Provberedning av

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Den metabolomic profil

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zinniel, D. K., Fenton, R. J., Halouska, S., Powers, R., Barletta, R. G. Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies. J. Vis. Exp. (67), e3673, doi:10.3791/3673 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis är en viktig orsak till dödsfall hos människor på en global skala. Framväxten av både multi-(MDR) och i stor utsträckning-(XDR) läkemedelsresistenta stammar hotar att spåra ur nuvarande insatser för sjukdomsbekämpning. Således finns det ett akut behov av att utveckla läkemedel och vacciner som är mer effektiva än de som för närvarande finns tillgängliga. Genomet av M. tuberkulos har varit känt i mer än 10 år, men det finns stora luckor i vår kunskap om geners funktion och essentiala. Många studier har sedan använt analys genuttryck på både transcriptomic och proteomik nivåer för att bestämma effekterna av droger, oxidanter och villkor tillväxt på den globala mönster av genuttryck. Ytterst är det slutliga svaret hos dessa förändringar avspeglas i den metaboliska sammansättningen av bakterien inklusive några tusen små molekylvikt kemikalier. Jämföra de metaboliska profilerna för vildtyp och mutanta stammar, antingen obehandlade eller treated med ett särskilt läkemedel, kan effektivt tillåta mål identifiering och kan leda till utveckling av nya inhibitorer med anti-tuberkulos aktivitet. Likaså, kan effekterna av två eller flera förhållanden på Metabolome också bedömas. Kärnmagnetisk resonans (NMR) är en kraftfull teknik som används för att identifiera och kvantifiera metaboliska intermediärer. I detta protokoll förfaranden för framställning av M. tuberkulos cellextrakt för NMR metabolomic analys beskrivs. Cellkulturer odlas under lämpliga förhållanden och som krävs biosäkerhetsnivå 3 inneslutning, skördade 1, och utsattes för mekanisk lys samtidigt kyla för att maximera bevarandet av metaboliter. Cellysaten återvinns, filtreras steriliserades och lagrades vid extremt låga temperaturer. Alikvoter från dessa cellextrakt stryks ut på Middlebrook 7H9 agar för kolonibildande enheter för att kontrollera frånvaron av viabla celler. Vid två månaders inkubation vid 37 ° C, om inget VIsom kan kolonier observeras, prover ur inneslutningen anläggning för efterföljande bearbetning. Extrakten lyofiliseras, återsuspenderas i deutererad buffert och injicerades i NMR-instrument, fånga spektroskopiska data som sedan utsätts för statistisk analys. De beskrivna förfarandena kan tillämpas för både endimensionella (1D) 1 H-NMR och tvådimensionella (2D) 1 H-13 C-NMR-analyser. Denna metod ger mer tillförlitlig liten molekylvikt metabolit identifiering och mer tillförlitliga och känsliga kvantitativa analyser av metabola cellextrakt kompositioner än kromatografiska metoder. Variationer av den procedur som beskrivits efter cellys steget kan också anpassas för parallell proteomic analys.

Protocol

1. Protokoll text

Detta protokoll belyser anpassning av NMR-metod till M. tuberkulos (klass III medel). Därför skyddsnivå 3 (BSL3) metoder måste följas vid genomförandet av M. tuberkulos forskning i ett år certifierat laboratorium. Exponering för laboratorie-genererade aerosoler är den viktigaste risk stött av personal som arbetar med dessa mikroorganismer. Följande förfaranden genomförs på vår institution och variationer kan förekomma utifrån institutionella biosäkerhet kommitténs rekommendationer. Vanliga personlig skyddsutrustning kommer att bestå av en Tyvek kostym, bouffant mössa, tossor, N95 andningsskydd, ögonskydd, ärmar, och en dubbel par nitrilhandskar. Arbete med M. tuberkulos kulturer och / eller manipulationer med öppen M. tuberkulos behållare utförs i typ A2 eller B2 biologiskt säkerhetsskåp. Plastöverdragen absorberande papper placeras på warbetsför yta. Allt material / varor för att destrueras eller tas bort från anläggningen måste placeras i två biohazard påsar och sanerade genom autoklavering. Arbetsytor och utrustning som används i skåpet (FastPrep-24 lys homogenisator, spektrofotometer, hink med is, etc) måste desinficeras efter varje arbetspass med 1% Amphyl (tuberkulocidala, bakteriedödande, svampdödande och virusdödande medel). M. tuberkulos kulturer måste placeras i dubbla inneslutning för transport till större utrustning placerad utanför biologiskt säkerhetsskåp som frysar, företagskuvöser, centrifuger och kylskåp. Centrifugering sker med slutna säkerhet koppar och O-ring skruvlock rör. För ytterligare analys utanför laboratoriet BSL3 är cellfria extrakt filtrerades genom ett 0,2 pm-filter eller mikroorganismer värmeavdödade vid 95 ° C under 15 minuter. Pläteras för att verifiera frånvaron av kolonibildande enheter före avlägsnandet från inneslutningen 2 Prov.

