Isolierung von Ratten-Portal Fibroblasten durch

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Eine Technik zur Isolierung Portal Fibroblasten aus Rattenleber beschrieben. Lebern werden perfundiert und verdaut

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Wen, J. W., Olsen, A. L., Perepelyuk, M., Wells, R. G. Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion. J. Vis. Exp. (64), e3669, doi:10.3791/3669 (2012).

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Abstract

Leberfibrose ist durch die übermäßige Ablagerung von extrazellulärer Matrix durch aktivierte Myofibroblasten definiert. Es gibt mehrere Vorläufer der hepatischen Myofibroblasten, einschließlich hepatische Sternzellen-, Portal-Fibroblasten und Knochenmark stammenden Fibroblasten ein. Hepatischen Sternzellen waren die am besten untersuchte, sondern Portal Fibroblasten werden zunehmend als wichtige Faktoren für die Myofibroblasten Pool anerkannt, insbesondere in biliären Fibrose 2. Portal Fibroblasten unterziehen Proliferation als Reaktion auf biliären Epithelzellen Verletzungen, möglicherweise eine wichtige Rolle spielen in den frühen Stadien der Gallenwege Narben 3-5. Ein Verfahren zur Isolierung Portal Fibroblasten in vitro-Studie würde dieser Zellpopulation ermöglichen und führen zu einem besseren Verständnis der Rolle Portal Fibroblasten spielen in biliären Fibrose.

Portal Fibroblasten wurden isoliert unter Verwendung verschiedener Techniken wie Auswachsen 6, 7 und liver. Perfusion mit enzymatische Verdauung von Größenauswahl 8 an. Der Vorteil der Verdauung und Größe Selektionstechnik gegenüber dem Auswachsen Technik ist, dass Zellen ohne die Notwendigkeit der Passage in Kultur untersucht werden können. Hier beschreiben wir eine modifizierte Version der ursprünglichen Technik von Kruglov und Dranoff 8 zur Isolierung von Portal Fibroblasten aus Rattenleber, dass in einer relativ reinen Population von primären Zellen beschriebenen Ergebnisse.

Protocol

Das gesamte Verfahren wird bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht anders angegeben.

1. Herstellung von Enzymlösungen

  1. Bereiten Enzymlösungen nach Tabelle 1 und Sterilfilter mit einer 0,22 um-Filter. Halten Lösung 1 und Lösung 2 bei Raumtemperatur und 3-Lösung bei 4 ° C bis zum Gebrauch. Alle Lösungen und Geräte in Kontakt mit isolierten Zellen müssen steril sein.

2. Herstellung von Perfusionsausrüstung

  1. Prime die Perfusion System mit HBSS minus Ca 2 + / Mg 2 +, hat die auf 37 ° C erwärmt Anmerkung: Um sicherzustellen, dass das Perfusat 37 ° C ist, wenn es in der Leber gelangt, HBSS in einem Wasserbad gesetzt wurden, auf 37 ° C erwärmt Nach dem Durchlaufen der Perfusionspumpe geht, geht es durch einen Glasgefäß Kondensator, der auf einen Wassergehalt Zirkulator ist auf 40 ° C (1) verbunden ist.
  2. Sterilisieren zu chirurgischenole in einem Becherglas mit 70% Ethanol.

3. Perfusion der Leber

  1. Anesthetize einen erwachsenen männlichen Sprague-Dawley-Ratten durch eine intraperitoneale Injektion von Nembutal (50-100 mg / kg Körpergewicht wie nötig, um eine adäquate Anästhesie zu erhalten).
  2. Platzieren Sie das Tier in Rückenlage auf einer Plastikschale und fixieren Sie die Gliedmaßen, um das Tablett mit Klebeband.
  3. Reinigen Sie den Bauch mit 70% EtOH.
  4. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut am Bauch in der Mittellinie. Präparieren der Haut weg von der Fascia, indem eine große U-förmigen Ausschnitt auf dem Bauch. Schneiden Sie die Bauchmuskeln mit einer Schere im Anschluss die gleiche Form, um die Bauchhöhle aussetzen.
  5. Setzen Sie die Pfortader durch Verwendung von 2 Wattestäbchen vorsichtig bewegen Sie die Bauchorgane an der rechten Seite.
  6. Führen Sie zwei sterile 2,0 Seidennähte unterhalb der Pfortader und locker binden.
  7. Kanülieren die Pfortader mit einer 16-18 Gauge IV-Katheter und sichern Sie den Katheter an Ort und durch Anziehen der lose tied Nähte aus dem vorherigen Schritt (2).
  8. Inject verdünnten Heparin durch die IV-Katheter (1 ml Heparin 5000 USP Einheiten / ml mit 4 ml HBSS minus Ca 2 + / Mg 2 + verdünnt). Die Leber sollte blanchieren.
  9. Verbinden Sie den IV-Katheter an die Perfusion System. Perfundieren mit HBSS minus Ca 2 + / Mg 2 + mit einer Geschwindigkeit von 20 ml / min für 10 Minuten. Durchschneiden die IVC inferior in die Leber um den Abfluss von Blut und Perfusat ermöglichen. Saugen Sie gepoolten Blut aus der Bauchhöhle.
  10. Ändern der Perfusionsflüssigkeit mit einer 0,3% Kollagenase-Lösung (150 mg Collagenase Typ 2 in 500 ml HBSS und Ca 2 + / Mg 2 +) und perfuse für 25 Minuten. Halten Sie das feuchte Leber, indem es mit dem vorher seziert Bauchlappen. Legen Sie eine Petrischale Abdeckung über dem Bauch-Klappe und die Position einer Wärmelampe über den Bereich um den intraabdominellen Temperatur bei etwa 37 ° C zu halten

4. Vorbereitung von the Gallenwege

  1. Entfernen Sie die Leber, indem Sie sie aus der Bauchhöhle mit einer Pinzette und legen Sie sie in einem sterilen Gewebekulturschale mit kaltem Leibovitz L-15-Medien gefüllt.
  2. Arbeiten in der Gewebekultur Kapuze, ziehen Sie die Leberkapsel und sie vorsichtig auseinander Leberparenchym mit einer Pinzette. Bewegen Sie die Leber durch verschiedene Gerichte mit Liebovitz die L-15-Medien gefüllt, während weiter entfernt das Parenchym zu necken, bis schließlich mit dem isolierten Gallenwege überlassen. Das Leberparenchym ist tan gefärbt, während die restlichen Gallenwege ist weiß.
  3. Setzen Sie den isolierten Gallenwege in ein 50 ml Falcon-Röhrchen mit 10 ml Penicillin / Streptomycin (10.000 IU / ml Penicillin und 10.000 ug / ml Streptomycin) gefüllt; verlassen auf Eis für 15 Minuten.

5. Die Isolierung der Fibroblasten-Portal Fraction

  1. Legen Sie die Gallenwege in ein steriles 50 ml Falcon-Röhrchen und Hackfleisch mit einer sterilen Schere.
  2. Eine kleine Menge an Enzym Solution Nr. 1 in das Rohr (etwa 5 ml) und weiterhin die Gallenwege Blatt, bis sie die Konsistenz einer Aufschlämmung erreicht.
  3. Gießen der Aufschlämmung in eine sterile Glasflaschen. Waschen Sie den Falcon-Röhrchen mit der verbleibenden Lösung Nr. 1, dann gießen Sie sie in der Glasflasche. Bei 37 ° C unter Schütteln bei 100 UpM für 30 Minuten.
  4. Filtern der Aufschlämmung durch ein Becherglas mit einer einzelnen Schicht aus Nylon-Mesh (30 Mikron Porengröße) abgedeckt ist.
  5. Übertragen jedes Gewebe verbleibenden auf dem Netz in einen sterilen Glasflasche durch Waschen der Eingriff mit Enzym-Lösung # 2. Starten durch Gießen Hälfte (25 ml) der Lösung in ein steriles 15 cm Petrischale. Vorsichtig das Gitter aus dem Becher durch die Ränder des Netzes ohne Kontamination der mittleren Bereich, dann invertierenden das Netz und Eintauchen in die Lösung in der Petrischale, um jegliches verbleibende Gewebe auf dem Netz zu entfernen. Entsorgen Sie die Maschen. Übertragen Sie die Lösung in der Petrischale in eine sterile Glasflasche. Spülen Sie die Petrischale mit der REMAining 25 ml Lösung Nr. 2 und überträgt es auf dem gleichen Glasflasche. Bei 37 ° C unter Schütteln bei 100 UpM für 30 Minuten.
  6. In der Zwischenzeit nehmen Sie die Filtrat im Kolben abgemessen und in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen. Zentrifugieren bei 1600 min (460 x g) für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  7. Saugen Sie Medien und das Pellet in 25 ml Lösung # 3.
  8. Nehmen Sie die Lösung aus Schritt 5.5 und filtern Sie sie in ein zweites steriles Becherglas mit 30-Mikron-Mesh abgedeckt.
  9. Entsorgen Sie die Maschen. Zentrifuge das Filtrat bei 1600 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Verwerfen und das Pellet mit 25 ml Lösung # 3, wie in Schritt 5,7 durchgeführt wurde.
  10. Kombinieren Sie die zwei Fraktionen aus den Schritten 5.7 und 5.9 und zentrifugieren bei 1600 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
  11. Saugen Sie Medien und das Pellet in 10 ml-Portal Fibroblastenkultur Medien (DMEM/F12 mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin, 0,3% Gentamycin und 0,2% Fungizon ergänzt).
  12. Zählen von Zellen für die Lebensfähigkeit und die Platte in Zellkulturschalen. Je nach der gewünschten Anwendung, sind 0,5 bis 5 x 10 6 Zellen pro 10-cm-Gewebekulturschalen Platte angebracht. Von einem erwachsenen Sprague-Dawley-Ratten, wir in der Regel erhalten 2-10.000.000 lebensfähigen Zellen.
  13. Ersetzen Sie die Kulturmedien am nächsten Tag an nicht-haftenden Schmutz zu entfernen. Danach ersetzen Kulturmedien alle 2 Tage.

6. Repräsentative Ergebnisse

Primäre Fibroblasten-Portal von erwachsenen Rattenleber isoliert werden nach 1, 3 und 7 Tage nach der Isolierung (3) gezeigt. Beachten Sie, dass die Zellen gestreckt sind, mit typischen Morphologie von Fibroblasten. Die Zellen können mit Anti-Elastin-Antikörper (CL55041AP, Cedarlane Labs, Burlington, NC) gefärbt werden, um Reinheit zu bestätigen. Portal Fibroblasten unterziehen myofibroblastischer Differenzierung in der Kultur. Dies kann durch Immunfärbung für α-smooth muscle actin (; A2547, Sigma, St. Louis, MO α-SMA) nachgewiesen werden.

0,3% Collagenase-Lösung Typ-2-Kollagenase 150 mg HBSS mit Ca 2 + / Mg 2 + 500 ml Lösung 1 (Pronase) Rinderserumalbumin 50 mg Collagenase Typ 2 25 mg Pronase 18 mg DNase 3 mg DMEM/F12 47,5 ml Pen / Strep 1 ml Fötales Rinderserum 1,5 ml Lösung # 2 Rinderserumalbumin 50 mg (Hyaluronidase) Collagenase Typ 2 25 mg Hyaluronidase 22 mg DNase 3 mg DMEM/F12 47,5 ml Pen / Strep 1 ml Fötales Rinderserum 1,5 ml Lösung 3 DNase 3 mg RPMI-Medium 1640 50 ml

Tabelle 1. Enzym-Lösungen.

1
Abbildung 1. Perfusion einrichten. A. Wasser-Thermostat für Erwärmung Spalte. B. Spalte mit Perfusion Medien. C. Hahn Steuerung Pumpe Abfluss. D. Pumpenzufluss. E. Drehzahlveränderbare Schlauchpumpe. F. Isolierkanne mit Bio-Clean Reinigungsmittel. G. Wärmelampe. H. Wasserbad zum Erwärmen Perfusion Medien.

2
FiguRe 2. In-situ-Perfusion. A. IV-Katheter in die Pfortader eingeführt, gesichert mit Naht und mit dem Infusionsschlauch über Hahn. B. Glas Pipette Thermosflasche und Wandabsaugung verbunden Perfusionsflüssigkeit Ablassen von durchtrennten IVC zu entfernen. I. Darm. L. Leber.

Abbildung 3
Abbildung 3. Phasenkontrast und Immunfluoreszenz von Ratten-Portal Fibroblasten in Kultur zu färben. Portal Fibroblasten für 1, 3 und 7 Tage nach der Isolierung kultiviert wurden fixiert und für Elastin, α-SMA und DAPI gefärbt.

Discussion

Portal Fibroblasten spielen eine wichtige Rolle in biliären Fibrose. Hier beschreiben wir eine Modifikation des ursprünglichen Protokolls von Kruglov und Dranoff 8 zur Isolierung Portal Fibroblasten aus Rattenleber und bietet eine unkomplizierte Möglichkeit, diese Zellpopulation in vitro Studie veröffentlicht.

Dieser Ansatz verwendet Proteaseverdau und Größe-basierte Filterung. Der primäre Vorteil des Verfahrens ist, dass eine relativ reine Population von Zellen ohne Passage in Kultur erhalten werden kann, so dass die Untersuchung der Genexpression oder funktionelle Verhalten der Zelle mehrere Tage nach der Isolierung. Diese Technik bietet auch das Potenzial zur Isolierung von Zellen aus sowohl gesunden und kranken Lebern.

Einer der wichtigsten Schritte in diesem Protokoll ist die enzymatische Verdauung des Leberparenchyms. Um eine erfolgreiche Verdauung zu gewährleisten, ist es wichtig, um zu bestätigen, dass das Blut vollständig aus der Leber abgeleitet während der anfänglichen PerfusionSion, indem sichergestellt wird, dass es sogar Blanchieren der Leber. Um dies zu erleichtern, ist es möglich, ein Wattestäbchen verwenden, um sanft massieren, während die Leber Perfusion. Mehr als-Verdau der Leberparenchym führt zu einer niedrigen Ausbeute von lebensfähigen Zellen, während sie unter-Verdau wird es schwierig, die Leberparenchym aus der Gallenwege zu trennen. Da Zubereitungen Pronase Variabilität in der enzymatischen Aktivität zwischen verschiedenen Chargen, Optimierung der Menge verwendet werden, haben kann notwendig, wenn es geringer Ausbeute von lebensfähigen Zellen werden.

Dieses Protokoll kann zum Isolieren Portal Fibroblasten aus Mausleber oder junge Rattenleber mit einem geringeren Durchmesser IV-Katheter, die Pfortader Kanülierung, Verringern des Volumens der Perfusionslösungen im Verhältnis zu Tiergewicht, und Verringern der Leber Perfusionsrate bis etwa 10 modifiziert werden ml / min.

Portal Fibroblasten in Kultur zu unterziehen myofibroblastischer Differenzierung in 10-14 Tagen, wie von α-SMA ex belegtpression 9. Verschiedene Marker wurden verwendet, um Portal-Fibroblasten von hepatischen Sternzellen, einschließlich Fibulin-2, IL-6, Elastin, unterscheiden Nukleosidtriphosphat Diphosphohydrolase-2 (NTPDase2), Cofilin-1 und neuronale Proteine ​​wie Synaptophysin 2, 6, 10, 11 . Wir haben festgestellt, dass Elastin ein guter Marker für Fibroblasten-Portal ist, auch nach myofibroblastischer Differenzierung, während NTPDase2 geht verloren, nachdem Portal Fibroblasten Kultur nach einigen Tagen 9 unterzogen worden sind. Deshalb haben wir in der Regel bestätigen Isolierung von Portal-Fibroblasten durch Immunfluoreszenzfärbung für Elastin.

Der Nachteil dieser Technik ist, dass unmittelbar nach Portal Fibroblasten isoliert, gibt es einen kleinen Bruchteil der kontaminierenden Zellen einschließlich Kupffer-Zellen und Gallen-Zellen. Portal Fibroblasten wird diese kontaminierenden Zellen in 2-3 Tagen zu klein wird, jedoch so dass ein relativ reine Population (> 98%) 9.

Since Portal Fibroblasten in Kultur myofibroblastischer Differenzierung durchlaufen auf Gewebekultur-Plastik, wir studieren diese Zellen normalerweise innerhalb von 7 Tagen der Isolation. Die Zellen werden in Portal Fibroblastenkultur Medium, das 10% fötales Rinderserum gehalten, wie in dem Verfahrensabschnitt beschrieben. Allerdings werden diese Zellen in Wachstumsmedium, enthaltend 2% fötales Rinderserum mehrere Tage überleben. Wir verwenden normalerweise keine niedrigen Serum-Medien bis spätestens 24 Stunden nach der Isolierung. Sobald Portal Fibroblasten myofibroblastischer Differenzierung durchlaufen, können sie mehrmals passagiert werden und gehalten als gefrorene Vorräte an Myofibroblasten.

Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom NIH R01 DK05823 (bis RGW), F32 DK083213 (bis JWW), F30 DK081265 (zu ALO), und durch einen Zuschuss aus dem Fred und Suzanne Biesecker Pediatric Liver Center (bis RGW) gefördert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Type 2 Collagenase Worthington Biochemical (Lakewood, NJ) LS004177
Pronase Roche (Indianapolis, IN) 70290120
Hyaluronidase Sigma (St. Louis, MO) H3506
Deoxyribonuclease Sigma D4527
DMEM/F12 Invitrogen (Carlsbad, CA) 11320
HBSS without Ca2+/Mg2+ Mediatech (Manassas, VA) 21-021-CM
HBSS with Ca2+/Mg2+ Mediatech 21-020-CM
Leibovitz's L-15 Invitrogen 11415
RPMI Medium 1640 Invitrogen 11875
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
Fetal Bovine Serum Gemini Bio (West Sacramento, CA) 900-108
Nitex Nylon Mesh 30 μm Genesee Scientific (San Diego, CA) 57-105

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References

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