Isolamento de fibroblastos de rato por Portal

Biology
 

Summary

Uma técnica para o isolamento de fibroblastos portal a partir de fígado de rato é descrito. Os fígados são perfundidos e digerido

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Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion. J. Vis. Exp. (64), e3669, doi:10.3791/3669 (2012).

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Abstract

Fibrose hepática é definida pela deposição excessiva de matriz extracelular por miofibroblastos activados. Existem múltiplas de precursores miofibroblastos hepáticas, incluindo as células estreladas hepáticas, fibroblastos de portal e medula óssea fibroblastos derivados 1. Células estreladas hepáticas ter sido melhor estudada, mas fibroblastos portal estão cada vez mais reconhecidos como importantes contribuintes para a piscina de miofibroblastos, particularmente na fibrose biliar 2. Fibroblastos de portal sofrer proliferação em resposta a uma lesão epitelial biliar, potencialmente desempenhando um papel fundamental nos estágios iniciais da cicatrização biliar 3-5. Um método de isolamento de fibroblastos de portal permitiria estudo in vitro desta população de células e conduzir a uma maior compreensão do papel fibroblastos de portal desempenhar na fibrose biliar.

Fibroblastos de portal foram isolados utilizando várias técnicas, incluindo excrescência 6, 7 e liperfusão ver com a digestão enzimática seguida de seleção de tamanho 8. A vantagem da digestão e técnica de selecção de tamanho em comparação com a técnica excrescência é que as células podem ser estudados sem a necessidade de passagem em cultura. Aqui, nós descrevemos uma versão modificada da técnica original descrita por Kruglov e Dranoff 8 para o isolamento de fibroblastos portal a partir de fígado de rato, que resulta em uma população relativamente pura de células primárias.

Protocol

Todo o procedimento é realizado à temperatura ambiente, a menos que especificado em contrário.

1. Preparação de soluções enzimáticas

  1. Preparam-se soluções de enzimas de acordo com a Tabela 1 e estéreis, utilizando um filtro de 0,22 um filtro. Manter a solução 1 e solução 2, à temperatura ambiente e uma solução de 3 a 4 ° C até ao momento de utilização. Todas as soluções e equipamentos que entram em contacto com as células isoladas devem ser estéreis.

2. Preparação da máquina de perfusão

  1. Primeiro o sistema de perfusão com HBSS menos Ca 2 + / Mg 2 +, que foi aquecido a 37 ° C. Nota: Para assegurar que o perfusato é de 37 ° C, quando chega ao fígado, HBSS é aquecida num banho de água ajustado para 37 ° C. Depois ela passa através da bomba de perfusão, ele passa por um condensador de vidro encamisado que está ligado a um conjunto circulador de água a 40 ° C (Fig. 1).
  2. Esterilizar cirúrgico paraóis em um copo com etanol a 70%.

3. Perfusão do Fígado

  1. Anestesiar um adulto de rato Sprague-Dawley machos por injecção intraperitoneal de Nembutal (50-100 peso corporal mg / kg, conforme necessário para se obter anestesia adequada).
  2. Coloque o animal em decúbito dorsal sobre uma bandeja de plástico e corrigir os membros para a bandeja com fita adesiva.
  3. Limpe o abdômen com EtOH 70%.
  4. Fazer uma pequena incisão na pele sobre o abdómen na linha média. Dissecar a pele para longe do painel frontal por meio de corte em forma de U grande no abdómen. Cortar o músculo abdominal com uma tesoura na sequência da mesma forma para expor a cavidade peritoneal.
  5. Expor a veia porta usando 2 cotonetes para mover suavemente as vísceras abdominais para o lado direito.
  6. Passe duas suturas de seda estéril 2.0 debaixo da veia porta e gravata frouxa.
  7. Canular a veia porta com um cateter calibre 16-18 IV e fixe o cateter no lugar apertando a ti vagamentesuturas ed a partir do passo anterior (Fig. 2).
  8. Injectar heparina diluída através do cateter IV (1 ml de unidades de heparina 5000 USP / ml diluído com 4 ml de HBSS menos Ca 2 + / Mg 2 +). O fígado deve branquear.
  9. Ligue o cateter IV para o sistema de perfusão. Perfundir com HBSS menos Ca 2 + / Mg + 2 a uma taxa de 20 ml / min durante 10 minutos. O transecto IVC inferior ao fígado para permitir a drenagem do sangue e do perfusato. Aspirar sangue reunidas a partir da cavidade abdominal.
  10. Alterar o fluido de perfusão a uma solução de colagenase 0,3% (150 mg de colagenase tipo 2 em 500 ml HBSS mais Ca 2 + / Mg 2 +) e perfundir durante 25 minutos. Manter a umidade do fígado, cobrindo-o com o retalho previamente dissecados abdominal. Colocar uma tampa placa de Petri sobre a aba abdominal ea posição de uma lâmpada de calor sobre a área a manter a temperatura intra-abdominal, aproximadamente 37 ° C.

4. Preparação do diae árvore biliar

  1. Remover o fígado, levantando-o para fora da cavidade abdominal com uma pinça e colocá-lo num prato de cultura de tecido estéril preenchido com L-15 de Leibovitz frio meios de comunicação.
  2. Trabalhando na capa cultura de tecidos, descascar a cápsula hepática e gentilmente burlar o parênquima hepático além com uma pinça. Mova o fígado através de vários pratos cheios de L-15 Liebovitz de mídia, enquanto continua a provocar longe do parênquima, até que finalmente saiu com a árvore biliar isolado. O parênquima hepático é castanhos claros, enquanto o restante da árvore biliar é branco.
  3. Coloque a árvore biliar isolado num tubo Falcon 50 ml cheia com 10 ml de penicilina / estreptomicina (10.000 UI / ml de penicilina e 10.000 ug / ml de estreptomicina); deixar em gelo durante 15 minutos.

5. Isolamento da fracção de Fibroblasto Portal

  1. Coloque a árvore biliar em um tubo de 50 ml estéril falcão e triture com tesoura estéril.
  2. Adicionar uma pequena quantidade de enzima solution # 1 para dentro do tubo (cerca de 5 ml) e continuar a picar a árvore biliar até atingir a consistência de uma massa pastosa.
  3. Verter a suspensão em um frasco de vidro estéril. Lavar a tubo de falcão com a restante solução # 1, depois despejar o frasco de vidro. Incubar a 37 ° C com agitação a 100 rpm durante 30 minutos.
  4. Filtra-se a suspensão através de um copo coberto com uma única camada de malha de nylon (30-micron de tamanho de poro).
  5. Transferir todo o tecido restante no topo da malha para uma garrafa de vidro estéril por lavagem da malha com solução de enzima # 2. Iniciar vertendo meia (25 ml) da solução para um prato 15 centímetros estéril Petri. Cuidadosamente remover a malha a partir do copo, segurando as bordas da malha sem contaminar a área central, em seguida, invertendo a malha e mergulhando-o na solução numa placa de Petri para remover qualquer tecido restante na malha. Descarte a malha. Transferir a solução numa placa de Petri em um frasco de vidro estéril. Lavar a placa de Petri com o remaIning 25 ml de solução # 2 e transferi-lo para a garrafa de vidro mesmo. Incubar a 37 ° C com agitação a 100 rpm durante 30 minutos.
  6. Enquanto isso, tome-se o filtrado no copo e despeje em um tubo falcon 50 ml. Centrifugar a 1600 rpm (460 x g) durante 5 minutos à temperatura ambiente.
  7. Aspirar meios de comunicação e ressuspender o pellet em 25 ml de solução de # 3.
  8. Tome a solução do passo 5.5 e filtrá-lo para um copo de segunda estéril coberto com 30 mícrons de malha.
  9. Descarte a malha. Centrifugar o filtrado a 1600 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente. Aspirar e ressuspender o sedimento com 25 ml de solução de # 3, como foi feito no passo 5.7.
  10. Combinar as fracções de 2 a partir de passos 5.7 e 5.9 e centrifugar de novo a 1600 rpm durante 5 minutos à temperatura ambiente.
  11. Aspirar meios de comunicação e ressuspender o pellet em 10 ml de meio de cultura de portal de fibroblastos (DMEM/F12 suplementado com 10% de FBS, fungizona 1% de penicilina / estreptomicina, gentamicina 0,3%, e 0,2%).
  12. Contar as células para a viabilidade da placa em pratos de cultura de tecidos. Dependendo da aplicação desejada, de 0,5 a 5 x 10 células por 6 10-cm placa de cultura de tecido são adequados. De um rato Sprague-Dawley adultos, que tipicamente obter 2 a 10 milhões de células viáveis.
  13. Substituir os meios de cultura, no dia seguinte para remover os detritos não-aderente. Em seguida, substitui os meios de cultura a cada 2 dias.

6. Os resultados representativos

Primárias fibroblastos de portal isoladas de fígado de rato adulto são mostrados em 1, 3 e 7 dias após o isolamento (Fig. 3). Note-se que as células são alongados, com morfologia típica de fibroblastos. As células podem ser coradas com anti-elastina anticorpo (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, NC) para confirmar a pureza. Fibroblastos de portal sofrem diferenciação miofibroblástico em cultura. Isto pode ser demonstrado por imunocoloração para α-actina de músculo liso (α-SMA; A2547, Sigma, St. Louis, MO).

Solução de colagenase 0,3% Colagenase tipo 2 150 mg HBSS com Ca2 + / Mg2 + 500 ml Solução # 1 (Pronase) Albumina de soro bovino 50 mg Colagenase tipo 2 25 mg Pronase 18 mg DNase 3 mg DMEM/F12 47,5 ml Pen / Strep 1 ml Soro fetal de bovino 1,5 ml Solução # 2 Albumina de soro bovino 50 mg (Hialuronidase) Colagenase tipo 2 25 mg Hialuronidase 22 mg DNase 3 mg DMEM/F12 47,5 ml Pen / Strep 1 ml Soro fetal de bovino 1,5 ml Solução # 3 DNase 3 mg Meio RPMI 1640 50 ml

Tabela 1. Soluções enzimáticas.

A Figura 1
Figura 1. Perfusão configurar. A. Circulação de água para a coluna de aquecimento. Coluna B. contendo mídia de perfusão. C. torneira controlar saída da bomba. D. Bomba entrada. E. bomba peristáltica de velocidade variável. F. frasco de vácuo com Bio-Clean detergente. G. lâmpada de calor. Água H. banho para a mídia de perfusão aquecimento.

A Figura 2
FIGUre 2. perfusão in situ. A. Cateter IV inserido na veia portal, fixada com sutura e ligado à tubagem de perfusão através torneira. B. vidro pipeta ligado ao frasco de vácuo e de sucção de parede para remover líquido de perfusão de drenagem de seccionado VCI. Intestinos I.. L. Fígado.

A Figura 3
Figura 3. De contraste de fase e imunofluorescência mancha de fibroblastos de rato de portal em cultura. Fibroblastos Portal cultivadas durante 1, 3 e 7 dias após o isolamento foram fixadas e coradas para a elastina, α-SMA e DAPI.

Discussion

Fibroblastos de portal desempenhar um papel importante na fibrose biliar. Descrevemos aqui uma modificação do protocolo original publicada por Kruglov e Dranoff 8 para isolar fibroblastos portal a partir de fígado de rato, proporcionando uma maneira simples para estudar esta população de células in vitro.

Esta abordagem utiliza a digestão da protease e baseada no tamanho de filtração. A principal vantagem do método é que uma população relativamente pura de células podem ser obtidas sem a passagem em cultura, permitindo que o estudo da expressão do gene ou o comportamento de células funcional vários dias após o isolamento. Esta técnica também oferece o potencial para isolar células de fígados saudáveis ​​e doentes.

Uma das etapas mais críticas neste protocolo é a digestão enzimática do parênquima hepático. Para assegurar uma digestão sucesso, é importante para confirmar que o sangue é completamente drenado para fora do fígado durante o perfusão inicialSion, certificando-se que há ainda de branqueamento do fígado. Para facilitar isto, é possível usar um cotonete para massagem suave do fígado, enquanto perfundindo. Mais de digestão de os resultados parênquima hepático em um baixo rendimento de células viáveis, enquanto sob a digestão-irá tornar mais difícil separar o parênquima do fígado a partir da árvore biliar. Desde os preparativos de pronase tem variabilidade na atividade enzimática entre diferentes lotes, a otimização da quantidade utilizada pode ser necessária quando há baixa produção de células viáveis.

Este protocolo pode ser modificada para isolar fibroblastos portal a partir de fígado de rato ou do fígado de ratos jovens usando uma menor bitola cateter IV para canular a veia portal, diminuindo o volume das soluções de perfusão em proporção ao peso do animal, e diminuindo a taxa de perfusão do fígado e cerca de 10 ml / min.

Fibroblastos em cultura de portal sofrem diferenciação miofibroblástico em 10-14 dias, como evidenciado por α-SMA expressão 9. Vários marcadores têm sido utilizados para distinguir os fibroblastos de portal a partir de células estreladas hepáticas, incluindo fibulin-2, IL-6, elastina, nucleósido-trifosfato difosfohidrolase-2 (NTPDase2), cofilina-1 e proteínas neuronais, tais como sinaptofisina 2, 6, 10, 11 . Nós descobrimos que a elastina é um bom marcador para fibroblastos de portal, mesmo após a diferenciação miofibroblástico, enquanto NTPDase2 é perdido após fibroblastos de portal tenham sido submetidos a cultura, após vários dias 9. Portanto, nós tipicamente confirmar o isolamento de fibroblastos portal pela técnica de imunofluorescência para elastina.

A limitação desta técnica é que, imediatamente após o isolamento de fibroblastos de portal, existe uma pequena fracção de contaminar células incluindo células de Kupffer e células biliares. Fibroblastos de portal outgrow estas células contaminantes dentro de 2-3 dias, no entanto, obtendo-se uma população relativamente puro (> 98%) 9.

Since fibroblastos do portal de cultura sofrem diferenciação miofibroblástico em plástico de cultura de tecido, que normalmente estudar estas células dentro de 7 dias de isolamento. As células são mantidas em meios de fibroblastos de portal de cultura contendo 10% de soro fetal bovino, como descrito na secção Métodos. No entanto, estas células irão sobreviver no meio de crescimento contendo 2% de soro fetal de bovino durante vários dias. Nós normalmente não usam meios de baixo custo de soro até pelo menos 24 horas após o isolamento. Uma vez que os fibroblastos de portal sofrem diferenciação miofibroblástico, eles podem ser passadas várias vezes e mantidos como stocks congelados de miofibroblastos.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 DK05823 (para RGW), F32 DK083213 (para JWW), F30 DK081265 (para ALO), e por uma concessão do Fred e Biesecker Suzanne Liver Center Pediátrica (para RGW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Type 2 Collagenase Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) LS004177
Pronase Roche (Indianapolis, IN) 70290120
Hyaluronidase Sigma (St. Louis, MO) H3506
Deoxyribonuclease Sigma D4527
DMEM/F12 Invitrogen (Carlsbad, CA) 11320
HBSS without Ca2+/Mg2+ Mediatech (Manassas, VA) 21-021-CM
HBSS with Ca2+/Mg2+ Mediatech 21-020-CM
Leibovitz's L-15 Invitrogen 11415
RPMI Medium 1640 Invitrogen 11875
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
Fetal Bovine Serum Gemini Bio (West Sacramento, CA) 900-108
Nitex Nylon Mesh 30 μm Genesee Scientific (San Diego, CA) 57-105

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References

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