De Ex vivo Geïsoleerd Skeletal microvaatjes Voorbereiding Voor het onderzoek van vasculaire reactiviteit

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Een

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Butcher, J. T., Goodwill, A. G., Frisbee, J. C. The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity. J. Vis. Exp. (62), e3674, doi:10.3791/3674 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De geïsoleerde microvaatjes voorbereiding is een ex vivo voorbereiding die het mogelijk maakt voor het onderzoek van de verschillende bijdragen van de factoren die de controle bloedvaten, en dus perfusie weerstand 1-5. Dit is een klassiek experimenteel preparaat dat, was in hoge mate, in eerste instantie beschreven door Uchida et al. 15. Enkele decennia geleden. Deze eerste beschrijving vormt de basis voor de technieken die op grote schaal werd gewijzigd en aangevuld, met name in het laboratorium van Dr Brian Duling aan de Universiteit van Virginia 6-8, en we presenteren een huidige aanpak op de volgende pagina's. Deze voorbereiding zal specifiek verwijzen naar de gracilis arteriole in een rat als het microvaatje van keuze, maar de basis bereiding gemakkelijk kan worden toegepast op schepen geïsoleerd van bijna elk ander weefsel of orgaan bij verschillende diersoorten 9-13. Mechanische (dat wil zeggen, dimensionaal) veranderingen in de geïsoleerde micro-vaatjes kan gemakkelijk worden geëvalueerdin antwoord op een breed scala van fysiologische (bijvoorbeeld hypoxie, intravasculaire druk of afschuiving) of farmacologische problemen en kan inzicht in mechanische elementen die geïntegreerd reacties in een intacte, maar ex vivo, weefsel. De betekenis van deze methode is dat het mogelijk maakt gemakkelijke manipulatie van de invloeden van de geïntegreerde regulering van diameter microvaatje, en daarbij tevens de controle van vele van de bijdragen van andere bronnen, zoals intravasculaire druk (myogene) autonome innervatie hemodynamische ( bijvoorbeeld, shear stress), endotheel afhankelijke of onafhankelijke stimuli, hormonale en parenchymale invloeden, om een ​​deel van de lijst te verstrekken. Onder geschikte proefomstandigheden en met geschikte doelen kan dit als een voordeel ten opzichte in vivo of in situ weefsel / orgaan preparaten, die niet gemakkelijk mogelijk om de eenvoudige besturing van bredere systemische variabelen.

Het major beperking van dit preparaat in hoofdzaak het gevolg van de sterke. Per definitie is het gedrag van deze schepen wordt bestudeerd onder omstandigheden waar veel van de meest belangrijke mate bijdragen aan de regulering van vasculaire weerstand hebben afgeschaft, ook neurale, humorale, metabole, enz. Als zodanig wordt de onderzoeker gewaarschuwd om over-te voorkomen de interpretatie en de extrapolatie van de gegevens die worden verzameld gebruik te maken van deze voorbereiding. Het andere belangrijke punt van zorg met betrekking tot deze voorbereiding is dat het kan heel gemakkelijk om cellulaire componenten zoals de endotheliale bekleding of de vasculaire gladde spieren beschadigen, kunnen dergelijke die variabele bron van fouten worden ingevoerd. Het wordt ten zeerste aanbevolen dat de individuele onderzoeker juiste metingen om de kwaliteit van de voorbereiding te garanderen gebruiken, zowel bij de start van het experiment en periodiek in de loop van een protocol.

Protocol

1. Voorafgaand aan de Experiment

  1. Voorafgaand aan het experiment dag worden capillaire glazen buisjes van geschikte afmetingen van het station in getrokken micropipetten (een horizontale of verticale puller worden gebruikt). De tip diameter kan gemakkelijk worden aangepast afhankelijk van het schip wordt geïsoleerd, hoewel we over het algemeen een diameter gebruiken tussen 50-150 urn. Deze worden vervolgens gebogen om de configuratie van het microvaatje station volgende verwarming op een butaanvlamproef. Micropipet tips zijn fysiek gebroken om de geschatte diameter (met fijne tang) voor het microvaatje in kwestie en kunnen geslepen of gepolijst om de juiste conformatie, voor zover nodig voor de specifieke toepassing. Voor een uitgebreide en uitstekende review over deze procedures, wordt de lezer doorverwezen naar Davis et al.. 16. Twee micropipetten worden vervolgens in tegenstelling tot de pipet houders voor het microvaatje kamer. Deze worden georiënteerd, dat de uiteindenin dezelfde verticale en horizontale vlak in het vat kamer.
    De microvaatjes kamer die in dit manuscript (figuren 1 en 2) is er een die wordt op maat gebouwd door de heer David Eick van de afdeling Fysiologie aan het Medical College of Wisconsin ( http://www.phys.mcw.edu/ en www . eicktech.com ). Toch zijn er verschillende andere configuraties van microvaatjes kamer zijn gemakkelijk in de handel verkrijgbare, met die welke zijn ontwikkeld door Living Systems Instrumentation ( http://www.livingsys.com/ ) en IonOptix ( http://www.ionoptix.com/ ) zeer vaak voor. Met andere systemen, kan het noodzakelijk om een ​​omgekeerde microscoop plaats van een conventionele oprechte gebruiken, hoewel dit afhankelijk van de specifieke experiment en uitrusting. Het gebruik van omgekeerde microscopen beter zou zijn voor experimentele protocolOLS waarbij fluorescerende of confocale beeldvorming.
  2. Bereid een fysiologische zoutoplossing (PSS, hieronder beschreven) en zorgen voor pH wordt ingesteld op het juiste niveau voor de specifieke experimentele condities (7,38 tot 7,42 is typisch en valt binnen de fysiologische range). De oplossing kan vooraf PSS en gekoeld worden bereid maar worden gecontroleerd op de juiste temperatuur pH voor gebruik. PSS kan bevatten albumine als de experimentator of specifieke vereist, hoewel dit niet algemeen noodzakelijk.
  3. De digitale video-remklauwen gebruikt om bloedvaten te meten moet worden gekalibreerd met behulp van een hemocytometer of microscoop objectmicrometer. Voor een nauwkeurige kalibratie, is het essentieel dat de micrometer worden geplaatst in hetzelfde vlak als de instroom / uitstroom micropipetten in het vat kamer.
  4. Band lussen voor het bevestigen van de microvaatjes om de pipetten moeten worden bereid en gemakkelijk toegankelijk voor later gebruik. Deze kunnen gemakkelijk worden bereid 8-0 of kleiner oogheelkundige sOEKOMSTIGE. De single das lus kan op voorhand worden bereid en opgeslagen in een overdekte petrischaal op een kleine strook omgekeerde tape rond een microscoopglaasje totdat het nodig is (dit is te voorkomen dat ze verloren gaan). (Figuur 3).

2. Dag van het Experiment

  1. Alle ondersteunende apparatuur moet worden ingeschakeld en gecontroleerd op juiste werking. Dit omvat de anti-vibration/floating tafel en het circulerende verwarmd waterbad (ingesteld op de juiste temperatuur in het vat bad leveren - vaak 37 ° C), alle druk transducers en het schip kamer afvoerpomp (Figuur 1A en 1B). Zet de equilibratiebuffer gassen in het vat kamer en in de perfusievloeistof en superfusate reservoirs.
  2. Vul alle van de reservoirs, buizen en kamers met de PSS oplossing. De perfusaat lijn die naar de instroom pipet moet volledig worden ingevuld om de aanwezigheid van luchtbellen in deze lijn, die zou kunnen verjagen en schade aan de va te vermijdenscular endotheel (Figuur 1C). Indien nodig, gebruik maken van een spuit om voorzichtig druk op de PSS helemaal door de pipet om er zeker van dat het helemaal vol en zonder enige blokkade die perfusaat stroom kunnen belemmeren. De instroom druk moet worden gehouden binnen redelijke grenzen om te voorkomen dat schade aan de druk van transducers.

3. Microvaatjes Oogst

  1. Naar aanleiding van verlamming van het dier waarvan het microvaatje moet worden genomen, moet het betrokken vaartuig worden geïsoleerd volgens de procedures die het meest geschikt zijn om het vaatstelsel te bestuderen. In sommige gevallen vereist dit verwijderen van het orgel zelf (bijv. cerebrale, coronaire microvaatjes), terwijl in andere vaten kan direct uit de verdoofde dier (bijvoorbeeld spier). Een voorbeeld van de stand van het vaartuig in de m. gracilis is weergegeven in figuur 4. Bereken de lengte van het vat in vivo vóór verwijdering van vooreekhoorntjesbrood of kleine remklauwen. Voorafgaand aan het verwijderen van het schip van het dier / orgel, kan het heel nuttig zijn om nog een laatste controle om er zeker van dat het schip kamer klaar is en goed werkt (inclusief alle das lussen op zijn plaats) uit te voeren.
  2. Verwijder het vaartuig van het dier / orgaan los door de buitenzijde van het vat aan een uiteinde met fijne pincet en snijden langs de lengte van het vat tot het vrij is, waarbij de uiterste zorg voor een trekken of trekken van het vat te voorkomen. Eenmaal bevrijd, direct te plaatsen in een 1,7 ml centrifuge buis gevuld met PSS, maar niet laten gaan van het schip. Dit is te denken aan het oriëntatie wordt zodat perfusievloeistof richting in het bad identiek is aan bloed stroomrichting in het dier.

4. Cannulating het Schip

  1. Plaats het vat in het gevulde bad en canule het proximale uiteinde van de instroom pipet. Dit kan het beste worden bereikt met een geringe perfusiesnelheid door de canule (~ 50 mmHg druk) eneen paar van fijne tang die aan weerszijden van het proximale lumen vat wand (namelijk een pincet in elke hand) bezit. In ons laboratorium, gebruiken we fijne tang van Fine Science Tools ( http://www.finescience.com/Home.aspx ), hoewel elke correct gebouwd tang daadwerkelijk zal werken. Schuif het schip op de canule tips en voortgang van het schip op de tip om het punt waar twee tie lussen kan het schip veilig te stellen.
  2. Breng de instroom druk om ~ 75 mmHg verder te blazen het schip en canulatie vergemakkelijken de distale pipetpunt. Stroming door het vat worden gezien als een verstoring in de superfusate reservoir aan het distale uitstroom van het vat (onder de microscoop). Canule het distale uiteinde van het schip op de uitstroom pipet en zet deze vast met twee tie lussen (deze laatste lussen moet in plaats voorafgaand aan de infusen; figuur 5).
  3. Pas de canule tot in de XYZ coördinaten als Needed totdat er minimale vervorming in het vat, en het vaartuig benadert de in vivo lengte. Breng de instroom onder druk totdat het benadert het percentage van de gemiddelde arteriële bloeddruk normaal ervaren door dat vaartuig segment (ons laboratorium maakt gebruik van 80% van de gemiddelde arteriële druk voor de grote weerstand arteriolen van de m. gracilis 8).
  4. Plaats een kleine bruisende steen het leveren van de juiste gasmengsel in bad en leg plastic folie of een glazen afdekplaat over de kamer om spatten te voorkomen de microscoop lens. We maken gebruik van een borrelende steen die is algemeen verkrijgbaar bij alle Pet / aquarium winkels en ongeveer 1 cm in diameter, maar een kleiner formaat zal effectief zo ​​goed werkt. De aanwezigheid van de borrelende steen verzekert geschikte gas beschikbaar om het schip te allen tijde en zal uitbreiden schip levensvatbaarheid. Deze steen wordt verwijderd gedurende alle meetperioden (of luchtstroom door de steen tijdelijk onderbroken) om vervorming van het voorkomenafbeelding. Maak de klem op de uitstroom pipet en laat de stroom door het schip gedurende 30 minuten. Periodiek, moet de stroom worden vastgeklemd op de uitstroom buis te bepalen of het vaartuig ontwikkeling rust toon. Alle vaartuigen moeten worden gecontroleerd op lekken druk op dit punt. Lekken zal duidelijk door een bekende druk in het vat (we vaak gebruikt 100-120 mmHg) en vastklemmen van de uitstroom, gevolgd door de instroom lijnen. Als de intraluminale druk stabiel geen waarneembare lekken. Indien de druk begint te dalen, aanzienlijk lekkage aanwezig en wordt gesloten. Lekken op een van beide de instroom of uitstroom pipetten kan normaal worden verholpen door het toevoegen van een extra lus gebonden rond het schip op de pipet. Ook als het vaartuig is een zijtak dat waardoor de lek zal dit afbreuk doen aan de van het vaartuig om effectief druk en een extra bron voor fouten te voeren. Als dit lek wordt vastgesteld, kan het normaal worden afgebonden wet een enkele lus van 10-0 opthalmic hechtdraad. U kunt ook een enkele streng geplaagd 6-0 hechtdraad tot de band lus te maken is ook zeer effectief. Als het lek niet kan worden geïdentificeerd of niet effectief kunnen worden afgebonden (bv, is er geen stam naar de zijtak en eenvoudig een gat in de vaatwand), kan dit resulteren in een voortijdige beëindiging van het experiment en het gebruik van een te worden alternatieve schip nodig (dit is meestal de identieke vaartuig in het andere been - of contralaterale indien nodig - van het dier).

    Het schip moeten kunnen evenwicht in geen stroming ten minste 30 minuten. Alle experimenten worden uitgevoerd onder geen stroming. Zodra het schip heeft ontwikkeld bevredigend toon en reageert op de inclusiecriteria voor het experiment in kwestie, het schip is klaar voor verdere studie.

    Deze inclusiecriteria kunnen variëren, afhankelijk van de specifieke experimentele protocol en onderzoeker. In ons laboratorium hebben we regelmatig utilize het volgende:
    1. Actieve toon> 30% (berekend als ΔD / D max x 100, waarin ΔD de toename van arteriële binnenwand diameter van de waarden onder de equilibratiebuffer druk in reactie op blootstelling aan Ca 2 +-vrij PSS en D max de maximale middellijn van het evenwicht druk in de Ca2 +-vrij PSS).
    2. Myogene activering (het onderhoud van, of bij voorkeur een vermindering van de, arteriolaire diameter met een verhoogde intraluminale druk) als een index van een levensvatbare vasculaire gladde spieren laag.
    3. Een levensvatbare endotheliale bekleding, zoals blijkt uit een stevige dilatator reactie op acetylcholine (10 -6 M in het bad).
    4. Extra inclusiecriteria kunnen worden toegevoegd aan de specifieke experimentele protocol nodig, met inbegrip constrictor reacties agonisten zoals fenylefrine (10 ~ 7 M), dilatator reacties op andere stimuli, zoals adenosine (10 -5 passen 2 in het evenwicht gas).
  5. Het volgende gedeelte is een voorbeeld van een "mock experiment". Alle benodigde oplossingen worden bereid in voorkomend geval, met aandacht voor de verdunningsfactor van de PSS in het vat kamer account. Als voorbeeld voor enkele van materiaal, het volume van het vat kamer 20 ml. Als zodanig 20 pi van een 10 -2 M voorraadoplossing resulteert in een effectieve concentratie van 10 5 M in het vat kamer bad. Na verwijdering vaartuig, infusen, evenwicht en validatie zoals hierboven beschreven is het experiment klaar om te beginnen. Bijzonderheden zoals de behandeling van randomisatie en effectiviteit zijn experiment specifiek en zou veel ruimte innemen voor deze inspanning. Als zodanig zijn deze niet in detail.

    De eerste controle antwoorden worden vastgesteld. Voor een voorbeeld fysiologische stimulus, zoals myogene activering (druk-geïnduceerde vernauwing), intralumenal prEssure is willekeurig veranderd over het gewenste bereik, en het vaartuig mag een passende periode van tijd om te reageren (in dit geval, zouden we een 5-7 minuten periode mogelijk te maken). Voor een voorbeeld farmacologische stimulus zoals uitdaging acetylcholine, wordt het geneesmiddel toegevoegd aan de achterzijde van voorraadoplossingen in een willekeurige volgorde. In dit geval zouden we normaal gesproken gebruik maken van een bereik van 10 -9 tot 10 -5 M in het bad, met een wash-out wordt gedefinieerd als een herstel van evenwicht diameter. Als acetylcholine is een snel optredende agent, kan maximaal dilatator reacties gemakkelijk worden bereikt in slechts een paar seconden. Andere middelen (zoals peptiden) kunnen veel langer duren om een ​​maximale respons dit worden gehouden, alsmede de periode die doeltreffende uitwassen. Opwekken Zodra de zeggenschap reacties zijn verzameld, kunnen specifieke interventies worden opgelegd aan het systeem, inclusief incubatie van het vat met receptor agonisten / antagonisten, geneesmiddelen die op specifieke ionkanalen, uitlokking vangewijzigde intraluminale druk, verschillen in evenwicht gassen of farmacologische middelen gericht zijn op specifieke enzymatische systemen, om een ​​paar van de meest voorkomende ingrepen te noemen.

    Na een geschikt moment voor de interventie effectief te zijn (die op passende wijze moet worden getest), kan een volgende ronde van het verzamelen van gegevens worden gestart. Afhankelijk van de specifieke experimentele protocol, kunnen volgende ingrepen worden opgelegd aan het vaartuig of de eerste kan worden verwijderd (door wash-out - waar mogelijk - of eenvoudig verwijderen van de fysiologische uitdaging). Zodra het schip is teruggekeerd naar haar evenwicht staat (dat moet worden gecontroleerd), kunnen de volgende interventies worden toegepast als nodig met aanvullende gegevens verzameld. Dit algemene procedure wordt voortgezet totdat de beëindiging van het experiment of tot de kwaliteit van het vaartuig preparaat beneden vooraf bepaalde drempelwaarde (bijvoorbeeld de, reactie van een agonist of om voldoende actief toon ontwikkelen). Op dit punt wordt het experiment een gesloten of de onderzoeker wenst gegevens die onafhankelijk is van de reactiviteit van de geïsoleerde vat (zoals werking van de vaatwand, die kan worden uitgevoerd met dezelfde procedure myogene activering gewoon verzamelen met een schip ontbreekt alle actieve tone 14).
  6. Regelmatig reinigen van alle apparatuur is van essentieel belang voor het verwijderen van zout opbouw en het voorkomen van de groei van ongewenste biologische entiteiten. Aan het eind van elk experiment dag, op een minimum, worden alle lijnen en de kamers volledig gespoeld van PSS met een ruime hoeveelheid gedestilleerd of gedeïoniseerd water en liet zich volledig drogen. Na elke 2-3 dagen gebruik wordt een wassen met ethanol en uitgevoerd en de apparatuur mag volledig drogen. Aan het einde van elke week continue gebruik worden alle lijnen en kamers gevuld met 0,1 M zoutzuur, mogen 'incuberen' gedurende 30 minuten en daarna volledig met water gewassen, zoals hierboven. Ten slotte heeft deeinde van 2-3 weken opeenvolgend gebruik, alle delen van de slang worden vervangen door nieuwe en de kamer en reservoirs worden gereinigd met 1,0 M HCl gevolgd door een uitgebreide spoelen met gedestilleerd / gedeïoniseerd water. Als een verkleuring van slangen of visuele vaststelling van een groei in de slang of een element van de kamer / reservoirs, deze worden ofwel vervangen of grondig gereinigd naargelang het geval. Met regelmatige schoonmaak en algemeen onderhoud, kan het materieel voor het laatst een zeer lange tijd. Op het moment van schrijven, ons schip kamers zijn allemaal in hun 8 e of 9 e jaar van routinematig gebruik en we hebben ervaren geen significante problemen met hen.

5. Representatieve resultaten

Figuur 1A
Figuur 1A. Dit cijfer geeft de basis microvaatjes station setup. A = televisie voor het bekijken van vaartuig; B = digitale schuifmaat, C = spuit voor het duwen van superfusate thrdoorgedreven instroom pipet als nodig is; D = hydrostatische kolom voor het wijzigen van perfusaat instroom druk; E = microscoop; F = microvaatjes kamer; G = superfusate reservoir, H = druk monitor (meerdere kunnen worden toegevoegd als nodig is), ik = microvaatjes kamer afvoerpomp voor superfusate; J = evenwicht gasmengsel tank; K = afval bevatten (voor superfusate), L = circulerende boiler, M = anti-vibration/floating tafel.

Figuur 1B
Figuur 1b. Dit cijfer geeft een beter zicht van het microvaatje kamer setup. In deze figuur E = microscoop F = microvaatje kamer, H = druksensor (Hoewel we een eenvoud meerdere kunnen worden toegevoegd om verschillende gebieden noodzakelijk) I = microvaatje kamer afvoerpomp N = slang aan de begin van het perfusaat instroom pipet (een voortzetting van de 'D' in figuur 1A); O = slang aangesloten op de perfusaat uitstroom pipet.


Figuur 1C. Deze figuur geeft het dichtst weergave van het microvaatje kamer. In deze figuur, N = het perfusaat lijn (dat wil zeggen, slangen direct aan het perfusaat instroom pipet); O = slang direct aan het perfusaat uitstroom pipet, P = de horizontale en verticale locatie controles voor de instroom pipet, Q = de superfusate afvoer voor het waterbad (aangesloten op 'I' in de figuren 1A en 1B), R = de toevoer van het waterbad uit het reservoir (aangesloten 'G' in figuur 1a).

Figuur 2
Figuur 2. Deze figuur geeft een schematische voorstelling van de stroming van vloeistoffen en gassen in het systeem. In deze figuur, A = PSS superfusate lijn toestroom; B = PSS perfusaat lijn naar instroom pipet, C = PSS superfusate afvoer van bad naar container afval, D = PSS perfusaat uitstroom uit uitstroom pipet, E = verwarmd water inbreng in de kamer jas; F = verwarmd water output van kamer jas.

Figuur 3
. Figuur 3 Deze figuur geeft de individuele das lussen gemaakt van oogheelkundige hechting (gezien door een dissectie microscoop met 10x oculairs en een 4.5x verstelbare zoom vergroting; Panel A) die gebruikt worden in onze voorbereiding en de opslag van meerdere loops gelijkspel 8-0 en 10-0 hechtdraad bij omgekeerde band rondom een ​​microscoopglaasje dat wordt opgeslagen in een afgesloten Petri-schaal (om te vermijden dat ze, B).

Figuur 4
Figuur 4. Dit cijfer geeft een beeld (bekeken via een standaard stereomicroscoop) van de gracilis spier weerstand arteriole voorafgaand aan de chirurgische verwijdering van isolatie en om goed te kunnen ruimtelijke oriëntatie.

ve_content "> Figuur 5
Figuur 5. Dit cijfer geeft een representatief beeld van een gecanuleerde microvaatje. Paneel A toont de gehele lengte van het vat, zowel instroom (A) en afvoer (B) pipetten als tie lussen (C) weergegeven. Paneel B toont een beeld met een hoge vergroting duidelijk de bepaling van de arterie binnendiameter de digitale klauwen (in dit geval de diameter 112 pm).

Figuur 6
Figuur 6. Deze figuur geeft representatieve beelden van een gecanuleerde microvaatje volgende evenwicht. De bovenste afbeelding is van een schip onder controle, ongestimuleerde omstandigheden op het evenwicht druk, de middelste afbeelding is van hetzelfde vaartuig na uitzetting aan te vechten met acetylcholine (10 -6 M in het bad), en de onderste afbeelding is van dat vaartuig na constriction aan te vechten met fenylefrine (10 7 M in het bad).

Figuur 7
. Figuur 7 Deze figuur vat de reactie van een geïsoleerde microvaatje reactie op dagen met: hypoxie (Paneel A, een vermindering perfusievloeistof en superfusate PO 2 in het systeem van ~ 135 mmHg tot 40 mmHg ~), toenemende concentraties van acetylcholine (Paneel B), veranderingen in intravasculaire druk onder controle omstandigheden na incubatie van het vat met een calciumvrij PSS (Paneel C).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De gepresenteerde protocol beschrijft de isolatie, de verwijdering en dubbele cannulatie van een skeletspier microvaatje, hoewel dit algemene techniek gemakkelijk kan worden toegepast op de meeste weefsels. Voor de huidige manuscript, is de term "arteriole" is gebruikt door de auteurs op een weerstand schip variërend van 70 tot 120 micrometer in diameter onder rust actief toon, die ook een belangrijke bijdrage aan de regulering van perfusie weerstand tegen een orgaan of te beschrijven weefsel.

Met enige aanpassingen kan dit systeem worden aangebracht meerdere toepassingen voor de specifieke onderzoeker en gemakkelijk maakt de opname van extra technieken, meer diepgaande experimenten (bijvoorbeeld, gebruik van transmembraan elektroden voor het bepalen van membraanpotentiaal 17). Een kritische stap in de basis voorbereiding is altijd verzekeren dat de in-en uitstroom pipetten die worden gebruikt om het schip canule aan elkaar gewaagd zijn, helder blijven, en laatdebiet en de druk worden gehandhaafd op een gemakkelijke manier. Wanneer de pipetten verstopt raken minuten brokstukken, kan het nodig zijn voor het afbreken van kleine stukjes van de uiteinden om te herstellen. Als de onderzoeker is voorzichtig, kan pipetten worden hergebruikt meerdere keren totdat ze een punt bereiken waar ofwel ze niet kunnen worden ontstopt en de diameters voldoende groot dat cannulatie van het schip wordt het uiterst moeilijk. Echter, met beheersing van deze chirurgische en experimentele voorbereiding, zorgvuldige aandacht voor detail, en de nodige aanpassingen aan specifieke voorwaarden en eisen aan te passen, kunnen onderzoekers makkelijk te evalueren paden bepalen van vasculaire reactiviteit in antwoord op een groot aantal fysiologische en farmacologische uitdagingen. Deze voorbereiding zal het ook mogelijk de onderzoeker de fundamentele analyses van veranderingen uit te voeren om vaatwand mechanica onder de omstandigheden van geen actieve toon 14. Dit is inderdaad een zeer krachtige en flexibele techniek en het is een diegemakkelijk kan worden gebruikt voor toepassingen verspreid over het bereik van gedetailleerde mechanistische studie naar high-throughput screening van meer elementaire reacties.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association (EIA 0740129N) en NIH T32 HL90610.

References

  1. Goodwill, A. G., Frisbee, S. J., Stapleton, P. A., James, M. E., Frisbee, J. C. Impact of Chronic Anticholesterol Therapy on Development of Microvascular Rarefaction in the Metabolic Syndrome. Microcirculation. 1-18 (2009).
  2. Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Increased vascular thromboxane generation impairs dilation of skeletal muscle arterioles of obese Zucker rats with reduced oxygen tension. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, H1522-H1528 (2008).
  3. Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Growth-dependent changes in endothelial factors regulating arteriolar tone. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, H207-H214 (2007).
  4. Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Hydrogen peroxide emerges as a regulator of tone in skeletal muscle arterioles during juvenile growth. Microcirculation. 15, 151-161 (2008).
  5. Samora, J. B., Frisbee, J. C., Boegehold, M. A. Increased myogenic responsiveness of skeletal muscle arterioles with juvenile growth. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 2344-2351 (2008).
  6. Dacey, R. G., Duling, B. R. A study of rat intracerebral arterioles: methods, morphology, and reactivity. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 243, H598-H606 (1982).
  7. Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduce PO2. Am. J. Physiol. 267, H706-H715 (1994).
  8. Durand, M. J., Raffai, G., Weinberg, B. D., Lombard, J. H. Angiotensin-(1-7) and low-dose angiotensin II infusion reverse salt-induced endothelial dysfunction via different mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 299, H1024-H1033 (2010).
  9. LeBlanc, A. J., Cumpston, J. L., Chen, B. T., Frazer, D., Castranova, V., Nurkiewicz, T. R. Nanoparticle inhalation impairs endothelium-dependent vasodilation in subepicardial arterioles. J. Toxicol. Environ. Health A. 72, 1576-1584 (2009).
  10. Jernigan, N. L., LaMarca, B., Speed, J., Galmiche, L., Granger, J. P., Drummond, H. A. Dietary salt enhances benzamil-sensitive component of myogenic constriction in mesenteric arteries. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, H409-H420 (2008).
  11. Stapleton, P. A., Goodwill, A. G., James, M. E., Frisbee, J. C. Altered mechanisms of endothelium-dependent dilation in skeletal muscle arterioles with genetic hypercholesterolemia. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 293, R1110-R1119 (2007).
  12. Goodwill, A. G., Stapleton, P. A., James, M. E., d'Audiffret, A. C., Frisbee, J. C. Increased arachidonic acid-induced thromboxane generation impairs skeletal muscle arteriolar dilation with genetic dyslipidemia. Microcirculation. 15, 621-631 (2008).
  13. Baumbach, G. L., Hadju, M. A. Mechanics and composition of cerebral arterioles in renal and spontaneously hypertensive rats. Hypertension. 21, 816-826 (1993).
  14. Uchida, E., Bohr, D. F., Hoobler, S. W. A method for studying isolated resistance vessel from rabbit mesentery and brain and their responses to drugs. Circ. Res. 4, 525-536 (1967).
  15. Davis, M. J., Kuo, L., Chilian, W. M., Muller, J. M. I. solated Chapter 23. Isolated, perfused microvessels. In: Clinically Applied Microcirculation Research. Barker, J. H., Anderson, G. L., Menger, M. D. 32, CRC Press, Inc. 435-456 (1995).
  16. Lombard, J. H., Liu, Y., Fredricks, K. T., Bizub, D. M., Roman, R. J., Rusch, N. J. Electrical and mechanical responses of rat middle cerebral arterieal to reduced PO2 and prostacyclin. Am. J. Physiol. 276, H509-H516 (1994).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics