepatic stellate cells and portal fibroblasts. Lab Invest. 82, 619-628 (2002).
  8. Kruglov, E. A., Jain, D., Dranoff, J. A. Isolation of primary rat liver fibroblasts. J. Investig. Med. 50, 179-184 (2002).
  9. Li, Z. Transforming growth factor-beta and substrate stiffness regulate portal fibroblast activation in culture. Hepatology. 46, 1246-1256 (2007).
  10. Bosselut, N. Distinct proteomic features of two fibrogenic liver cell populations: hepatic stellate cells and portal myofibroblasts. Proteomics. 10, 1017-1028 (2010).
  11. Dranoff, J. A. The ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase NTPDase2/CD39L1 is expressed in a novel functional compartment within the liver. Hepatology. 36, 1135-1144 (2002).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics