לשעבר vivo הכנה מבודדת Microvessel השלד לחקירות תגובתיות כלי דם

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity. J. Vis. Exp. (62), e3674, doi:10.3791/3674 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הכנה microvessel מבודד הוא הכנה vivo לשעבר המאפשר בחינה של תרומות שונות של גורמים בקוטר כלי שליטה, וכך, התנגדות זלוף 1-5. זהו תכשיר ניסיוני קלאסי זה היה, במידה רבה, תיאר בתחילה על ידי אושידה et al. 15 לפני כמה עשורים. זה תיאור ראשוני סיפק את הבסיס הטכניקות שונה בהרחבה משופרת, בעיקר במעבדה של ד"ר בריאן Duling באוניברסיטת וירג'יניה 6-8, ואנחנו מציגים גישה הנוכחי בעמודים הבאים. הכנה זו באופן ספציפי מתייחסים עורקיק gracilis בחולדה כמו microvessel של בחירה, אבל ההכנה הבסיסית יכול בקלות להיות מיושם על כלי מבודדים מרקמת כמעט כל איבר אחר או על פני מינים 9-13. מכני (כלומר, מימדי) שינויים microvessels בודד יכול בקלות לעבור הערכהבתגובה מגוון רחב של פיזיולוגיים (למשל, לחץ היפוקסיה, intravascular, או גזירה) או אתגרים תרופתי, והוא יכול לספק תובנות לגבי האלמנטים המרכיבים מכניסטית תגובות המשולבים ללא פגע, אם כי רקמת vivo לשעבר. המשמעות של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת מניפולציה קליל של ההשפעות על תקנה משולבת של קוטר microvessel, תוך המאפשר שליטה של ​​רבים תרומות ממקורות אחרים, כולל לחץ intravascular (myogenic), עצבוב האוטונומית, hemodynamic ( למשל, מאמץ גזירה), גירויים התלויים או עצמאית אנדותל, הורמונליים, והשפעות parenchymal, כדי לספק רשימה חלקית. תחת תנאי הניסוי מתאימים ועם המטרות המתאימות, זה יכול להוות יתרון על פני in vivo או ברקמות / איברים ההכנות באתרו, שאינם מאפשרים בקלות עבור קליל של משתנים מערכתיות רחבות יותר.

תואר שניהגבלה יור הכנה זו היא למעשה תולדה של נקודות החוזק שלה. על פי ההגדרה, את ההתנהגות של הכלים האלה הוא נחקר בתנאים בהם רבים התורמים המשמעותיים ביותר בוויסות של התנגדות כלי הדם הוסרו, כולל עצבית, הלחות, חילוף החומרים וכו 'על כן, החוקר הוא הזהיר, כדי למנוע יתר פרשנות אקסטרפולציה של הנתונים אשר נאספו תוך שימוש בתכשיר זה. אזור משמעותי אחר של דאגה לגבי הכנה זו היא כי זה יכול להיות קל מאוד לגרום נזק לרכיבים תאיים כמו רירית האנדותל או השריר החלק בכלי הדם, כגון מקור משתנה הטעות יכול להיות מוצג. מומלץ מאוד כי החוקר הפרט לנצל מדידות מתאימים כדי להבטיח את איכות של התכשיר, הן התחלת הניסוי ומדי פעם במהלך כל פרוטוקול.

Protocol

1. לפני הניסוי

  1. לפני יום הניסוי, צינורות זכוכית נימי של ממדים המתאימים עבור תחנת נמשכים לתוך micropipettes (או חולץ אופקי או אנכי ניתן להשתמש). קוטר קצה ניתן להתאים בקלות בהתאם כלי בידוד, למרות שאנו בדרך כלל להשתמש במגוון קוטר בין 50-150 מיקרומטר. אלה מכופפים אז לתצורה המתאימה לחימום הבאה microvessel תחנת על אש בוטאן. טיפים micropipette שבורים פיזית קוטר משוער (עם מלקחיים עדינים) עבור microvessel המדובר ויכול הקרקע או מלוטשת על תצורות המתאימות, לפי הצורך עבור יישום ספציפי. לסקירה נרחבת מצטיין על הליכים אלה, הקורא מופנה דייויס ואח'. 16. שני micropipettes מונחים אל בעלי פיפטה עבור החדר microvessel באופוזיציה. אלה חייבים להיות מכוונים כך את הטיפיםהן במישור אנכי ואופקי אותו בתוך החדר כלי.
    תא microvessel להשתמש בכתב היד הזה (איורים 1 ו -2) הוא אחד כי הוא מותאם אישית שנבנה על ידי מר דוד Eick במחלקה לפיזיולוגיה בבית הספר לרפואה של ויסקונסין ( http://www.phys.mcw.edu/ ו www . eicktech.com ). עם זאת, תצורות אחרות של החדר microvessel זמינים מסחרית, עם אלה שפותחו על ידי מכשור מערכות חיות ( http://www.livingsys.com/ ) ו IonOptix ( http://www.ionoptix.com/ ) להיות נפוצה מאוד. באמצעות אלה למערכות אחרות, זה עשוי להיות הכרחי כדי לנצל מיקרוסקופ הפוכה ולא 1 זקוף המקובלת, אם כי זה תלוי בניסוי ספציפי ודרישות ציוד. השימוש של מיקרוסקופים הפוכה יהיה עדיף protoc ניסיוניOLS הדורשים הדמיה ניאון או confocal.
  2. הכן תמיסת מלח פיזיולוגית (PSS, המפורטים להלן) ולהבטיח pH מוגדר רמות מתאים תנאי הניסוי ספציפיים (7.38-7.42 אופייני ונופל בטווח הפיזיולוגי). פתרון PSS יכול להיות מוכן מראש ואת בקירור אלא יש לבדוק את הטמפרטורה המתאימה pH לפני השימוש. PSS יכול להכיל אלבומין אם הניסוי או פרוטוקולים ספציפיים דורשת את זה, אם כי זה לא חובה אוניברסלית.
  3. מחוגה וידאו דיגיטלי למדידת קוטר כלי צריך להיות מכויל באמצעות hemocytometer או בשלב מיקרומטר מיקרוסקופ. עבור כיול מדויק, היא חיונית, כי מיקרומטר להציב אותו מישור כמו יבוא / יצוא micropipettes בתא כלי.
  4. לולאות עניבה לחיבור microvessel על בטפי להחדרת נוזלים צריך להיות מוכנים ולהיות נגיש לשימוש מאוחר יותר. אלה יכולים בקלות להיות מוכן 8-0 או קטן יותר של עינייםuture. לולאה אחת עניבה אפשר להכין מראש ולאחסן בצלחת פטרי מכוסה על רצועת קטנה של סרט הפוך סביב שקופיות מיקרוסקופ עד הצורך (זה ישמור עליהם מפני אובדן). (איור 3).

2. יום של הניסוי

  1. כל הציוד התומך צריך להיות מופעל בדק לתפקוד תקין. זה כולל את השולחן anti-vibration/floating ואת אמבטיה במחזור מים מחוממת (ערוך לספק את הטמפרטורה המתאימה באמבטיה כלי - בדרך כלל 37 מעלות צלזיוס), כל מתמרים הלחץ וחדר כלי משאבת הניקוז (איור 1A ו-1B). הפעל את הגזים איזון בתא כלי והן perfusate ואת מאגרי superfusate.
  2. למלא את כל המאגרים, צינורות, ותאי עם פתרון PSS. קו perfusate המוביל פיפטה יבוא חייב להיות מלא לחלוטין, כדי למנוע את נוכחותו של בועות אוויר בתחום הזה אשר יכול לסלק נזק VAscular האנדותל (איור 1 ג). במידת הצורך, להשתמש המזרק בעדינות את PSS לאורך כל הדרך פיפטה כדי להבטיח כי הוא מלא לחלוטין וללא חסימה שעלול לעכב זרימת perfusate. הלחץ יבוא צריך להישמר בגבולות סבירים כדי למנוע נזק מתמרים לחץ.

3. Microvessel קצירת

  1. בעקבות anesthetizing של החיה שממנה microvessel היא שיש לנקוט, כלי המדובר אמור להיות מבודד פי הנהלים המתאימים ביותר vasculature להיחקר. במקרים מסוימים, זה עשוי לדרוש הסרת איברים עצמו (למשל, microvessels מוחין או הכליליים), ואילו באחרים, כלי ניתן להסיר ישירות חיה הרדים (למשל שריר). למשל נטייה של כלי בתוך השריר gracilis מוצגת באיור 4. לאמוד את אורכו של כלי השיט in vivo לפני הסרת איתוceps ובמדי הקוטר או קטנים. לפני הסרת כלי מבעל חיים / איברים, זה יכול להיות מועיל מאוד לבצע בדיקה סופית נוספת כדי לוודא קאמרית כלי מוכן כהלכה (כולל את כל לולאות עניבה במקום).
  2. הסר את כלי מבעל חיים / איבר ידי אחיזה בצד החיצוני של הספינה בקצה אחד עם מלקחיים עדינים חיתוך לאורכו של כלי השיט עד שהוא חופשי, לקחת בזהירות רבה, כדי למנוע כל מושך או מושך את האוניה. לשחרר פעם אחת, מיד למקם אותו צינור צנטריפוגות 1.7 מ"ל מלא PSS אבל לא לוותר על הספינה. זה לזכור את הכיוון, כך כיוון perfusate באמבטיה יהיה זהה לכיוון זרימת הדם בתוך החיה.

4. Cannulating כלי השיט

  1. מניחים את כלי באמבטיה מלאה ו cannulate סוף הפרוקסימלי על פיפטה יבוא. זה יכול להיות מושלם הטוב ביותר עם שיעור זלוף צנוע באמצעות צינורית (~ 50 מ"מ כספית בלחץ) וזוג מלקחיים עדינים נהג להחזיק כל צד של כלי הפרוקסימלי לומן קיר (כלומר, זוג מלקחיים בכל יד). במעבדה שלנו, אנו משתמשים מלקחיים עדינים בין כלי מדעי בסדר ( http://www.finescience.com/Home.aspx ), אם כי כל מלקחיים שנבנו בהתאם יעבוד ביעילות. להחליק את הכלי על קצות הצינורית ולקדם את הספינה על קצה עד לנקודה שבה שתי לולאות עניבה יכולה לאבטח את כלי השיט.
  2. להעלות את הלחץ יבוא על 75 מ"מ כספית ~ להמשיך לנפח את הספינה ולאפשר cannulation על קצה דיסטלי פיפטה. זרימה דרך כלי יש לראות עיוות במאגר superfusate על יצוא של כלי דיסטלי (תחת מיקרוסקופ). Cannulate סוף דיסטלי של כלי השיט על פיפטה יצוא ולאבטח את זה עם שתי לולאות לולאות עניבה (אלה האחרונים צריך להיות במקום לפני cannulation, איור 5).
  3. כוון את צינורית עד שבשנת קואורדינטות XYZ כמו needeD עד שלא יהיה עיוות מינימלי בכלי, ואת כלי אומדן של אורך vivo. להעלות את הלחץ יבוא עד שהוא אומדן של שיעור לחץ הדם הממוצע חווה בדרך כלל על ידי מגזר זה כלי (במעבדה שלנו מנצל 80% של לחץ הדם הממוצע עבור arterioles התנגדות גדולה של שרירים gracilis 8).
  4. מניחים אבן קטנה מבעבע אספקת תערובת הדלק המתאים לאמבטיה ופלסטיק במקום לעטוף או כיסוי זכוכית על פני החדר, כדי למנוע מתיז את עדשת המיקרוסקופ. אנו משתמשים אבן מבעבע זה זמין בדרך כלל על חיית המחמד כל / חנויות האקווריום הוא כ 1 ס"מ קוטר, אם כי גודל קטן יותר תעבוד בצורה יעילה גם כן. נוכחות של אבן מבעבע מבטחת זמינות הגז המתאים לכלי בכל עת ירחיבו הכדאיות כלי. אבן זו תוסר במהלך כל תקופת המדידה (או זרימת אוויר דרך אבן קטעה באופן זמני), כדי למנוע עיוות שלהתמונה. שחרר את מהדק על פיפטה יצוא ולאפשר זרימה דרך כלי השיט במשך 30 דקות. מעת לעת, זרימת יש הידק את צינורות יצוא כדי לקבוע אם כלי מפתחת הטון מנוחה. כל כלי יש לבדוק אם קיימת דליפה של לחץ בשלב זה. דליפות יהיה ניכר על ידי החדרת הלחץ ידועה לכלי (אנחנו בדרך כלל להשתמש 100-120 מ"מ כספית) ו מהדק את תזרים, ואחריו יבוא, קווים. אם הלחץ intraluminal יציב, אין הדלפות ניכר. עם זאת, אם הלחץ מתחיל לרדת, דליפה משמעותית נוכח והוא חייב להיסגר. הדלפות על יבוא או בטפי להחדרת נוזלים תזרים בדרך כלל, ניתן לתקן על ידי הוספת לולאה נוסף קשור סביב הספינה על פיפטה. לחלופין, אם כלי יש ענף צדדי קטן, כי הוא מאפשר דליפה, זה יהיה להתפשר על יכולת כלי להכיל את הלחץ באופן יעיל והוא יכול להציג את מקור נוסף לטעויות. אם זו דליפה מזוהה, זה יכול להיות קשור בדרך כלל את wלולאה ith אחת של תפר 10-0 opthalmic. לחלופין, גדיל בודד התגרו מ תפר 6-0 לעשות את הלולאה עניבה הוא גם יעיל מאוד. אם הדליפה לא ניתן לזהות או לא יכול להיות קשור בצורה יעילה את (למשל, אין גזע לענף בצד ופשוט חור בקיר כלי), זה עלול להוביל לסיום מוקדם של ניסוי ושימוש של כלי חלופי להיות הצורך (זה בדרך כלל כלי זהה ברגל השנייה - או הצד הנגדי אם יש צורך - של בעל חיים).

    הכלי צריך להיות מותר לאזן בשום תנאי הזרימה עבור מינימום של 30 דקות. כל הניסויים נערכים תחת שום תנאי הזרימה. ברגע כלי פיתחה צליל משביע רצון, והוא מגיב על קריטריוני ההכללה של הניסוי האמור, כלי מוכן המחקר שלאחר מכן.

    אלה קריטריוני ההכללה יכול להשתנות בהתאם לפרוטוקול הניסוי החוקר ספציפית. במעבדה שלנו, אנחנו באופן שגרתי UTilize את הפעולות הבאות:
    1. הטון פעיל של> 30% (כפי שחושב ΔD / D מקס x 100, שם ΔD היא העלייה בקוטר arteriolar הקיר הפנימי מהערכים בלחץ איזון בתגובה חשיפה Ca 2 + ללא PSS ו-D מקס הוא לכל היותר קוטר נמדד בלחץ איזון בין 2 Ca + ללא PSS).
    2. הפעלת Myogenic (תחזוקה, או עדיף ירידה, קוטר arteriolar עם לחץ מוגבר intraluminal) כמדד של שכבת השריר כלי דם קיימא חלקה.
    3. רירית האנדותל קיימא, כפי שמעידים תגובה מהירה מרחיב את האצטילכולין (10 -6 M באמבטיה).
    4. קריטריוני ההכללה ניתן להוסיף כדי להתאים את פרוטוקול הניסוי ספציפי לפי הצורך, כולל התגובות נחש ל אגוניסטים adrenergic כגון phenylephrine (10 -7 מ '), מרחיב התגובות לגירויים נוספים, כגון אדנוזין (10 -5 2 בגז איזון).
  5. הסעיף הבא הוא דוגמה של "ניסוי מדומה". כל הפתרונות הנדרשים מוכנים על פי הצורך, עם תשומת לב שילם לחשבון גורם לדילול של PSS בתא כלי. לדוגמה, עבור חלק מהציוד שלנו, נפח תא כלי השיט הוא 20 מ"ל. כמו μl, כגון 20 של מספר 10 -2 פתרון ז התוצאות המניות ריכוז יעיל של M 10 -5 באמבטיה קאמרית כלי. בעקבות הסרת כלי איזון, cannulation ואימות כמתואר לעיל, הניסוי הוא מוכן להתחיל. פרטים כגון אקראיות הטיפול ויעילות הן ספציפיות הניסוי היו צורכים שטח מוגזמת למאמץ זה. לפיכך, אלה אינם נכללים בפירוט.

    התגובות הראשוניות בקרה נחושים. עבור גירוי פיזיולוגי כמו למשל הפעלת myogenic (לחץ הנגרמת התכווצות), intralumenal יחסי ציבורessure משתנה באופן אקראי בטווח הרצוי, כלי מותר תקופת הזמן המתאים להגיב (במקרה זה, היינו לאפשר תקופת 5-7 דקות). לגירוי למשל תרופתי כגון האתגר עם אצטילכולין, התרופה תתווסף חזרה מפתרונות מניות בסדר אקראי. במקרה כזה, היינו משתמשים בו בדרך כלל נע בין 10 ל -9 מ -5 10 באמבטיה, עם סחף להיות מוגדר שיקום בקוטר איזון. כמו אצטילכולין הוא סוכן לפעול מהר, תגובות מרחיב מקסימלי יכול בקלות להיות מושגת רק כמה שניות. סוכנים אחרים (כגון פפטידים) יכול לקחת עוד הרבה זמן כדי לעורר תגובה מקסימלי וזה הרבה יותר לקחת בחשבון, כמו גם פרק הזמן שלוקח סחף יעיל. אחת התגובות שליטה כבר נאסף, התערבויות ספציפיות ניתן להטיל על המערכת, כולל הדגירה של כלי השיט עם אגוניסטים לקולטן / היריבים, סוכנים הפועלים על תעלות יונים מסוימות, ביוזמתה שלהלחץ intraluminal שונה, הבדלים גזים איזון תרופתי או סוכנים המכוונים מערכות אנזימטיות מסוימות, אם למנות כמה מן ההתערבויות הנפוצות ביותר.

    לאחר זמן מתאים להתערבות יעילה (אשר יש לבדוק כראוי), בסיבוב הבא של איסוף הנתונים יכול להיות יזם. בהתאם לפרוטוקול הניסוי הספציפי, התערבויות הבאים ניתן להטיל על כלי השיט או 1 ניתן להסיר (או על ידי סחף - הסרת או פשוט אתגר פיזיולוגי - ריאלי כאשר). ברגע כלי חזר למצב איזון שלה (שאמור להיות מאומת), התערבויות הבאים ניתן ליישם לפי הצורך עם נתונים נוספים שנאספו. הליך זה בכלל היה נמשך עד תום הניסוי או עד איכות הכנת כלי יורדת מתחת סף הקריטריונים שנקבעו בעבר (למשל, בתגובה אגוניסט או את היכולת לפתח את הטון פעיל מספיק). בשלב זה, הניסוי הסתיים או כך, או חוקר מומלץ לאסוף מידע שאינו תלוי תגובתיות של כלי בודד (כמו המכניקה של הקיר כלי, אשר ניתן לבצע באמצעות ההליך זהה של הפעלת myogenic, רק עם כלי חסר כל צליל פעיל 14).
  6. ניקוי קבוע של כל ציוד חיוני להסרת הצטברות מלח ומניעת צמיחה של כל ישויות ביולוגיות בלתי רצויות. בסופו של יום הניסוי, לכל הפחות, את כל קווי ותאי סמוקות לחלוטין עם כמויות עצומות של מים מזוקקים או דה מיונן של PSS ואפשרו לו להתייבש לחלוטין. אחרי כל 2-3 ימים של שימוש, לשטוף עם אתיל אלכוהול מבוצע גם והציוד מותר לייבוש מלא. בסופו של כל שבוע של שימוש רציף, קווים כל ותאי מלאים חומצה הידרוכלורית 0.1 מ ', מותר "דגירה" במשך 30 דקות ולאחר מכן לשטוף היטב במים לעיל. לבסוף,בסופו של 2-3 שבועות של שימוש רציף, כל החלקים של צינורות מוחלפים חדש קאמרית מאגרי מנקים עם 1.0 מ 'HCl ואחריו רב שטיפה עם מים מזוקקים / דה מיונן. אם כל שינוי צבע של הקמת צינורות או חזותי של צמיחה בצינור או כל אלמנט של תא / מאגרים אלה מוחלפים או ניקוי יסודי על פי הצורך. עם ניקוי קבוע ותחזוקה כללית, ציוד יכולה להימשך זמן רב מאוד. בזמן כתיבת שורות אלה, לתאי כלי שלנו הם כולם לתוך ה שלהם 8 או 9 שנים ה של שימוש שגרתי ואנחנו חווים כל קושי משמעותי איתם.

5. נציג תוצאות

איור 1 א
איור 1 א. נתון זה מציג את ההגדרה הבסיסית תחנת microvessel. טלוויזיה = עבור כלי צפייה, B = מחוגה דיגיטלית, C = מזרק על שדחף superfusate thr פיפטה ough יבוא לפי הצורך; D = טור ההידרוסטטי לשינוי הלחץ יבוא perfusate: E = מיקרוסקופ, F = microvessel קאמרית, G = superfusate המאגר, H = לחץ צג (מרובים ניתן להוסיף לפי הצורך), אני = microvessel קאמרית משאבת הניקוז עבור superfusate: J = גז איזון מיכל תערובת, K = בזבוז הכיל (על superfusate): L = דוד במחזור מים; M = שולחן anti-vibration/floating.

איור 1 ב '
איור 1 ב. נתון זה מציג מבט קרוב יותר של הגדרת תא microvessel. בנתון זה, E = מיקרוסקופ, F = microvessel קאמרית, H = צג הלחץ (בעוד אנו מציגים רק לשם הפשטות, רב ניתן להוסיף אתרים שונים בהתאם לצורך), אני = microvessel משאבת תא הניקוז, צינורות N = מחובר מאוד תחילת פיפטה יבוא perfusate (המשך מ 'ד' באיור 1 א); צינורות מ = מצורף פיפטה יצוא perfusate.

class = "jove_content"> איור 1 ג
איור 1 ג. נתון זה מציג את הנוף הקרוב ביותר של החדר microvessel. בנתון זה, N = קו perfusate (כלומר, צינורות מחוברים ישירות פיפטה יבוא perfusate); מ = צינור המחובר ישירות פיפטה יצוא perfusate, P = הפקדים המיקום האופקי והאנכי עבור פיפטה יבוא, ש = superfusate לרוקן את האמבטיה במים (מחובר "אני" במספרים 1A ו-1B), R = יבוא על אמבט מים באים מן המאגר (מחובר 'G' באיור 1 א).

איור 2
איור 2. נתון זה מהווה ייצוג סכמטי של זרימת נוזלים וגזים במערכת. בנתון זה, PSS = יבוא superfusate קו, ב = PSS קו perfusate על יבוא פיפטה, C = PSS superfusate בריחת מהאמבטיה לבזבז מיכל: D = PSS יצוא perfusate מ פיפטה יצוא: E = קלט מים חמים אל תוך המעיל קאמרית: F = תפוקת מים חמים מן המעיל קאמרית.

איור 3
3. איור נתון זה מציג את הקשר היחיד לולאות עשוי תפר עיניים (נצפים מבעד למיקרוסקופ לנתח עם eyepieces 10x ו הגדלה 4.5x זום מתכווננת, לוח) המשמשים בהכנת שלנו אחסון של לולאות עניבה מספר 8-0 ו 10-0 תפר בקלטת הפוך סביב המיקרוסקופ שקופית אשר מאוחסן בצלחת פטרי מכוסה (כדי להימנע מאיבוד אותם; לוח ב ').

איור 4
איור 4. נתון זה מספק תמונה (נצפים מבעד למיקרוסקופ לנתח רגילה) של עורקיק התנגדות השריר gracilis לפני הבידוד והסרה כירורגית, כדי לאפשר התמצאות מרחבית נכונה.

ve_content "> איור 5
איור 5. נתון זה מספק תמונה מייצגת של microvessel cannulated. לוח מראה לכל אורכה של הספינה, עם יבוא גם (א) ו יצוא (ב ') בטפי להחדרת נוזלים, כמו גם לולאות עניבה (ג) הראו. לוח ב 'מציג את התמונה בהגדלה גבוהה, מראה בבירור את הנחישות של הקוטר הפנימי arteriolar עם מחוגה דיגיטליות (במקרה זה הקוטר הוא 112 מיקרומטר).

איור 6
איור 6. נתון זה מציג תמונות מייצגות של איזון microvessel cannulated הבאה. התמונה העליונה היא של כלי תחת שליטה, unstimulated תנאי בלחץ איזון היא התמונה האמצעית היא של כלי אותו בעקבות התרחבות לאתגר עם אצטילכולין (10 -6 M באמבטיה), והתמונה התחתונה היא של כלי כי בעקבות constriction כדי לאתגר עם phenylephrine (10 -7 M באמבטיה).

איור 7
. איור 7 נתון זה מסכם את התגובות של microvessel מבודד בתגובה לאתגר עם: היפוקסיה (לוח א ', ירידה perfusate ו superfusate ת.ד. 2 במערכת שלנו מ 135 מ"מ כספית ל ~ ~ 40 מ"מ כספית), ריכוזים הולכים וגדלים של אצטילכולין (לוח ב), שינויים בלחץ intravascular בתנאים בקרה הדגירה הבאה של כלי השיט עם סידן ללא PSS (לוח ג).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול הציג מתאר cannulation, בידוד הסרת כפולה של microvessel שרירי השלד, אם כי טכניקה זו בכלל ניתן ליישם בקלות ברוב הרקמות. על כתב היד הנוכחי, המונח "עורקיק" נוצל בעבר על ידי החוקרים לתאר כלי התנגדות נע בין 70-120 מיקרומטר בקוטר תחת הטון פעיל מנוחה, שהיא גם תורמת רבות תקנה ההתנגדות זלוף לאיבר או רקמות.

עם כמה שינויים, מערכת זו ניתן להתקין על מספר יישומים עבור חוקר ספציפי בקלות מאפשר שילוב של טכניקות נוספות כדי לספק יותר ניסויים לעומק (למשל, שימוש באלקטרודות הטרנסממברני לקביעת פוטנציאל הממברנה 17). שלב קריטי בהכנת בסיסי תמיד לבטח כי יבוא ו יצוא בטפי להחדרת נוזלים המשמשים cannulate כלי מותאמות היטב, להישאר ברור, ולאפשרתזרים ולחץ להישמר באופן קליל. כאשר בטפי להחדרת נוזלים הופכים סמיך עם חתיכות זעירות של פסולת, ייתכן שיהיה צורך לנתק את חתיכות קטנות מאוד של עצות כדי להחזיר את הזרימה. אם החוקר מקפיד, טפטפות ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים עד שהם מגיעים לנקודה שבה הם גם לא ניתן מתפנה או בקטרים ​​גדולים מספיק כי cannulation של כלי הופך להיות קשה ביותר. עם זאת, עם השליטה של ​​התכשיר כירורגית ניסיוני, תשומת לב קפדנית לפרטים, את השינויים המתאימים כדי להתאים תנאים ודרישות, החוקרים יכולים להעריך בקלות המסלולים הקובעים תגובתיות כלי הדם בתגובה מספר עצום של אתגרים פיזיולוגיים תרופתי. הכנה זו תאפשר גם החוקר לבצע ניתוחים בסיסיים על שינויים בכלי הדם כדי מכניקת קיר בתנאים של בטון לא פעיל 14. זו אכן טכניקה חזקה מאוד וישימה והיא אחת כייכול בקלות לשמש ליישומים פורש את טווח המחקר מכניסטית מפורטת תפוקה גבוהה הקרנות של תגובות בסיסיים יותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הלב האמריקני (EIA 0740129N) ו NIH T32 HL90610.

References

  1. Goodwill, A. G., Frisbee, S. J., Stapleton, P. A., James, M. E., Frisbee, J. C. Impact of Chronic Anticholesterol Therapy on Development of Microvascular Rarefaction in the Metabolic Syndrome. Microcirculation. 1-18 (2009).
  2. Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Increased vascular thromboxane generation impairs dilation of skeletal muscle arterioles of obese Zucker rats with reduced oxygen tension. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H1522-H1528 (2008).
  3. Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Growth-dependent changes in endothelial factors regulating arteriolar tone. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, H207-H214 (2007).
  4. Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Hydrogen peroxide emerges as a regulator of tone in skeletal muscle arterioles during juvenile growth. Microcirculation. 15, 151-161 (2008).
  5. Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Increased myogenic responsiveness of skeletal muscle arterioles with juvenile growth. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2344-2351 (2008).
  6. Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 243, H598-H606 (1982).
  7. Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduce PO2. Am. J. Physiol. 267, H706-H715 (1994).
  8. Durand, M. J., Raffai, G., Weinberg, B. D., Lombard, J. H. Angiotensin-(1-7) and low-dose angiotensin II infusion reverse salt-induced endothelial dysfunction via different mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H1024-H1033 (2010).
  9. LeBlanc, A. J., Cumpston, J. L., Chen, B. T., Frazer, D., Castranova, V., Nurkiewicz, T. R. Nanoparticle inhalation impairs endothelium-dependent vasodilation in subepicardial arterioles. J. Toxicol. Environ. Health A. 72, 1576-1584 (2009).
  10. Jernigan, N. L., LaMarca, B., Speed, J., Galmiche, L., Granger, J. P., Drummond, H. A. Dietary salt enhances benzamil-sensitive component of myogenic constriction in mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, H409-H420 (2008).
  11. Stapleton, P. A., Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Altered mechanisms of endothelium-dependent dilation in skeletal muscle arterioles with genetic hypercholesterolemia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 293, R1110-R1119 (2007).
  12. Goodwill, A. G., Stapleton, P. A., James, M. E., d'Audiffret, A. C., Frisbee, J. C. Increased arachidonic acid-induced thromboxane generation impairs skeletal muscle arteriolar dilation with genetic dyslipidemia. Microcirculation. 15, 621-631 (2008).
  13. Baumbach, G. L., Hadju, M. A. Mechanics and composition of cerebral arterioles in renal and spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 21, 816-826 (1993).
  14. Uchida, E., Bohr, D. F., Hoobler, S. W. A method for studying isolated resistance vessel from rabbit mesentery and brain and their responses to drugs. Circ. Res. 4, 525-536 (1967).
  15. Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. I. solated Chapter 23. Isolated, perfused microvessels. In: Clinically Applied Microcirculation Research. Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. 32, CRC Press, Inc. 435-456 (1995).
  16. Lombard, J. H., Liu, Y., Fredricks, K. T., Bizub, D. M., Roman, R. J., Rusch, N. J. Electrical and mechanical responses of rat middle cerebral arterieal to reduced PO2 and prostacyclin. Am. J. Physiol. 276, H509-H516 (1994).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics