xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

Immunology and Infection
 

Summary

크롬 출시 분석, 세포 독성 T 세포의 활동을 검출하기위한 일반적인 분석은 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 본 문서에서, 항원 특이 CD8 T 세포와 인간의 유방암 종양 라인 SKBR3를 사용하여 임피던스 기반의 접근 방식은 세포의 살해를 감지하는 기능에 대해 조사 하였다.

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Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System. J. Vis. Exp. (66), e3683, doi:10.3791/3683 (2012).

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Abstract

세포 독성 CD8 T 세포가 감염되거나 악성 숙주 세포 1의 죽음을 유도 할 수있다 T 세포의 하위 그룹을 구성합니다. 이러한 세포는 특수한 수용체를 내가 2 분자가 HLA 클래스에 바인드 특정 항원 펩티드를 인식 할 수있는 T 세포 수용체 (TCR)라고 표현한다. 이러한 목표 세포의 죽음의 결과로 granzymes와 퍼포 같은 용해성 물질의 생산에 자신의 HLA 클래스 I 분자 결과를 통해 감염된 세포 나 종양 세포의 참여. 이 같은 ELISPOT 또는 흐름 세포 계측법으로 분석을 사용하여 항원 특이 CD8 T 세포의 주파수를 결정하는 데 유용하지만, 그것은 세포 독성 분석에게 3를 사용하여 CD8 T 세포 반응의 강도를 확인하기 위해 도움이됩니다. 세포 독성 기능을 평가하기위한 가장 인식 할 수있는 분석은 표준 분석 4 간주되는 크롬 출시 분석 (CRA)입니다. CRA는 감마 방사선에 세포의 노출, L 등 여러 가지 한계를 가지고재현성 및 세포의 큰 숫자에 대한 요구 사항의 ACK. 지난 10 년간 이러한 한계를 극복하기 위해 새로운 전략을 채택에 관심이있어왔다. 새로운 접근 방식을 포함하는 측정하는 caspase의 릴리스 4, BLT의 에스테르 가수 분해 효소 활동 5와 CD107 6 표면 발현.에게 로슈 xCelligence 시스템을 사용하여 임피던스 기반의 분석은, CRA에 대한 대안으로 가능성을 위해 본 논문에서 조사 하였다. 자기편 종양 세포가 전극 판에 바인딩 할 때 임피던스 또는 전류에 대한 반대가 발생합니다. 종양 세포 살해 후 분리 및 전기 임피던스는 xCelligence 시스템에 의해 측정 할 수있는 줄어 듭니다. 세포 매개 살인을 평가하기 위해 임피던스 기반의 접근 방식을 적용 할 수있는 능력은 T 세포는 대부분의 표면에 단단히 부착하지 않고 따라서 T 세포의 직접적인 간섭의 우려를 감소 임피던스에 많은 영향을 미칠 것으로 나타나지 않는 것을 관찰에 달려있다 와측정. 결과는 임피던스 기반의 분석은 표준 CRA에 상대적으로 증가 감도 항원 특이 세포 독성 CD8 T 세포의 수준의 변화를 감지 할 수 보여줍니다. 이러한 결과를 바탕으로, 임피던스 기반의 접근 방식은 CRA의 또는 세포 독성 CD8 T 세포의 기능을 측정하는 것을 목표로 다른 방법에 대한 좋은 대안이 될 수 있습니다.