  1. Överför 110 ml Middlebrook 7H9 komplett medium innehållande polysorbat 80 (Tween 80 för att förhindra att klumpar) buljong (MADC-TW) eller ett lämpligt medium till en 250 ml E-kolv. Triplikatkulturer odlas rutinmässigt per tillstånd när du använder 13 C-metaboliter och tio identiska kulturer odlas för 1D 1 H NMR-profilering. För två villkor (t.ex., med och utan tillsats av läkemedel), dubbel volym kultur per replikat kan odlas och delas i två identiska kulturer. Alla reagens och lösningar recept i slutet av protokollet.
  2. Inokulera buljong med 0,150 ml av M. tuberkulos 50% glycerol lager (låt tina på is). Se not 1 nedan.
  3. Låt kulturen växa vid 37 ° C under skakning vid 100 varv per minut under cirka 6 dagar (OD 600 0,6-0,8). Se not 2 nedan.
  4. Om inga antibiotika, alternativa tillägg eller andra behandlingar behövs kulturerna är redo att skördas. Om behandlingar används, fortsätterdirekt till steg 5. Ta bort en 0,5 ml prov från varje kolv och överför till ett mikrocentrifugrör och placera vid 4 ° C för kultur titrering och kvalitetskontroll: föroreningar tester fenotypisk analys PCR-test. Se not 3 nedan. Vid denna punkt, fortsätt till steg 6.
  5. Ta kolvar från shakern och utför önskad behandling (t ex lägga läkemedel eller metabolit). Placera kolvar tillbaka i shakern och inkubera under ytterligare en period (t.ex. 6-18 timmar). Vid slutet av denna tid, ta en annan 1,0 ml alikvot och bestämma OD 600. Ta bort en 0,5 ml prov från varje kolv och överför till ett mikrocentrifugrör och placera vid 4 ° C för kultur titrering och kvalitetskontroll.
  6. Placera kulturer på is under 5 minuter. Efter detta steg, lämna cellerna på is under hela den återstående protokollet. Harvest kulturer genom centrifugering vid 2.000 x g och 4 ° C under 15 min i 50 ml rör med en bordscentrifug. Varje kultur kräver fyra rör med 25 ml vardera (totalt 100 ml krävs för att erhålla tillräcklig signal-till-brus för 2D 1 H-13 C-NMR-experiment, där endast 50 ml per odling krävs för 1D 1 H NMR-experiment).
  7. Tvätta varje cellpellet två gånger med iskall DDH 2 O (approximativt 15 ml första gången och 10 ml den andra gången) genom centrifugering parametrarna beskrivna ovan. För den andra tvättningen, kombinera de 10 ml alikvoter i samma rör innan spinning. Resuspendera cellpelleten i en slutlig volym av 1,0 ml DDH 2 O (behöver justera för cellpellet volym). Om en enda cellsuspension utan klumpbildning önskas vid detta steg, kan celler kortvarigt sonikerades och / eller passera genom en 27-gauge nål tre gånger. Alternativt kan cellpelleten frysas vid -80 ° C och lagrades tills ytterligare bearbetning. I det senare fallet, är frysta pelletar tinas på is före återsuspension. Återsuspendera cellpelletarna i en slutlig volym av 1,0 ml DDH 2 O såsom anges ovan.
  8. Transfer 1,0 ml cellsuspension till en 2,0 ml skruvlock rör innehållande lyseringslösning Matris B (0,1 mm kiseldioxidsfärer). Placera FastPrep-24 lys homogenisator inuti biosäkerhet skåpet. Sätt proverna i provhållaren, säkra retentionen talade plattan på toppen av röret. Behandla proverna för 60 sek i homogenisatorn vid en hastighetsinställning av 6 m / sek.
  9. Snurra proverna i en mikrocentrifug vid 15.000 x g och 4 ° C under 10 minuter för att pelletera cellrester och intakta celler.
  10. Avlägsna supernatanten och passerar prov genom ett sprutfilter (0,2 um) till ett sterilt rör. Platta 0,1 ml prov (eller en representativ del av provet, som till exempel 10%) på MADC agar för att kontrollera att det inte finns några livsdugliga celler. Utredarna kan också utföra mer än en filtreringssteg och / eller verifiera förekomsten av livskraftiga celler i extrakten med levande döda fläckar förfaranden för att förhindra eller identifiera eventuella biosäkerhet oro. Frys prover i ett etanol-torrisbad för att lagravid -80 ° C tills de är redo att lyofiliseras och bearbetas i en NMR-anläggning.
  11. Efter 2 månader, kontrollera plattor för att kontrollera frånvaron av kolonibildande enheter. Om ingen CFU hittas kan prover tas från BSL3 laboratoriet. Ytterligare analys görs i en standard NMR anläggning, som normalt tjänar multi-användare och arbetar under inga specifika inneslutningsåtgärder krav.
  12. Lyofilisera proverna till torrhet, sedan återsuspendera i 0,7 ml NMR-buffert och överför till ett mikrocentrifugrör. Centrifugera under 3 min vid 13.000 x g.. Avlägsna 0,6 ml och överföring till en 5 mm NMR-rör. Alternativt kan frystorkade prover skickas till en extern anläggning som icke-biologiskt reguljära prover.
  13. NMR-data samlas omedelbart. Trots alla försiktighetsåtgärder, kan aktiva enzymer fortfarande närvarande och provet är normalt inte stabila under långa tidsperioder. Förändringar i NMR-spektrum är märkbar när proverna lämnas i rumstemperatur eller vid 4 ° C för mmalm än 1 vecka. Dessutom är NMR-datainsamling alternerade mellan obehandlade och läkemedelsbehandlade kulturer, där prover slumpvis utvalda från varje kategori. Detta förhindrar onödig bias eftersom en viss kategori hade en längre fördröjning innan NMR-spektra samlades. En förspänning i data skulle inträffa om NMR-spektra för alla de obehandlade proverna uppsamlades först och sedan följs av de behandlade proven läkemedel. Om proverna inte kan omedelbart analyserades med NMR, bör proverna förvaras i 1 ml Eppendorf-rör vid -80 ° C.
  14. Efter insättning av proverna i en BACS-120 prov växlare, instrument kalibrering, vilket innebär några rutinmässiga steg som lås, Shim, melodi, och optimering av 90 ° pulslängden, krävs för att maximera kvaliteten på resultaten. En enda prov används för att kalibrera 90 ° pulslängden och stämma instrumentet för de återstående proven. Låsning, mellanlägg, och NMR datainsamling för varje prov är automatiserad using ICONNMR och gradshim.
  15. En 1D 1 H NMR-spektrum samlas med Bruker zgesgp pulssekvens med vatten dämpning med excitation skulptera. Totalt 32k datapunkter med ett svep bredd 5482.5Hz, 128 skanningar och 16 dummy genomsökningar används. En 2D 1 H-13 C-HSQC spektrum samlas med Bruker hsqcetgp pulssekvens. Totalt 2048 datapunkter med ett svep bredd 5000,0 Hz samlas längs den direkta 1 H dimension och 64 datapunkter med ett svep bredd på 18864,9 Hz längs den indirekta 13 C dimension. Spektrumet samlas med 128 skanningar och 16 skanningar dummy för att få bra signal till brus.

Figur 1
Figur 1. Ett flödesschema av de experimentella förfarandena avbildas.

NMR buffert

Stamlösning av 50 mM kaliumfosfat buffmans med 50 M TMSP:

  • 2,17 g K 2 HPO 4 (kalium dibasiskt)
  • 1,70 g KH 2 PO 4 (kalium monobasiskt)
  • 7,86 mg Natrium-3-rerat (TMSP-2 ,2,3,3-D 4 (D, 98%))
  • Lös i 500 ml "100%" D-2 O
  • Den slutliga lösningen bör vara vid ett pH 7,2 (okorrigerad)

MADC-TW eller MOADC-TW (1 L)

  • 4,7 g Middlebrook 7H9 buljong bas
  • 900 ml DDH 2 O
  • 2 ml glycerol
  • Blanda komponenterna och autoklav 25 minuter. Cool vätska att röra och lägg till följande lösningar:
  • 100 ml ADC när de förbereder MADC eller 100 ml OADC när de förbereder MOADC
  • 2,5 ml 20% Tween 80 (alternativt 1 ml icke-metaboliserbara 20% Tyloxapol)
  • 10 ml 1% cykloheximid

ADC (1 L)

  • 20 g D (+)-glukos
  • 50 g BSA FraktionV
  • 8,5 g NaCl
  • 800 ml DDH 2 O
  • Lös tillsammans, justera volymen till 1 liter och sterilisera med 0,2 um filter. Förvaras vid 4 ° C.

Alternativt, för att förbereda OADC (1 liter), lägga till alla komponenter som anges ovan plus 50 ml 1% oljesyra (recept nedan gör en 250 ml sats). Lös tillsammans, justera volymen till 1 liter och sterilisera med 0,2 um filter. Flaskan måste förpackas i aluminiumfolie och förvara vid 4 ° C.

  • 2,5 g Oljesyra
  • 250 ml 0,2 M NaOH
  • Tö oljesyra (stelnar vid kylning) genom upphettning vid 55 ° C under 10 minuter och tillsätt till NaOH-lösning och värme med omrörning under 60 minuter. Förvaras i sterila glasflaskor som är förpackade i aluminiumfolie. Seal flaskor med parafilm och förvara vid 4 ° C.

Om du vill kan du köpa kommersiella BD BBL Middlebrook ADC eller OADC med katalas anrikning.

1% Cykloheximid (100 ml)

  • 1 g cykloheximid
  • 100 ml DDH 2 O

Lös upp och sterilisera med 0,2 pm filter. Förvaras vid 4 ° C. Varning: cykloheximid är giftigt så hanteras med stor försiktighet.

20% (volym / volym) Tween 80 (100 ml)

  • 20 ml Tween 80
  • 80 ml ​​DDH 2 O

Alternativt, väger 20 g Tween 80 (ungefär 18,9 ml, densitet 1,06 g / ml), för att framställa 20% vikt / volym lösning. Värm lösningen till 55 ° C under 30 minuter för att lösa och blanda helt. Sterilisera vätska med ett 0,2 pm filter. Förvara den slutliga lösningen vid rumstemperatur.

20% (volym / volym) Tyloxapol (100 ml)

  • 20 ml Tyloxapol
  • 80 ml ​​DDH 2 O

Alternativt, väger 20 g Tyloxapol (ca 18,2 ml, densitet 1,1 g / ml), för att framställa 20% vikt / volym lösning. Värm lösningen till 55 ° C under 30 min till di-ssolve och blanda ordentligt. Sterilisera vätska med ett 0,2 pm filter. Förvara den slutliga lösningen vid rumstemperatur.

Not 1: Glycerol lager av M. tuberkulos framställs med användning av följande protokoll.

Stocking av M. tuberkulos

  • Grow M. tuberkulos i 50 ml MADC till mättnad (OD 600 = 1,5 till 2,0) vid 37 ° C under skakning betingelser (100 varv per minut). Beroende på stammen, kommer detta att ta 7-14 dagar.
  • Spin prover vid 2.000 xg vid 4 ° C under 15 minuter för att pelletera kulturen. Avlägsna supernatanten.
  • Återsuspendera i 6 ml steril 50% glycerol.
  • Alikvotera 1,5 ml i 4 Corning kryogena flaskor och etiketter lämpligt sätt.
  • Omedelbart flash frysa ampuller i etanol / torr isbad och lagra vid -80 ° C.

Not 2: ympa stam H37Rv (-80 ° C lager upp till 1,5 år gamla) till 70 ml MADC medium ger en OD 600 </ Sub> av ca 0,6 efter 5 dagars tillväxt vid 37 ° C under skakning betingelser (100 varv per minut) i en Innova 40 shaker.

Not 3: För att testa kultur föroreningar kan utredarna ympa en kultur alikvot på standard rikt medium och kontrollera frånvaro av tillväxt efter inkubation över natten. Rutinmässigt är kulturer ströks ut på MADC agar att observera kolonimorfologi och undersöka med faskontrastmikroskopi. Om så önskas, kan kulturerna verifieras genom PCR med användning av IS 6110 primrar såsom beskrivits. 3

2. Representativa resultat

Ett prov som är väl förberedd kommer att ge en NMR-spektrum som liknar den som visas i figur 2. Detta spektrum är en representation av M. tuberkulos vildtyp metabolisk poolen. De identifierade metaboliterna är direkt eller indirekt samband med D-alanin väg. Dessutom är storleken av toppintensiteter proportionell mot metabolitkoncentrationer presenterari cellextraktet. Därför förändringar i toppintensiteterna mellan obehandlade kulturer, missbruksbehandling, och mutantstammar kan tyda störningar i metaboliter och metabolismvägar. M. tuberkulos 1D 1 H-NMR-spektra uppsamlades på en Bruker Avance 500 MHz-spektrometer utrustad med en trippel-resonans, Z-axeln gradient Cryoprobe. Spektrumet innehåller ca. 400 toppar, från vilken det var möjligt att identifiera och kvantifiera 40-50 metaboliter, inklusive aminosyror, nukleotidprekursorer och glykolytiska och citronsyra intermediärer syra. En BACS-120 provbytare med Bruker Ikon mjukvara används för att automatisera NMR datainsamlingen. 1D 1 H-NMR-spektra uppsamlades med användning excitations skulptera 4 att effektivt avlägsna lösningsmedlet och upprätthålla en platt baslinje, eliminerar behovet för baslinje samling som kan inducera artefakter i efterföljande huvudkomponentanalys (PCA) eller ortogonal partiell minstakvadratmetoden diskriminantanalys (OPLS- DA). En 1D 1 H-NMR-spektrum uppsamlas vid 25 ° C med ett spektrum bredd av 5482,5 Hz och 32K datapunkter. Totalt 16 dummy avsökningar och 128 avsökningar användes för att erhålla spektrumet. ACD Labs 1D NMR-processor programvara användes för att halvautomatiskt bearbeta alla 1D 1 H NMR-spektra. Spektra var Fourier transformerad, fasas och refereras till TMSP toppen (0,0 ppm). Den NMRpipe mjukvarupaket användes för att individuellt behandla 2D 1 H-13 C-NMR-spektra och analyseras med NMRDraw. Bruker FID datafil först konverteras till ett filformat som känns igen av NMRpipe och sedan spektrum Fourier transformeras korrigerad fas och nollutfyllt. De observerade NMR-toppar i 1D 1 H-NMR-spektrum och 2D 1 H-13 C-NMR-spektrum är tillordnade vissa metaboliter med 1 H och 13 C kemiska skift toleranser av 0,05 och 0,50 ppm, respektive, och Madison Metabolomics Consortium databas (MMCD ), 6 och Human Metabolome databas. 7 Specifikt 1D och 2D NMR-spektra är manuellt topp-plockade, där topp listan över NMR kemiska skift sedan laddas upp till den mänskliga Metabolome databas. Metaboliterna som identifierats av Human Metabolome databasen tilldelas till NMR-spektrum baserat på både maximera antalet matchande NMR resonanser och tillhör en metabolisk nätverk. Varje förening eller metabolit har vanligtvis flera CH par och motsvarande flera resonanser NMR. Således, ju mer av dessa NMR-resonanser som observeras i den experimentella NMR-spektrum, desto mer sannolikt metaboliten är närvarande. Likaså identifiera flera metaboliter förknippar med samma väg ökar sannolikheten för rätt uppdrag. Förekomsten av metaboliter och metabolismvägar verifieras med Kyoto Encyclopedia of gener och genom (KEGG) 8 och MetaCyc databaserna. 9 Mycobacterium smegmATIS är ett användbart modellsystem för M. tuberkulos och andra mykobakteriella patogener. Såsom beskrivs på annat ställe, prover av M. smegmatis kan också sönderdelades genom sonikering. 10

Figur 2
Figur 2. 1D 1 H-NMR-spektrum av Mycobacterium tuberculosis cellextrakt. NMR toppar i samband med representativa metaboliter märkta. Förkortningarna är följande: AMP, adenosin mono-fosfat, α-kg, α-ketoglutarat, Glu, Glutamat, och Ala, alanin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ett stort antal studier har analyserat transcriptomic och proteomik profiler M. tuberkulos under ett flertal in vitro-och in vivo-betingelser. 11-16 Slutligen, förändringar i genuttryck och enzymaktivitet leda till variationer i koncentrationerna av lågmolekylära molekyler. Den fullständiga beskrivningen av dessa föreningar utgör Metabolome. Således kan effekten av droger och varierande förhållanden tillväxt på metaboliska vägar att följas av metabolomic analys. 17,18 Få studier har utnyttjat denna metod för att studera metaboliska vägar i M. tuberkulos (se nedan) och andra mykobakterier, eller analysera metabola förändringar i möss infekterade med M. tuberkulos. 19

En potentiell fallgrop för denna metod är att vissa mikroorganismer i provet kanske inte helt lyseras. Om nödvändigt, kan lys steget upprepas en ellertvå gånger. Lysis effektivitet kan övervakas genom att utföra en vanlig proteinanalys (t.ex. BioRad DC proteinanalys). För att öka detektionskänsligheten för metaboliter närvarande vid låga koncentrationer, kan flera identiska prover (samlats i steg 8) slås samman, lyofiliseras, och återsuspenderades i en lägre volym.

Alternativa provberedningsförfaranden för metabolomic studier i mykobakterier har beskrivits. Exempel inkluderar, cellsönderdelning genom ultraljudsbehandling, 10,20 pärla misshandel, 20 och homogenisering med Zirconia 21 pärlor. Likaså har variationer i extraktion används syrad acetonitril och / eller andra organiska lösningsmedel. 20,22-24 Metabolit identifiering har också uppnåtts genom olika analytiska förfaranden, inbegripet gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS), 24 vätskekromatografi- masspektrometri (LC-MS), 21,23 och omvänd fas vätskekromatografi med hög prestanda krommatography (RP-HPLC). har 25 Ett begränsat antal metaboliter också identifieras och kvantifieras enligt direkta enzymatiska bestämningar. 26 Även om antalet totala metaboliter förväntas i cytosoliska extrakt av mykobakterier är okänd, det 22 noteras att 1692 metaboliter identifierades i Bacillus subtilis extrakt av kapillärelektrofores och MS. 27

Viktiga frågor som rör analytisk identifiering och förfaranden kvantifiering har granskats av Metz et al. 28 Fördelar med NMR-teknik inkluderar enkel provberedning och den icke-destruktiva av förfarandet. De databaser tillgängliga spektra för förening identifiering, men ständigt expanderande, är fortfarande otillräcklig för full metabolit identifiering. Metoder för GC-MS-och LC-MS kan kräva mer avancerade procedurer provberedning och ha större variabilitet, vilket gör det svårt att jämföra Results från olika laboratorier. Dessutom kräver GC-MS metaboliten derivatisering med en följdskador i material som leder till mindre exakt kvantifiering. Metoder för att förbättra separationer och eliminera joniseringsdämpande i LC-MS lovar att övervinna några av dessa problem. Men i vår mening kommer denna nackdel fortfarande en viktig fråga inom en snar framtid. Dessutom NMR metoder som 2D HSQC, 2D J-löst och STOCSY experiment som redan resulterar i ökad effektivitet och noggrannhet i metabolit identifiering. 29 Ändå NMR och LC-MS-förfaranden är komplementära förfaranden och sannolikt kommer att integreras i en kombinerad analys av ett system Metabolome. 28

De provberedningsförfaranden beskrivs här, med lämpliga modifieringar av buffertsystem och steg efter FastPrep-24 lys, kan anpassas till proteomic analys som beskrivs på annat håll. 30 Således, tuberkulos researchers kan analysera prover från vildtyp och muterade stammar odlas under olika förhållanden med användning av förfaranden som omfattar kombinerade systembiologiska metoder. 31 Denna teknik skulle visa nödvändigt att dissekera de centrala metaboliska vägar av M. tuberkulos, 32 förståelsen av dessa kan vara nödvändiga för att klarlägga de latens, och att utveckla bättre vacciner och antimykobakteriella agenter. Detta behov är brådskande, särskilt i samband med kontroll och behandling av MDR och XDR tuberkulos. 33,34

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Författarna vill tacka alla medlemmar i laboratorier Dr Barletta och Dr Powers för värdefulla kommentarer och samtidigt utveckla protokollet. Vi tackar Wendy Austin för hjälp diskussioner och korrekturläsning av manuskriptet. Det arbete som beskrivs i detta manuskript har finansierats av bidrag utsäde pilotprojekt till varje utredare ovan från University of Nebraska-Lincoln Redox biologi Center (förälder bidrag # NCRR 2P20RR 017.675, D. Becker, PI). Dessutom tackar vi Dr Ofelia Chacon för att ge pengar från hennes R21 bidrag (1R21AI087561-01A1) för forskning leveranser och Mr Halouska partiella lön stöd för att standardisera NMR-tekniker som ingår i denna publikation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212352
BACS-120 Sample Changer Bruker
Bruker Avance NMR Bruker 500 MHz
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP1600-100 Fraction V
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-15R Benchtop
Centrifuge Tubes Corning 430291 50 ml sterile polypropylene
Cryogenic Vials Corning 430488 2.0 ml sterile polypropylene
Cycloheximide A.G. Scientific C-1189 Toxic
D(+) - Glucose ACROS 41095-0010
Deuterium Oxide Sigma Aldrich 617385
Erlenmeyer Flask VWR 89095-266 Sterile, flat base, polycarbonate, 0.22 μm PTFE membrane vented cap
Flash Freeze Flask VWR 82018-226 750 ml
Freeze Dryer VWR 82019-038 4.5 L Benchtop
Glycerol GibcoBRL 15514-029
Incubator New Brunswick Innova 40 Benchtop shaker
Lysing Matrix B MP Biomedicals 6911-100
Lysis Machine MP Biomedicals FastPrep-24
Microcentrifuge Eppendorf 5415D Benchtop
Microcentrifuge Beckman Coulter Microfuge 22R Benchtop
Middlebrook 7H9 Broth Difco 271310
NMR tubes Norell ST500-7 5mM
OADC Enrichment BD BBL Middlebrook 212351
Oleic Acid Sigma O1008
Potassium Phosphate Dibasic VWR BDH0266
Potassium Phosphate Monobasic VWR BDH0268
Rotor - Microfuge 22R Beckman Coulter F241.5P Sealed and polypropylene
Rotor - Allegra X-15R Beckman Coulter SX4750 With bio-certified covers
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-3
Sodium-3-trimethylsilylpropionate-2,2,3,3-D4 Cambridge Isotope DLM-48
Spectrophotometer Beckman Coulter DU-530
Spectrophotometer Cuvettes LifeLINE LS-2410 1.5 ml polystyrene, 2 clear sides
Syringe Becton Dickinson 309585 Sterile, 3 ml Luer-Lok
Syringe Filter Nalgene 190-2520 0.2 μm sterile cellulose acetate
Tween 80 Fisher Scientific BP338-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Larsen, M. H., Biermann, K., Tandberg, S., Hsu, T., Jacobs, W. R. Genetic Manipulation of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 2 (2007).
  2. Larsen, M. H., Biermann, K., Jacobs, W. R. Laboratory Maintenance of Mycobacterium tuberculosis. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 10, 1 (2007).
  3. Clarridge, J. E. 3rd, Shawar, R. M., Shinnick, T. M., Plikaytis, B. B. Large-scale use of polymerase chain reaction for detection of Mycobacterium tuberculosis in a routine mycobacteriology laboratory. J. Clin. Microbiol. 31, 2049-2056 (1993).
  4. Nguyen, B. D., Meng, X., Donovan, K. J., Shaka, A. J. SOGGY: solvent-optimized double gradient spectroscopy for water suppression. A comparison with some existing techniques. J. Magn. Reson. 184, 263-274 (2007).
  5. Cui, Q. Metabolite identification via the Madison Metabolomics Consortium Database. Nat. Biotechnol. 26, 162-164 (2008).
  6. Ulrich, E. L. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, 402-408 (2008).
  7. Wishart, D. S. HMDB: the Human Metabolome Database. Nucleic Acids Res. 35, 521-526 (2007).
  8. Kanehisa, M. KEGG for linking genomes to life and the environment. Nucleic Acids Res. 36, 480-484 (2008).
  9. Karp, P. D. Expansion of the BioCyc collection of pathway/genome databases to 160 genomes. Nucleic Acids Res. 33, 6083-6089 (2005).
  10. Halouska, S. Use of NMR metabolomics to analyze the targets of D-cycloserine in mycobacteria: role of D-alanine racemase. J. Proteome. Res. 6, 4608-4614 (2007).
  11. Boshoff, H. I. The transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action. J. Biol. Chem. 279, 40174-40184 (2004).
  12. Mehaffy, C. Descriptive proteomic analysis shows protein variability between closely related clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. Proteomics. 10, 1966-1984 (2010).
  13. Schnappinger, D. Transcriptional Adaptation of Mycobacterium tuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment. J. Exp. Med. 198, 693-704 (2003).
  14. Schnappinger, D., Schoolnik, G. K., Ehrt, S. Expression profiling of host pathogen interactions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another. Microbes. Infect. 8, 1132-1140 (2006).
  15. Shui, W. Quantitative proteomic profiling of host-pathogen interactions: the macrophage response to Mycobacterium tuberculosis lipids. J. Proteome. Res. 8, 282-289 (2009).
  16. Talaat, A. M., Lyons, R., Howard, S. T., Johnston, S. A. The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4602-4607 (2004).
  17. Forgue, P. NMR metabolic profiling of Aspergillus nidulans to monitor drug and protein activity. J. Proteome Res. 5, 1916-1923 (2006).
  18. Goodacre, R., Vaidyanathan, S., Dunn, W. B., Harrigan, G. G., Kell, D. B. Metabolomics by numbers: acquiring and understanding global metabolite data. Trends Biotechnol. 22, 245-252 (2004).
  19. Shin, J. H. NMR-based Metabolomic Profiling in Mice Infected with Mycobacterium tuberculosis. J. Proteome Res. 10, 2238-2247 (2011).
  20. Jaki, B. U., Franzblau, S. G., Cho, S. H., Pauli, G. F. Development of an extraction method for mycobacterial metabolome analysis. J. Pharm. Biomed. Anal. 41, 196-200 (2006).
  21. de Carvalho, L. P. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17, 1122-1131 (2010).
  22. de Carvalho, L. P. Activity-based metabolomic profiling of enzymatic function: identification of Rv1248c as a mycobacterial 2-hydroxy-3-oxoadipate synthase. Chem. Biol. 17, 323-332 (2010).
  23. Marrero, J., Rhee, K. Y., Schnappinger, D., Pethe, K., Ehrt, S. Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 9819-9824 (2010).
  24. Tang, Y. J. Central metabolism in Mycobacterium smegmatis during the transition from O2-rich to O2-poor conditions as studied by isotopomer-assisted metabolite analysis. Biotechnol. Lett. 31, 1233-1240 (2009).
  25. Kweon, O. A polyomic approach to elucidate the fluoranthene-degradative pathway in Mycobacterium vanbaalenii PYR-1. J. Bacteriol. 189, 4635-4647 (2007).
  26. Hasan, M. R., Rahman, M., Jaques, S., Purwantini, E., Daniels, L. Glucose 6-phosphate accumulation in mycobacteria: implications for a novel F420-dependent anti-oxidant defense system. J. Biol. Chem. 285, 19135-19144 (2010).
  27. Soga, T. Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. J. Proteome Res. 2, 488-494 (2003).
  28. Metz, T. O. The future of liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) in metabolic profiling and metabolomic studies for biomarker discovery. Biomark Med. 1, 159-185 (2007).
  29. Ludwig, C., Viant, M. R. Two-dimensional J-resolved NMR spectroscopy: review of a key methodology in the metabolomics toolbox. Phytochem. Anal. 21, 22-32 (2010).
  30. Simpson, R. J. Proteins and Proteomics: A Laboratory Manual. Inglis, J. Cold Spring Laboratory Press. 425-595 (2003).
  31. Beste, D. J., McFadden, J. System-level strategies for studying the metabolism of Mycobacterium tuberculosis. Mol. Biosyst. 6, 2363-2372 (2010).
  32. Rhee, K. Y. Central carbon metabolism in Mycobacterium tuberculosis: an unexpected frontier. Trends Microbiol. (2011).
  33. Who. Health Organization. Anti-tuberculosis Drug Resistance in the World: Report No. 4. (2008).
  34. Jassal, M., Bishai, W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis. Lancet Infect Dis. 9, 19-30 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics