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Immunology and Infection

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Summary

のメタボロームプロファイル

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Zinniel, D. K., Fenton, R. J., Halouska, S., Powers, R., Barletta, R. G. Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies. J. Vis. Exp. (67), e3673, doi:10.3791/3673 (2012).

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Abstract

結核菌は、地球規模での人間の死亡率の主要な原因である。両方のマルチ(MDR)と広範囲に(XDR)の薬剤耐性株の出現は、現在の疾病制御の努力を脱線させると脅している。したがって、現時点で入手可能なものよりも有効である薬やワクチンの開発が急務とされている。 Mのゲノム結核は、10年以上のために知られて、まだ遺伝子の機能と本質に関する我々の知識の重要なギャップがあるされています。多くの研究では、以来、遺伝子発現の全体的なパターンに対する薬剤、酸化剤、および増殖条件の影響を決定するためにトランスクリプトームとプロテオームの両方のレベルで遺伝子発現解析を用いてきた。最終的に、これらの変更の最終的な応答は、数千の小さな分子量の化学物質を含む細菌の代謝物に反映されています。未処理またはTRか、野生型と変異株の代謝プロファイルを比較特定の薬物とeated、効果的にターゲットの識別を可能にすることができ、抗結核活性を持つ新規阻害剤の開発につながる可能性があります。同様に、メタボローム上の2つ以上の条件の影響も評価することができる。核磁気共鳴(NMR)は代謝中間体を同定し、定量化するために使用される強力な技術です。このプロトコルでは、Mの準備のための手順NMRメタボローム解析のための結核の細胞抽出物が記載されている。代謝物の保全を最大にするために低温を維持しながら、細胞培養物は、適切な条件と必要な生物学的安全性レベル3封じ込め、1収穫の下で栽培され、機械的な溶解に供される。細胞溶解物を回収し、滅菌濾過し、超低温で保存されています。これらの細胞抽出物からのアリコートを、生細胞の有無を確認するためのコロニー形成単位のためのミドル7H9寒天上にメッキが施されています。 37℃でのインキュベーションの際に二ヶ月℃、無viの場合できるコロニーが観察され、サンプルが下流の処理のための封じ込め施設から削除されます。抽出物は、凍結乾燥重水素化緩衝液に再懸濁し、その後統計的分析に供されている分光データをキャプチャし、NMR装置に注入される。説明する手順は、1次元(1D)1 H NMRおよび2次元(2D)の1 H-13 C NMR分析の両方に適用することができます。この方法論は、クロマトグラフ法よりも信頼性の高い低分子量代謝物の同定と細胞抽出物の代謝物のより信頼性が高く、敏感な定量的な分析を提供しています。細胞溶解工程の後に記載された手順のバリエーションも平行プロテオーム解析に適合させることができる。

Protocol

1。プロトコルテキスト

このプロトコルは、MにNMRの方法論の適応を強調結核 (クラスIIIエージェント)。 M.を行う際そのため、生物学的安全性レベル3(BSL3)プラクティスが従う必要があります毎年認定された研究室での結核研究。実験室で生成されたエアロゾルへの暴露では、これらの微生物を扱う担当者が直面する最も重要な危険である。以下の手順は、我々の施設で行われているとバリエーションがインスティテューバイオセーフティ委員会の勧告に基づいて存在するかもしれません。共通の人員保護具は、タイベック·スーツ、フワフワヘアキャップ、ブーツ、N95マスク、目の保護具、スリーブ、ニトリル手袋の二重ペアで構成されます。 M.伴う作業オープンM結核培養および/ ​​または操作結核容器はタイプA2またはB2生物学的安全キャビネットの中で行われる。プラスチックで覆われた吸収紙はw上に配置され表面をorking。配置された、または施設から削除するすべての材料/消耗品は2バイオハザードバッグに入れ、オートクレーブで除染しなければなりません。キャビネット(FastPrep-24溶解ホモジナイザー、分光光度計、氷と一緒にバケツなど)内で利用される作業面および機器は、1%Amphyl(結核菌殺菌、殺真菌、および殺ウイルス剤)と各作業セッションの後に消毒しなければなりません。M.結核の文化は、このような冷凍庫、インキュベータ、遠心分離機、冷蔵庫などの生物学的安全キャビネットの外側に位置する大規模な機器への輸送のために二重の封じ込め下に置く必要があります。遠心分離は、付属の安全カップやOリングスクリュートップチューブを用いて行われる。 BSL3実験室外側にさらに分析するために、無細胞抽出液を15分間95℃で殺さ0.2μmのフィルターまたは微生物熱を通してろ過する。2サンプルは、前封じ込めからの削除にコロニー形成単位の有無を確認するためにめっきされる。

  1. ポリソルベート80を含むミドル7H9完全培地110ミリリットル(ツイーン80凝集を防ぐため)ブロス(MADC-TW)または250ミリリットルの三角フラスコに適当な媒体を転送します。 13 C-代謝産物を使用した場合3回の培養は、日常的条件ごとに成長しており、同一の培養は10 1D 1 H-NMRプロファイリングのために栽培されています。 2つの条件( 例えば 、薬物の添加の有無にかかわらず)の場合、レプリケート当たり文化の二重のボリューム、2つの同一の文化に成長して分割することができます。すべての試薬と溶液のレシピはプロトコルの端部に設けられている。
  2. Mの0.150ミリリットルとブイヨンに接種結核 50%グリセロールストック(氷上で解凍できます)。下記の注1を参照のこと。
  3. 文化は37℃で成長しましょう℃で約6日間(OD 600が 0.6から0.8)を100 rpmで振とう。下記の注2を参照してください。
  4. の抗生物質、代替の追加や、他の治療法が必要とされていない場合、培養は収穫する準備が整いました。治療法が使用されている場合は、引き続きそのまま5に進みます。汚染検査、表現型の解析、PCR検査:各フラスコから0.5mlのサンプルを削除し、4℃で遠心管と場所°文化滴定と品質管理のためのCに転送します。下記の注記3を参照のこと。この時点では、ステップ6に進みます。
  5. シェーカーからフラスコを取り出して、所望の治療( 例えば 、薬物や代謝物を追加)を行ってください。場所は、追加の期間( 例えば 、6月18日HR)のシェーカーでインキュベートに戻っフラスコ。この時間の終わりに、別の1.0 mlのアリコートを取り、OD 600を決定します 。各フラスコから0.5mlのサンプルを削除し、4℃で遠心管と場所°文化滴定と品質管理のためのCに転送します。
  6. 5分間氷上で培養を置きます。このステップの後、全体の残りのプロトコルを通して氷の上のセルのままにしておきます。 2000 xgで4℃で遠心分離によって収穫文化°卓上遠心機を用いて50 mlチューブで15分間インキュベートする。それぞれの文化はそれぞれ25ml(1の合計4本のチューブが必要になります00ミリリットル)を培養当たりわずか50ミリリットルが1D 1 H NMRの実験のために必要とされる十分な2D の1 H-13の信号対雑音C NMRの実験を、取得する必要があります。
  7. 上記の遠心分離パラメータで氷冷蒸留H 2 O(約15ミリリットル初めてで、10ミリリットル2回目)で各細胞ペレットを2回洗浄します。二回目の洗浄では、紡績前に同じチューブに10mlのアリコートを兼ね備えています。 1.0ミリリットル蒸留H 2 O(細胞ペレットのボリュームを調整する必要があります)の最終体積で細胞ペレットを再懸濁します。凝集のない単一細胞懸濁液は、この段階で希望する場合は、細胞が簡単に超音波処理および/または27ゲージ針に3回通しすることができます。あるいは、細胞ペレットを-80℃で凍結し、さらなる処理まで保存することができます。後者の場合には、凍結ペレットを再懸濁する前に氷上で解凍されています。前述のように1.0ミリリットルddH 2 Oを最終体積で細胞ペレットを再懸濁します。
  8. Transfe溶解マトリックスBを(0.1 mmのシリカ球)を含む2.0mlのスクリューキャップチューブにrを1.0 mlの細胞懸濁液。バイオセーフティキャビネット内FastPrep-24溶解ホモジナイザーを置きます。保持はチューブの上にプレートを固定してスポーク、試料ホルダーに試料を入れてください。 6メートル/秒の速度設定でホモジナイザーで60秒のサンプルを処理する。
  9. 15000 xgで4℃で遠心機でサンプルをスピン℃でペレット細胞破片と無傷の細胞への10分間。
  10. 滅菌チューブにシリンジフィルター(0.2μm)で上清とパスサンプルを取り除きます。 MADC寒天プレート上の試料の0.1ミリリットル(又は10%例えば、試料の代表的な割合は、)は、生細胞が存在しないことを確認します。捜査官はまた、複数の濾過工程を実施し、および/または任意の潜在的な生物学的安全性の懸念を防ぐか、または識別するように生きて死んで染色法を用いて抽出液中の生細胞の存在を確認することができる。格納するためにエタノール - ドライアイス浴でサンプルを凍結-80℃で、彼らはNMR施設で凍結乾燥して処理できるようになるまで。
  11. 2ヵ月後、コロニー形成単位の有無を確認するためにプレートを確認してください。ノーCFUのが発見された場合は、サンプルがBSL3実験室から取り出してもよい。さらなる分析は、通常、複数のユーザーにサービスを提供しないと、特定の封じ込めの要件の下で動作する標準的なNMR施設で行われる。
  12. 乾固した試料を凍結乾燥し、NMRのバッファとマイクロ遠心チューブに移す0.7mlに懸濁します。 13000×gで3分間遠心します。 0.6ミリリットルを外し、5mmのNMRチューブに移す。別の方法として、凍結乾燥試料は、非正規バイオハザードサンプルなどの外部施設に郵送することができます。
  13. NMRデータを直ちに収集されます。すべての予防措置にもかかわらず、活性酵素は、まだ存在していてもよいし、試料を長時間にわたって一般的に安定していません。サンプルはmに対して℃の室温または4で除外されたときにNMRスペクトルの変化が顕著である1週間以上の鉱石。また、NMRデータ収集は、サンプルがランダムに各カテゴリから選択され、未処理と薬物処理した培養の間に交互にされています。 NMRスペクトルが収集される前に特定のカテゴリには、長い遅延があったので、これは不要なバイアスを防ぐことができます。すべての未処理試料のNMRスペクトルが最初に収集され、その後薬剤処理されたサンプルが続いた場合に、データの偏りが発生します。サンプルは直ちにNMRにより分析することができない場合は、サンプルを-80℃で1 mlエッペンドルフチュー​​ブに格納する必要があります
  14. BACS-120サンプルチェンジャーにサンプルを挿入した後、そのようなロック、シム、調整、90°パルスの長さの最適化など、いくつかのルーチンの手順が含まれます測定器の校正は、結果の質を最大限に高めるために必要です。単一試料を90°パルスの長さを調整し、残りのサンプルのために楽器をチューニングするために使用されます。 、ロックシミング、すべてのサンプルのNMRデータ収集が自動化されたusinですグラムICONNMRとgradshim。
  15. 1D 1 H NMRスペクトルは、励起スカルプを使って水抑制とブルカーzgesgpパルスシーケンスを用いて収集されます。 32Kデータ5482.5Hzの掃引幅を持つ点、128スキャン、16ダミースキャンの合計が使用されます。 2Dの1 H-13 C HSQCスペクトルは、Bruker hsqcetgpパルスシーケンスを用いて収集されます。 5000.0 Hzの掃引幅を持つ2048個のデータポイントの合計は、直接1 Hの次元に沿って収集され、間接的な13 Cの次元に沿って、18864.9 Hzの掃引幅を持つ64のデータ·ポイントされています。スペクトルはノイズに良い信号を得るために128スキャンと16ダミースキャンで収集されます。

図1
図1実験手順のフロー図が示されている。

NMRのバッファ

50mMリン酸カリウムバフの原液50μMのTMSPとER:

  • 2.17グラムのK 2 HPO 4(二塩基性リン酸カリウム)
  • 1.70グラムのKH 2 PO 4(リン酸二水素カリウム)
  • 7.86 mgのナトリウム3 -トリメチルシリル(TMSP -2,2,3,3-D4(D、98%))
  • "100%" D 2 Oの500ミリリットルに溶解
  • 最終的な解決策は、pH 7.2(未補正)でなければなりません

MADC-TWまたはMOADC-TW(1L)

  • 4.7グラムミドル7H9ブロスをベース
  • 900ミリリットルddH 2 Oを
  • 2 mlのグリセロール
  • 25分間のコンポーネントおよびオートクレーブを混ぜる。 :次の解決策をタッチして追加するには、冷たい液体
  • MOADCを準備20mADCまたは100ミリリットルのOADCを準備する100ミリリットルのADC
  • 2.5ミリリットル20パーセントツイーン80(あるいは、非代謝20%チロキサポールの1ミリリットル)
  • 10ミリリットルの1%シクロヘキシミド

ADC(1L)

  • 20グラム、D(+) - グルコース
  • 50グラムのBSAフラクションV
  • 8.5グラムのNaCl
  • 800ミリリットルddH 2 Oを
  • 、一緒に溶かして1Lに音量を調整し、0.2μmのフィルターで滅菌します。 4℃で保存する

あるいは、OADC(1L)を調製し、1%のオレイン酸(下記レシピが250ミリリットルのバッチを作る)のプラス50ミリリットル上記のすべてのコンポーネントを追加します。 、一緒に溶かして1Lに音量を調整し、0.2μmのフィルターで滅菌します。ボトルは4℃でアルミ箔とストアにラップされている必要

  • 2.5グラムのオレイン酸
  • 250ミリリットル0.2MのNaOH
  • 55℃で加熱することによりオレイン酸(冷凍により固化)解凍し10分間インキュベートし、60分間撹拌しながらNaOH溶液と熱に追加します。アルミホイルに包まれている滅菌ガラス瓶に保管してください。 4でパラフィルムや店舗でシールボトル℃の

望ましい場合には、カタラーゼ充実と商業のBD BBLミドルADCまたはOADCを購入することができます。

1%のシクロヘキシミド(100ミリリットル)

  • 1グラムシクロヘキシミド
  • 100ミリリットルddH 2 Oを

溶解し、0.2μmのフィルターで滅菌します。 4℃で保存する注意:シクロヘキシミドは細心の注意を払って取り扱うように有毒である。

20%(v / v)のツイーン80(100ミリリットル)

  • 20ミリリットルのTween80
  • 80ミリリットルddH 2 Oを

の20%w / v溶液を調製し、これに代えて、Tween 80の20グラム(密度1.06グラム/ mlの約18.9ミリリットル)を重量を量る。 55への熱ソリューション℃で30分間溶解し、完全に混合するために。 0.2μmのフィルターと液体滅菌する。室温で最終的な解決に保管してください。

20%(v / v)のチロキサポール(100ミリリットル)

  • 20ミリリットルチロキサポール
  • 80ミリリットルddH 2 Oを

の20%w / v溶液を調製し、これに代えて、チロキサポールの20グラム(密度1.1グラム/ミリリットル約18.2ミリリットル)を重量を量る。ディ〜30分間55℃に熱ソリューションssolve、完全に混ぜる。 0.2μmのフィルターと液体滅菌する。室温で最終的な解決に保管してください。

1:Mのグリセロールストック結核は、以下プロトコルを用いて調製される。

Mのストッキング結核

  • Mを育てる飽和に50ミリリットルMADCの結核 (OD 600 = 1.5〜2.0)、37℃で振盪培養(100 rpm)の下。菌株によっては、これは7から14日かかります。
  • ペレット培養に15分間4℃で2000×gでサンプルをスピン。上清を除去します。
  • 滅菌した50%グリセロール6mlに懸濁します。
  • 4コーニングクライオバイアルやラベルを適切にアリコート1.5ミリリットル。
  • -80℃でエタノール/ドライアイス浴や店舗で直ちにフラッシュ凍結バイアル℃、

注2:接種菌H37Rv株(-80℃まで1.5歳からC株)MADCメディア70mlの中には、<OD 600が得られます/イノーバ40シェーカーで振盪培養(100 rpm)し下37℃で成長の5日後に約0.6のサブ>。

注3:文化の汚染をテストするには、捜査官は、標準のリッチ培地上の培養アリコートを接種し、一晩のインキュベーション後の成長の有無を確認することができます。日常的には、培養はコロニー形態を観察し、位相差顕微鏡で調べることMADC寒天上にメッキが施されています。必要に応じて、培養物を説明されているように6110プライマーIS用いたPCR法により確認することができます。3

2。代表的な結果

よく準備されたサンプルは、 図2に示されたものと同様のNMRスペクトルを得ることができます。このスペクトルは、Mの表現です結核野生型代謝プール。同定された代謝物は、直接的または間接的にD-アラニン経路に関連付けられています。また、ピーク強度の大きさは、現在の代謝物濃度に比例している細胞抽出インチしたがって未処理培養、薬物治療、および変異株の間でピーク強度の変化は、代謝産物及び代謝経路の乱れを示すことができます。 M.結核 1D 1 H NMRスペクトルは、三重共鳴、Z軸傾斜の冷凍器を備えたBruker Avanceの500MHzの分光計で収集した。スペクトルは、CAが含まれています。それはアミノ酸、ヌクレオチド前駆体、および解糖とクエン酸中間体を含む40から50の代謝物を同定し、定量化することが可能であったから400ピーク。ブルカーアイコンソフトウェアとBACS-120サンプルチェンジャーは、NMRのデータ収集を自動化するために使用された。 1D 1 H NMRスペクトルを効率的に(後続の主成分分析(PCA)または直交部分最小二乗法判別分析でアーティファクトを誘発する可能性があるベースラインのコレクションのための必要性をなくし、フラットなベースラインを溶媒を除去し、維持するために、励起スカルプ4を使用して収集されたOPLS- DA)。 1Dの1 H NMRスペクトルは5482.5 Hzと32Kのデータポイントのスペクトル幅で25℃で収集されます。 16ダミースキャンと128スキャンの合計は、スペクトルを得るために使用されていました。 ACDのラボ1D NMRのプロセッサのソフトウェアは、半自動的にすべての1D 1 H NMRスペクトルを処理するために使用されていました。スペクトルは、フーリエ変換、変換された段階的、かつTMSPピーク(0.0 ppm)のを基準とした。 NMRpipeソフトウェアパッケージは個別に2D の1 H-13 C NMRスペクトルを処理するために使用されるとNMRDrawで分析した。ブルカーFIDデータファイルが最初NMRpipeによって認識可能なファイル形式に変換した後、スペクトルはフーリエ変換された、位相補正し、0(ゼロ)を埋め込んだ。 1D 1 H NMRスペクトルおよび2D の1 H-13 C NMRスペクトルで観測されたNMRピークは、1 H、それぞれ0.05と0.50 ppmの13 C化学シフト公差、マディソンメタボロームコンソーシアムデータベース(MMCDを使用して、特定の代謝物に割り当てられている) BioMagResBank、6、ヒューマン·メタボローム·データベース。具体的に図7に示すように 、1次元と2次元NMRスペクトルは、NMRの化学シフトのピークリストがその後ヒューマン·メタボローム·データベースにアップロードする場合には、手動でピーク拾われます。ヒューマン·メタボローム·データベースによって同定された代謝物は、マッチングNMR共鳴の数を最大にし、代謝ネットワークに属する両方に基づいて、NMRスペクトルに割り当てられています。それぞれの化合物またはその代謝物は、通常、複数のCHのペアとそれに対応して複数のNMR共鳴を持っています。このように、実験的なNMRスペクトルで観察されるこれらのNMR共鳴のより、より多くの可能性代謝物が存在しています。同様に、同じ経路を関連付ける複数の代謝物を同定することは、正しい割り当ての可能性が高くなります。代謝物と代謝経路の存在が遺伝子およびゲノムの京都事典(KEGG)8とMetaCycデータベースで検証されています。9 マイコsmegmはATISはM.のための有用なモデル系である結核やその他のマイコバクテリア病原体。 Mの別の場所で説明したように、サンプルスメグマチスはまた、超音波処理により中断する可能性があります10

図2
図2 結核菌の細胞抽出物1D 1 H NMRスペクトル。代表的な代謝産物に関連付けられたNMRピークは標識される。略語は次のとおりです。AMP、アデノシンモノリン酸、α-KG、α-ケトグルタル酸、グルタミン酸、グルタミン酸、およびAla、アラニン。

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Discussion

研究のかなりの数がMのトランスクリプトームとプロテオームのプロファイルを分析してきたin vitroおよび in vivo条件下の様々な環境下で結核 。11月16日最終的には、遺伝子発現と酵素活性の変化は、小分子量の分子の濃度の変動につながる。これらの化合物の完全な説明は、メタボロームを構成している。このように、代謝経路に薬や様々な成長条件の影響は、メタボローム解析が続くかもしれません。17,18いくつかの研究ではM内代謝経路を研究するためにこの方法論を利用してきました結核 (下記参照)と他のマイコバクテリア、Mのいずれに感染したマウスにおける代謝の変化を分析する結核19

この方法論の潜在的な落とし穴は、試料中のいくつかの微生物が完全に溶解することがないかもしれないということです。必要であれば、溶解工程は、1つ以上を繰り返すことができます2回以上。溶解効率は、標準的なタンパク質アッセイ( 例えば 、バイオラッドDCプロテインアッセイ)を行うことにより監視することができます。低濃度で存在する代謝物の検出感度を向上させるには、いくつかの同一のサンプル(ステップ8で収集)、プールされた凍結乾燥し、小さい音量で再懸濁することができます。

マイコバクテリアにおけるメタボロミクス研究のための他のサンプル調製手順が記載されている。例としては、細胞の超音波処理により破砕、10,20ビーズ叩き、2021ジルコニアビーズを用いた均質化が含まれています。同様に、抽出手順のばらつきが酸性化アセトニトリルおよび/ ​​または他の有機溶剤を使用してきました。20,22-24代謝物の同定は、ガスクロマトグラフィー-質量分析(GC-MS)を含む様々な分析手順、24液体クロマトグラフィーによって達成されている質量分析(LC-MS)、21,23及び逆相高性能液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)。代謝物の25限られた数も同定および直接酵素決定によって定量化された図26のマイコバクテリアの細胞質抽出物に期待総代謝産物の数は不明であるが、22それは1692代謝物は枯草で同定されたことに留意されたいキャピラリー電気泳動法とMSによる抽出物を27

分析同定と定量手続きに関する重要事項は、メッツによって検討されています。NMR技術の28の利点は、試料調製の容易さと手続きの非破壊的な性質があります。しかし、化合物同定のために利用可能なスペクトルのデータベースは、これまで拡大していますが、まだ完全な代謝物の同定のためには不十分である。 GC-MSやLC-MSの方法は、それが困難なresul比較すること、より精巧なサンプル調製手順を必要とし、大きなばらつきがあるかもしれません異なる研究室からのTS。また、GC-MSは、あまり正確で定量化につながる材料で派生的な損失と代謝物誘導体化を必要とします。分離を改善し、LC-MSにおけるイオン化抑制を除去するための方法は、これらの問題のいくつかを克服することを約束します。それにもかかわらず、我々の意見では、この欠点は、やはり近い将来に重要な問題のままになります。さらに、そのような2D HSQC、2DとしてのNMRの方法論は、J-解決とSTOCSY実験はすでに代謝物の同定の効率化と正確性をもたらしている。29それにもかかわらず、NMRおよびLC-MSの手順は、補完的な手続きであると組み合わせた分析に統合される可能性が高いシステムメタボローム図28

、FastPrep-24溶解後のバッファシステムと手順の適切な修正を加えて、ここで説明した他の場所で説明されているように、プロテオーム解析に適応させることができるので30、結核resea試料調製手順rchersは野生型と組み合わせたシステム生物学的ア ​​プローチを包含する手順を用いて、種々の条件下で成長変異株からのサンプルを分析することができる。31これらの技術は、Mの中央代謝経路を分析することが不可欠であると判明した場合結核、32待ち時間のメカニズムを解明する必要があるかもしれないし、より良いワクチンや抗マイコバクテリア薬を開発するかの理解。この必要性は、特にMDRとのXDR結核の制御および治療 ​​法の文脈では、急務である。33,34

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgments

著者らは、プロトコルを開発しながら有益なコメントを博士バルレッタ博士とパワーズの研究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。我々は、原稿の役立つ議論と校正のためにウェンディオースティンに感謝します。本稿で説明する作業は、ネブラスカ州リンカーンレドックス生物学センター(親助成#NCRR 2P20RR 017675、D.ベッカー、PI)の大学から上記の各調査官にシードパイロット補助金によって賄われていた。加えて、我々は研究を供給し、このパブリケーションに含まNMR法を標準化するために、氏Halouskaの部分的な給与のサポートのために彼女のR21を助成(1R21AI087561-01A1)から資金を提供するための博士OFELIAチャコンに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212352
BACS-120 Sample Changer Bruker
Bruker Avance NMR Bruker 500 MHz
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Fraction V
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-15R Benchtop
Centrifuge Tubes Corning 430291 50 ml sterile polypropylene
Cryogenic Vials Corning 430488 2.0 ml sterile polypropylene
Cycloheximide A.G. Scientific C-1189 Toxic
D(+) - Glucose ACROS 41095-0010
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385
Erlenmeyer Flask VWR 89095-266 Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap
Flash Freeze Flask VWR 82018-226 750 ml
Freeze Dryer VWR 82019-038 4.5 L Benchtop
Glycerol GibcoBRL 15514-029
Incubator New Brunswick Innova 40 Benchtop shaker
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911-100
Lysis Machine MP Biomedicals FastPrep-24
Microcentrifuge Eppendorf 5415D Benchtop
Microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R Benchtop
Middlebrook 7H9 Broth Difco 271310
NMR tubes Norell ST500-7 5mM
OADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212351
Oleic Acid Sigma O1008
Potassium Phosphate Dibasic VWR BDH0266
Potassium Phosphate Monobasic VWR BDH0268
Rotor - Microfuge 22R Beckman Coulter F241.5P Sealed and polypropylene
Rotor - Allegra X-15R Beckman Coulter SX4750 With bio-certified covers
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 Cambridge Isotope DLM-48
Spectrophotometer Beckman Coulter DU-530
Spectrophotometer Cuvettes LifeLINE LS-2410 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides
Syringe Becton Dickinson 309585 Sterile, 3 ml Luer-Lok
Syringe Filter Nalgene 190-2520 0.2 μm sterile cellulose acetate
Tween 80 Fisher Scientific BP338-500

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References

  1. Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2 (2007).
  2. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1 (2007).
  3. Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).
  4. Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques. J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).
  5. Cui, Q. Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).
  6. Ulrich, E. L. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).
  7. Wishart, D. S. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).
  8. Kanehisa, M. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).
  9. Karp, P. D. Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes. Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).
  10. Halouska, S. Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase. J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).
  11. Boshoff, H. I. The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).
  12. Mehaffy, C. Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).
  13. Schnappinger, D. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another. Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).
  15. Shui, W. Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids. J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).
  16. Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).
  17. Forgue, P. NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity. J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).
  18. Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).
  19. Shin, J. H. NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).
  20. Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).
  21. de Carvalho, L. P. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).
  22. de Carvalho, L. P. Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase. Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).
  23. Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).
  24. Tang, Y. J. Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis. Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).
  25. Kweon, O. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).
  26. Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system. J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).
  27. Soga, T. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  28. Metz, T. O. The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery. Biomark Med. 1, 159-185 (2007).
  29. Ludwig, C., Viant, M. R. Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox. Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).
  30. Simpson, R. J. Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. Inglis, J. Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).
  31. Beste, D. J., McFadden, J. System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).
  32. Rhee, K. Y. Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier. Trends Microbiol. (2011).
  33. Who. Health Organization. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. (2008).
  34. Jassal, M., Bishai, W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).

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