El aislamiento de fibroblastos portales rata por

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Una técnica para aislar fibroblastos portales de hígado de rata se ha descrito. Los hígados se perfundieron y digerido

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Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion. J. Vis. Exp. (64), e3669, doi:10.3791/3669 (2012).

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Abstract

La fibrosis hepática se define por la deposición excesiva de matriz extracelular por miofibroblastos activados. Hay varios precursores de miofibroblastos hepáticos, incluyendo las células estrelladas hepáticas, fibroblastos portales y la médula ósea fibroblastos derivados 1. Las células estrelladas hepáticas han sido la mejor estudiada, pero fibroblastos portales son cada vez más como importantes contribuyentes a la piscina miofibroblastos, especialmente en la fibrosis biliar 2. Fibroblastos portales experimentan una proliferación en respuesta a lesiones del epitelio biliar, lo que podría jugar un papel clave en las primeras etapas de cicatrización biliar 3-5. Un método de aislamiento de fibroblastos portales permitiría estudio in vitro de esta población de células y conducir a una mayor comprensión del papel de los fibroblastos en la fibrosis portal jugar biliar.

Fibroblastos portal se han aislado mediante diversas técnicas, incluyendo derivación 6, 7 y Liperfusión ver con la digestión enzimática seguida por selección del tamaño de 8. La ventaja de la digestión y la técnica de selección de tamaño en comparación con la técnica consecuencia es que las células pueden ser estudiados sin la necesidad de pasaje en cultivo. Aquí se describe una versión modificada de la técnica original descrita por Kruglov y Dranoff 8 para el aislamiento de fibroblastos portales de hígado de rata que se traduce en una población relativamente pura de células primarias.

Protocol

Todo el procedimiento se lleva a cabo a temperatura ambiente a menos que se especifique lo contrario.

1. Preparación de las soluciones enzimáticas

  1. Preparar soluciones de enzima de acuerdo con la Tabla 1 y el filtro estéril utilizando un filtro de 0,22 micras. Mantener la solución 1 y 2 solución a temperatura ambiente y la solución 3 a 4 ° C hasta el momento de uso. Todas las soluciones y equipos que entran en contacto con células aisladas debe ser estéril.

2. Preparación del equipo de perfusión

  1. Cebe el sistema de perfusión con HBSS menos de Ca 2 + / Mg 2 +, que ha sido calentado a 37 ° C. Nota: Para asegurarse de que la perfusión es de 37 ° C cuando se llega al hígado, HBSS se calienta en un baño de agua a 37 ° C. Después pasa a través de la bomba de perfusión, y sale a través de un condensador de vidrio encamisado que está conectado a un conjunto de recirculación de agua a 40 ° C (Fig. 1).
  2. Esterilizar quirúrgico paraoles en un vaso de precipitados con etanol al 70%.

3. La perfusión del hígado

  1. Anestesie un adulto macho Sprague-Dawley, ratas por inyección intraperitoneal de Nembutal (50-100 mg / kg de peso corporal como sea necesario para obtener una anestesia adecuada).
  2. Colocar el animal en decúbito supino sobre una bandeja de plástico y fijar las extremidades de la bandeja con cinta adhesiva.
  3. Limpie el abdomen con un 70% de EtOH.
  4. Haga una pequeña incisión en la piel del abdomen en la línea media. Disecar la piel lejos de la fascia haciendo un gran corte en forma de U en el abdomen. Cortar el músculo abdominal con tijeras después de la misma forma para exponer la cavidad peritoneal.
  5. Exponer la vena porta mediante el uso de 2 hisopos de algodón para mover suavemente las vísceras abdominales hacia el lado derecho.
  6. Pase dos suturas estériles de seda 2.0 por debajo de la vena porta y corbata flojo.
  7. Canular la vena porta con un 16-18 de calibre del catéter IV y asegurar el catéter en su lugar apretando ligeramente la TIed suturas de la etapa anterior (fig. 2).
  8. Inyectar heparina diluida a través del catéter IV (1 ml de heparina 5000 unidades USP / ml se diluyó con 4 ml de HBSS menos 2 + Ca / Mg 2 +). El hígado debe blanquear.
  9. Conectar el catéter IV del sistema de perfusión. Perfundir con HBSS menos 2 + Ca / Mg 2 + a una velocidad de 20 ml / min durante 10 minutos. Transecto la VCI inferior al hígado para permitir el drenaje de la sangre y perfundido. Aspirar sangre acumulada de la cavidad abdominal.
  10. Cambiar el líquido de perfusión a una solución de colagenasa 0,3% (150 mg de colagenasa tipo 2 en 500 ml de HBSS más Ca 2 + / Mg 2 +) y perfundir durante 25 minutos. Mantenga la humedad del hígado cubriéndolo con la solapa previamente disecados abdominal. Ponga una cubierta placa de Petri sobre la solapa abdominal y la posición de una lámpara de calor sobre el área para mantener la temperatura intra-abdominal a aproximadamente 37 ° C.

4. Preparación de ªe árbol biliar

  1. Retire el hígado por sacarla de la cavidad abdominal con una pinza y colocarla en un plato de cultivo de tejidos estéril llena de L-15 de Leibovitz fría medios de comunicación.
  2. Trabajo en la campana de cultivo de tejidos, la cáscara de la cápsula hepática y suavemente burlarse del parénquima hepático, aparte con pinzas. Mueva el hígado a través de varios platos llenos de L-15 Liebovitz los medios de comunicación sin dejar de burlarse de distancia del parénquima, hasta que finalmente se fue con el árbol biliar aislada. El parénquima hepático es de color crema, mientras que el árbol biliar restante es blanco.
  3. Coloque el árbol biliar aislado en un tubo Falcon de 50 ml lleno con 10 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 UI / ml de penicilina y 10.000 mg / ml de estreptomicina); dejar en hielo durante 15 minutos.

5. Aislamiento de la fracción de fibroblastos portal

  1. Coloque el árbol biliar en un tubo estéril de 50 ml Falcon y picar con unas tijeras estériles.
  2. Añadir una pequeña cantidad de enzima Sollución # 1 en el tubo (aproximadamente 5 ml) y continuar para picar el árbol biliar hasta que alcanza la consistencia de una suspensión.
  3. Verter la mezcla en una botella de vidrio estéril. Lavar tubo Falcon con el resto de la solución n º 1, a continuación, se vierte en la botella de vidrio. Incubar a 37 ° C con agitación a 100 rpm durante 30 minutos.
  4. Se filtra la suspensión a través de un vaso de precipitados cubierto con una sola capa de malla de nylon (30-micras de tamaño de poro).
  5. Transferir cualquier tejido restante en la parte superior de la malla a una botella de vidrio estéril por lavado de la malla con una solución de enzima # 2. Empezar vertiendo medio (25 ml) de la solución en un estéril de 15 cm placa de Petri. Retirar con cuidado la malla del vaso de precipitados manteniendo los bordes de la malla sin contaminar el área central, a continuación, invirtiendo la malla y sumergiéndola en la solución en la placa de Petri para eliminar cualquier resto de tejido sobre la malla. Deseche la malla. Transferir la solución en la placa de Petri en una botella de vidrio estéril. Enjuague la placa de Petri con la remanando 25 ml de solución # 2 y transferirlo a la misma botella de vidrio. Incubar a 37 ° C con agitación a 100 rpm durante 30 minutos.
  6. Mientras tanto, tome el filtrado en el vaso y se vierte en un tubo Falcon de 50 ml. Centrifugar a 1.600 rpm (460 xg) durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  7. Aspirar medios y resuspender el sedimento en 25 ml de solución # 3.
  8. Tomar la solución de la etapa 5,5 y filtrar en un segundo vaso de precipitados estéril cubierta con 30-micras de malla.
  9. Deseche la malla. Centrifugar el filtrado a 1600 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Aspirar y resuspender el precipitado con 25 ml de solución # 3 como se hizo en el paso 5,7.
  10. Se combinan las fracciones de 2 pasos de 5.7 y 5.9 y centrifugar de nuevo a 1600 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente.
  11. Aspirar los medios de comunicación y resuspender el precipitado en 10 ml de portales de medios de cultivo de fibroblastos (DMEM/F12 suplementado con FBS al 10%, 1% penicilina / estreptomicina, gentamicina 0,3% y 0,2% fungizona).
  12. Contar las células para la viabilidad y la placa en placas de cultivo de tejidos. Dependiendo de la aplicación deseada, de 0,5 a 5 x 10 6 células por 10-cm placa de cultivo de tejidos son apropiados. Desde un adulto rata Sprague-Dawley, que típicamente obtener 2 a 10 millones de células viables.
  13. Vuelva a colocar los medios de cultivo al día siguiente para retirar los escombros no adherente. Posteriormente, reemplazar los medios de cultivo cada 2 días.

6. Los resultados representativos

Fibroblastos primarios portal aisladas a partir de hígado de rata adulta se muestran en 1, 3 y 7 días después del aislamiento (Fig. 3). Nótese que las células son alargadas, con una morfología típica de los fibroblastos. Las células pueden ser teñidas con anti-elastina de anticuerpos (CL55041AP, los laboratorios de Cedarlane, Burlington, Carolina del Norte) para confirmar la pureza. Fibroblastos Portal someterse a la diferenciación miofibroblástico en la cultura. Esto se puede demostrar por inmunotinción para actina de músculo liso-α (α-SMA; A2547, Sigma, St. Louis, MO).

0,3% de colagenasa solución Tipo 2 colagenasa 150 mg HBSS con Ca 2 + / Mg 2 + 500 ml Solución n º 1 (Pronasa) Albúmina de suero bovino 50 mg La colagenasa tipo 2 25 mg Pronasa 18 mg DNasa 3 mg DMEM/F12 47,5 ml Pen / Strep 1 ml Suero bovino fetal 1,5 ml Solución n º 2 Albúmina de suero bovino 50 mg (Hialuronidasa) La colagenasa tipo 2 25 mg Hialuronidasa 22 mg DNasa 3 mg DMEM/F12 47,5 ml Pen / Strep 1 ml Suero bovino fetal 1,5 ml Solución n º 3 DNasa 3 mg Medio RPMI 1640 50 ml

Tabla 1. Soluciones enzimáticas.

Figura 1
Figura 1. La perfusión de configurar. A. El agua de circulación para la columna de calentamiento. Columna B. que contiene los medios de comunicación de perfusión. C. llave de paso para controlar flujo de salida de la bomba. D. Bomba de entrada. E. de velocidad variable de la bomba peristáltica. F. frasco vacío con Bio-Clean detergente. G. lámpara de calor. H. El agua de baño para los medios de comunicación de perfusión calentamiento.

Figura 2
FiguRe 2. En perfusión in situ. A. Catéter IV insertada en la vena porta, se fija con sutura y conectado a la tubería de perfusión a través de llave de paso. B. pipeta de vidrio conectado a frasco de vacío y succión de pared para extraer el líquido de perfusión se escape hacia afuera de la vena cava inferior seccionado. I. intestinos. L. hígado.

Figura 3
Figura 3. El contraste de fases y de inmunofluorescencia tinción de fibroblastos portales de rata en cultivo. Portal fibroblastos cultivados durante 1, 3 y 7 días después de que el aislamiento se fijan y se tiñen de la elastina, α-SMA y DAPI.

Discussion

Portal fibroblastos juegan un papel importante en la fibrosis biliar. Aquí se describe una modificación del protocolo original publicado por Kruglov y Dranoff 8 para el aislamiento de fibroblastos portales de hígado de rata, proporcionando una manera sencilla para estudiar esta población de células in vitro.

Este método utiliza la digestión de proteasa y filtración tamaño basado. La principal ventaja del método es que una población relativamente pura de células puede obtenerse sin pasaje en cultivo, lo que permite el estudio de la expresión génica o el comportamiento funcional de células de varios días después del aislamiento. Esta técnica también ofrece la posibilidad de aislar las células de hígados sanos y enfermos.

Uno de los pasos más críticos de este protocolo es la digestión enzimática del parénquima hepático. Para garantizar una digestión éxito, es importante confirmar que la sangre se vacía completamente en el hígado durante el período inicial perfusiónsión, asegurándose de que no es aún escaldado del hígado. Para facilitar esto, es posible utilizar un hisopo de algodón para masajear suavemente el hígado, mientras que la perfusión. Durante la digestión de los resultados de hígado de parénquima en un bajo rendimiento de células viables, mientras que bajo-digestión hará que sea difícil separar el parénquima hepático del árbol biliar. Como los preparativos de pronasa una variabilidad en la actividad enzimática entre los diferentes lotes, la optimización de la cantidad utilizada puede ser necesaria cuando hay un bajo rendimiento de las células viables.

Este protocolo puede ser modificado para aislar fibroblastos portales de hígado de ratón o de hígado de rata joven mediante el uso de un calibre más pequeño catéter IV canular la vena porta, disminuyendo el volumen de las soluciones de perfusión en proporción al peso del animal, y la disminución de la tasa de perfusión del hígado a aproximadamente 10 ml / min.

Fibroblastos Portal de la cultura someterse a la diferenciación miofibroblástico en 10-14 días, como lo demuestra por el ex α-SMAdepresión 9. Diversos marcadores han sido utilizados para distinguir fibroblastos portales de las células estrelladas hepáticas, incluyendo fibulina-2, IL-6, elastina, los nucleósidos trifosfato diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), 1-cofilina y proteínas neuronales tales como sinaptofisina 2, 6, 10, 11 . Hemos encontrado que la elastina es un buen marcador de fibroblastos portales, incluso después de la diferenciación miofibroblástico, mientras NTPDase2 se pierde después de fibroblastos portales han sido sometidos a cultivo después de varios días 9. Por lo tanto, suelen confirmar el aislamiento de fibroblastos portales por la tinción de inmunofluorescencia para la elastina.

La limitación de esta técnica es que, inmediatamente después del aislamiento de fibroblastos portal, existe una pequeña fracción de contaminación de las células, incluyendo las células de Kupffer y células biliares. Fibroblastos portales se superan estas células contaminantes dentro de 2-3 días, sin embargo, dando una población relativamente puro (> 98%) 9.

Sina vez que los fibroblastos portal de la cultura someterse a la diferenciación miofibroblástico en plástico de cultivo de tejidos, por lo general estudian estas células dentro de los 7 días de aislamiento. Las células se mantienen en portal medios de fibroblastos de cultivo que contienen 10% de suero fetal bovino, como se describe en la sección de métodos. Sin embargo, estas células sobreviven en medio de crecimiento que contienen 2% de suero fetal bovino durante varios días. Por lo general no utilizan los medios de comunicación de baja de suero hasta por lo menos 24 horas después del aislamiento. Una vez fibroblastos portales someterse a la diferenciación miofibroblástico, pueden pasarse varias veces y se mantuvo como material congelado de miofibroblastos.

Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por el NIH R01 DK05823 (de pasarela residencial), F32 DK083213 (para JWW), F30 DK081265 (a ALO), y por una beca de la Fred y Suzanne Biesecker Centro de hepatología pediátrica (de pasarela residencial).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Type 2 Collagenase Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) LS004177
Pronase Roche (Indianapolis, IN) 70290120
Hyaluronidase Sigma (St. Louis, MO) H3506
Deoxyribonuclease Sigma D4527
DMEM/F12 Invitrogen (Carlsbad, CA) 11320
HBSS without Ca2+/Mg2+ Mediatech (Manassas, VA) 21-021-CM
HBSS with Ca2+/Mg2+ Mediatech 21-020-CM
Leibovitz's L-15 Invitrogen 11415
RPMI Medium 1640 Invitrogen 11875
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
Fetal Bovine Serum Gemini Bio (West Sacramento, CA) 900-108
Nitex Nylon Mesh 30 μm Genesee Scientific (San Diego, CA) 57-105

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References

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