Protocol

1. 단기 인간 항원에 특정한 CD8 T 세포 라인 7의 생성

  1. Ficoll-paque Plus를 사용하여 일반 건강 HLA-A2 양성 기증자의 혈액에서 분리 된 말초 혈액 단핵 세포 (말초 혈액).
  2. 2 × 10 6 세포 / ML에서 6 - 웰 플레이트에 2 ㎖ / 잘 말초 혈액의를 추가합니다.
  3. HLA-A2-결합 HER-2/neu의 p369-377 펩타이드 (아미노산 서열 KIFGSLAFL) 또는 HLA-A2-결합 인플루엔자 10 ㎍ / ㎖과 장소의 최종 농도에서 직접 우물에 P58-66 펩타이드 (GILGFVFTL)를 추가 5 % CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터합니다.
  4. 문화 미디어 50 단위 / ML의 최종 농도를 달성하기 위해 : 자극하고 확장 T 세포를 추가, 인간 재조합 IL-2 (50 단위 / μL 주)로 보충 매 2 일 250 μL / 잘 신선한 미디어 도와줍니다.
  5. 다시 자극 같은 펩티드의 10 ㎍ / ㎖로 2 시간 동안 펄스 2 × 10 6 세포 / ㎖ 조사자가 말초 혈액과 문화 전지 사용1.3 단계 및 제 펩타이드 자극 후 1 ML / 물론 1 주로 문화에 이러한 셀을 추가로 개발.
  6. 로 기존의 문화 2 일마다에, 단계 1.4에서 설명한 인간 재조합 IL-2와 새로운 미디어를 추가합니다.
  7. 두 번째 펩타이드 자극 후 1.5 일주 단계에 설명 된대로 펩타이드 조사자가 말초 혈액과 세포를 다시 자극한다.
  8. 엿새 초기에 다시 자극 지난 후 세포를 사용하여 준비합니다.

2. 유방암 세포의 준비

  1. 5 % CO 2와 37 ° C에서 인큐베이터에있는 xCelligence 임피던스 측정 국 (xCelligence 역)를 놓습니다.
  2. 0.25 % 트립신과 원심 분리 (5 분 1,000 RPM)를 사용하여 75 %의 합류이다 수확 인간의 종양 세포 (SKBR3, BT20, MCF7 또는 HCC1419).
  3. 혈구 및 RPMI 종양 미디어 재구성을 (10 % 태아 소 혈청 (FBS), 500 단위 / ㎖로 보충하여 종양 세포를 계산7.5 × 10 3 종양 cells/100 μL의 농도에서 IFN-γ).
  4. 잘 레이아웃을 결정하는 레이아웃 페이지를 설정하여 임피던스 수치에게 40 시간 동안 5 분마다 취할 수있는 일정 페이지를 설정하여 프로그램 xCelligence 소프트웨어입니다. 처음 18 시간 동안, xCelligence 시스템은 종양 세포의 임피던스 수치를 취할 것입니다.
  5. xCelligence E-접시에 RPMI 종양 미디어 100 μl를 추가하고 세포의 부재에서 임피던스를 측정하여 읽고 배경을 수행합니다.
  6. xCelligence 역에 잘 자리 당 100 μL에 E-접시에 종양 세포를 추가합니다.
  7. 즉시 E-플레이트에 부착 시작 종양 세포의 임피던스 수치를 가지고 시작 xCelligence 소프트웨어의 시작 버튼을 누릅니다.

3. CD8 T 세포와 종양의 공동 문화

  1. 종양 세포는 X 10 4 종양 세포 물론 당 (approxi을 장착하고 1.5 배가되면mately 18시간 처음으로) 도금시킨 후, 수확 T 세포는 부드러운 긁고는 그리고 교반하여 제 1 항에 준비
  2. 5 분 동안 1,000 rpm으로 원심 분리기 40 T 세포 1 종양 세포의 최대 비율에서 시작, 다양한 비율에서 10 % FBS와 혈구와 RPMI 매체 재구성을 사용하여 T 세포를 카운트의 비율까지 2 배 희석 1.25 T 세포 1 종양 세포에 도달합니다. 예를 들어, 잘 당 1.5 × 10 4 종양 세포가 있습니다. 1시 40분 비율을 달성하기 위해, 잘 당 6 × 10 5 T 세포를 추가하고 2 배 아니라 당 1.875 × 10 4 T 세포 (1:1.25 비율) 1.5 × 10 4 종양 세포의 비율까지 T 세포를 희석 얻을 수 있습니다.
  3. xCelligence 역을 일시 중지 E-플레이트를 제거합니다.
  4. 피펫과 우물에서 미디어를 제거하고 200 미디어 혼자 μL 또는 우물에 T 세포의 적절한 비율을 추가합니다.
  5. xCelligence 역에서 E-플레이트를 다시 배치하고 xCelligence 소프트웨어 프로를 계속그램 너무 임피던스 측정 값은 T 세포 외에 후 약 20 시간 동안 5 분마다 가져옵니다.
  6. 분석의 끝에 결과를 정상화.

4. 크롬 출시 분석 (CRA) 7

  1. 51 크롬 51 크롬 표시된 표적 세포로 작업 할 때 기관의 방사선 안전 절차를 따르십시오. 항상 방사선 노출을 줄이기 위해 적절한 차폐를 사용합니다.
  2. 펄스 종양의 1에서 2 시간 동안 세포 × 10 10 μL / ML 신선한 51 크롬 (0.005 큐리 / ㎖) 6 종양 세포 / ML.
  3. 5 분 동안 1,000 rpm에서 10 % FBS와 원심 분리기로 RPMI 매체의 10ml에 종양 세포를 씻으십시오. 100 μL / 잘 1 X 10 5 종양 세포의 96 잘 둥근 바닥 판에 종양 세포를 추가합니다.
  4. 40 T 세포 1 종양 세포에서 시작하여 다양한 비율에서 T 세포를 추가하고 1.25 T 세포 1 종양 세포의 비율까지 2 배 희석을 얻을 수 있습니다. 예를 들어, 1 X 10 5 종양 세포가있다 잘 당. 1시 40분 비율을 달성하기 위해, 잘 당 4 × 10 6 T 세포를 추가하고 2 배 아니라 당 1.25 × 10 5 T 세포 (1:1.25 비율) 1 X 10 5 종양 세포의 비율까지 T 세포를 희석 얻을 수 있습니다.
  5. 플레이트에 자발적이고 최대 종양 세포 컨트롤을 추가합니다. 종양 세포에서 51 크롬의 자발적인 방출을 계산하기 위해, 각 포함 1 X 10 5 종양 세포는 10 % FBS와 RPMI 미디어 μL 100-100 μL에서 6 우물을 추가합니다. 종양 세포에서 51 크롬의 최대 방출을 계산하려면, 100 μL에 100 ㎕의 0.1 % 트리톤 모든 셀을 lyses PBS에서 X-100에서 6 웰스에게 각 포함 1 X 10 5 종양 세포를 추가합니다.
  6. 5 % CO 2와 37 ° C에서 5 시간 동안 번호판을 품어.
  7. 배양 후 각 우물에서 뜨는 50 μl를 제거하고 루마 플레이트에 추가합니다.
  8. 하룻밤 번호판을 건조 및 감마 카운터를 사용하여 CPM을 측정합니다.
르 "> 5. 퍼센트 용해 계산

  1. 임피던스 분석 : 다양한 시간 지점에서 세포 지수 (CI)로보고 임피던스 읽기, 가지고 %의 용해를 확인하려면 다음 공식을 사용 (CI 종양 만 - (CI 종양 + T 세포)) / (전용 CI 종양) * 100.
  2. CRA : %의 용해를 확인하려면 다음 공식을 사용하여 (CPM 실험 - CPM 자연) / (CPM 최대 - CPM 자연) * 100.

6. 대표 결과

혼자 T 세포는 임피던스를 증가하지 않는다

T 세포는 일반적으로 대부분의 고체 표면에 부착하지 않고 활성화와 확산에 대한 준수를 요구하지 않습니다. 따라서, T 세포가 xCelligence E-접시에 임피던스에 기여하지 않도록 가설되었다. 이 테스트하려면, 우물 SKBR3 유방암 세포 또는 갓 정화 인간의 CD8 T 세포 하나와 함께로드 된. 임피던스 40 시간 코스 대표적인 예 demonst을 통해 측정 하였다T 세포의 평가 본질적으로 약간의 효과는 그림 1A에 표시됩니다. 반면에, 그것은 약간이기는하지만 T 세포, 배경 임피던스를 감소 할 수 있다고 주장 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 공동 문화 임피던스 측정 개시 후 18시간에서 T 세포를 추가하는 과정은 임피던스 중단 (그림 1B) 결과 나타났습니다. 다른 연구 중단은 보육의 내부와 같은 신호 감소 이후 처리하는 부분에서 T 세포 함유 용액의 온도를함으로써 줄일 수 때문이었다 것으로 나타났다.

T 세포에 의해 임피던스 중재의 감소는 용량 의존적이다.

세포 독성 T 세포의 활동을 위해 샘플을 비교하는 임피던스 기반의 분석의 유틸리티는 항원에 특정한 T 세포의 서로 다른 농도를 구별 할 수있는 능력이 필요합니다. 이 수 있는지 여부를 테스트하려면 SKBR3 세포 농도를 변화와 함께 공동 배양T 세포의 화 :은 T 세포 라인 HER-2/neu의 특정 p369에서 유래. 같은 그림 2a에서와 같이, 임피던스의 감소는 T 세포의 복용량에 의존했다. 그림 2B 프로그램 10 시간에서 셀 인덱스는 T 세포의 범위에서 간단한 2 차 다항식을 따릅니다. 따라서, xCelligence 역 세포 지수의 하락으로 실시간 SKBR3 종양의 CD8 T 세포 매개 죽음을 모니터링합니다.

임피던스 기반의 분석은 항원에 특정한 T 세포를 감지

HER-2/neu의와 HLA-A2 양성 유방암 종양 세포 라인 SKBR3 임피던스의 감소는, HER-2/neu의에 의해 p369-특정 T 세포가 항원 인 경우 확인하려면 SKBR3을 포함한 특정 실, 분리 된 우물은 또한 배양 인플루엔자 (독감) 특정 T 세포 라인에서 파생 된 T 세포와. 독감 특정-T 세포는 HLA-A2 양성되고, 이외의 특정 컨트롤로 재직하지만, HER-2/neu의를 인식 할 수있는 능력을 가지고 있지. 인터넷에서 보는 바와 같이gure 3, 독감 특정 T 세포 (p <0.0001)에 비해 p369-특정 T 세포 HER-2/neu의의 용해성 활동 사이에 상당한 차이가 있습니다. 어떤 경우에는 종양에 대한 특정하지 T 세포 (예를 들어 독감 특정 또는 anti-CD3/anti-CD28이 자극) 용해성 활동 (그림 3A-B)의 낮은 수준을 보여 주었다. T 세포는 비특이적 FAS를 통해 두 가지 방법 중 하나를 죽일 수 : FAS 리간드 상호 작용 또는 항원 특정을 granzymes 및 perforins의 출시를 통해. 더 HER-2/neu-specific T 세포가 항원에 특정한 방식으로 살해되었다는 개념을 확증하기 위해, 우리는 FAS 리간드를 차단하는 항체를 포함. 그림 3b에서와 같이, 항체 HER-2/neu의 p369-특정 T 세포의 세포 용해 활성을 감소하지 않았다. 항체는 anti-CD3/CD28 구슬 비특이적 활성화했다 T 세포와 시연 FAS 및 FAS 리간드 사이의 상호 작용을 억제 할 수 있습니다. 이러한 결과는 제안하는 경우종양 특이 T 세포가 아닌 종양 특이 T 세포와 테스트, FAS 리간드 봉쇄는 최소 비 TCR 매개 상호 작용을 줄이기 위해 필요할 수 있습니다. 또한, 단기 배양 한 T 세포 라인을 사용하는 경우 T 세포의 일부분 만이 생체 생성에 사용되는 항원에 대한 특정되어있는, MHC 불일치 매개 T 세포 활성화의 가능성이 아닌 특정 용해에 이르는 발생할 수 있습니다. 이 경우에는,없는 HLAs을 차단 항체의 추가는 보증 할 수 있습니다. p369-특정 T 세포가 I 의존적으로, 두 항 HLA-클래스 I 항체 또는 이소 타입 제어 항체가 공동 문화에 추가 된 HLA 클래스에서 종양 세포를 죽이는되었는지 확인합니다. 로 p369-특정 T 세포에 의해 그림 3C, 용해에 표시가 HLA 클래스 나 제한을 보여주는 항체의 포함에 의해 억제되었다. 이 분석의 개발은 크게 SKBR3을 사용하여 수행 된 이후 마지막으로, 그것은 확인하기 위해 경우에 다른 부착 HLA-중요A2와 HER-2/neu의 발현 종양 세포는 p369-특정 T 세포에 의해 살해 될 수있다. 따라서, T 세포는 준비 HLA-A2와 HER-2/neu-expressing 종양 세포, SKBR3, MCF-7 및 HCC1419 세포에 1:5 비율로 첨가 하였다. HLA-A2 부정적인 종양 세포 라인은, BT20는 음성 대조군으로 사용 하였다. 같은 BT20 제외 그림 3D, 이러한 추가 종양 세포의 모든에 표시는 또한 임피던스에 의해 평가 죽었다. 따라서, 방법은 여러 대상 자기편 종양 세포에 유용 할 것으로 보인다.

임피던스 기반의 분석은 세포 독성 T 세포의 활동을 감지하는 표준 크롬 출시 분석보다 더 민감하다

세포 용해 활성을 측정 크롬 (51 크롬) 릴리스 분석 (CRA)은 긴 CD8 T 세포 반응을 모니터링하는 황금 표준되었습니다. 이 분석에서, 표적 세포 (예 : 종양 세포) 51 크롬으로 표시됩니다. 대부분의 경우, 건강한 표적 세포의 대부분을 유지할 수 있습니다분석의 과정을 통해 방사성. CD8 T 세포는 일반적으로 농도 변화에 표적 세포에 추가하고, 표적 세포의 죽이고있다가 중간에 51 크롬의 릴리스에 의해 감지됩니다. 그외에도 위험한 방사선을 사용하는 사실에서, CRA 두 가지 주요 문제는 감도의 부족이며, 분석은 일반적으로 자사의 유틸리티를 제한하는 CD8 T 세포의 대량이 필요합니다. 임피던스 기반의 분석은 레이블이없는 종양 세포 또는 포함하는 표준 폴리 프로필렌 플레이트를 포함하는 E-접시 하나에, 다양한 양, CRA, HER-2/neu의 p369-특정 T 세포가 체외응용에 생성 된 것보다 더 민감한 있는지 확인하려면 51 크롬 표시된 표적 세포. 측정하거나 임피던스 또는 무료 크롬은 T 세포뿐만 아니라 총 5 시간 째 측정 하였다. 그림 4, 대표적인 예는, 임피던스 분석이 크롬 버전을 능가하는 성능을 보여줍니다.

내부 분석의 변화임피던스 기반의 분석으로는 일반적으로 20 % 미만이다.

이 분석의 폭 넓은 사용이 대부분의 재현성과 변화 (그림 5)에 의해 결정되기 때문에 내부 분석 변화가 조사되었다. 두 p369-특정 T 세포 라인은 30 일 간격 독립적으로 생성 T 세포의 비율로 종양 세포의 범위 세중에 추가되었습니다. 라인 SKBR3 세포를 lysing의 측면에서 크게 동등 있었다 그림 5에서 삽입 된 그래프를 보여줍니다. 변화의 % 계수는 각 셀의 비율로 계산 꾸몄다되었다. 1시 40분과 1:5 비율 사이의 그림 5에서와 같이 변화 (CV)의 % 계수가 15 % 이하이었다. 1:2.5 및 1:1.25에서, 그러나, CVS는 높거나 예측할 수 있었다. 때문에 광범위한 생물학적 변화, 그것은 기본 T 세포 라인을 분석 간 변동을 측정 할 수 없습니다.

그림 1
그림 1. 임피던스는 T 세포의 추가에 따라 정규화해야합니다. 패널 A : 종양 세포 (빨간색 선)이 아니라 T 세포 (파란색 라인) 임피던스 책임이 있음을 보여줍니다. 혼자 종양 또는 T 중 하나 세포를 40 시간 동안 임피던스 트레이싱은 그림. 비슷한 결과는 두 번째 실험에서 얻은 하였다. . 약 20 시간의 신호 교란이 종양 세포를 포함하지 않는 우물에 T 세포의 추가 지점을 나타내는 패널 B: 임피던스 측정이 일시적으로 종양 세포에 대한 T 세포의 추가와 함께 중단되는 것을 보여줍니다. 이 T 세포 외에 다음과 같은 몇 가지 시점 (그래프에 표시된 정상화 시점 참조)에서 정상화가 필요합니다. 트레이스 데이터 중복 지점에서 구성됩니다. 혼자 종양 세포에 대한 추적이 빨간색으로 표시됩니다. 1.25 T 세포 / 녹색 종양 세포의 비율 : 다른 흔적은 종양 세포 HER-2/neu의 p369-특정 T 세포 (블루와 공동 배양을 나타냅니다 :) 세포 / 종양 40 T 세포의 비율입니다. 각각의 트레이스가 문화의 지속 시간을 5 분마다 수집 된 데이터 중복 지점에서 계산됩니다. 결과는 3 개의 분리 실험의 대표입니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. T 세포에 의해 임피던스 중재의 감소는 농도 의존적이다. 패널 : 보이는 것이 SKBR3 종양 세포의 임피던스 흔적이 단독으로 또는 종양 특정 T 세포의 농도를 변화와 함께 배양한다. 각각의 트레이스가 문화의 지속 시간을 5 분마다 수집 세중 데이터 포인트에서 계산됩니다. 결과는 3 개의 분리 실험을 대표하는 패널 B :. 세포 / 종양 세포의 농도는 모든 T를 통해 10시간에서 셀 인덱스은입니다. 점선은 종양 세포 AL에 셀 인덱스를 나타냅니다하나. 각 기호는 세중 결정의 평균 (± SEM)이다. 결과는 3 개의 분리 실험의 대표입니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 3
그림 3. 임피던스 기반의 분석은 항원 특이 세포 독성 T 세포 반응을 감지합니다. 패널은 HER-2/neu의 공동 문화에 따라 p369-특정 T 세포 (적색) 또는 독감 특정 T 5, 10의 세포 (청색), 15 시간까지 SKBR3 세포의 용해의 수준을 보여줍니다. 각 데이터 포인트는 세중의 측정의 평균 (± SEM)이다. 결과는 3 개의 분리 실험의 대표입니다. 패널 B는 항원에 특정한 용해가 FAS-FAS 리간드 상호 작용으로 인해하지 시연, p369-특정 T 세포 또는 비특이적 활성화 된 T 세포에 의해 SKBR3의 용해를 보여줍니다. 검은 막대 공동 문화를 대표하는FAS 리간드 항체가 포함되어 있습니다. 각 막대는 T 세포의 추가 총 ​​5 시간 째 세중의​​ 평균 (± SEM) 용해됩니다. 결과는 3 개의 분리 실험의 대표입니다. 패널 C 10 시간 p369-특정 T 세포에 의해 SKBR3의 T 세포 외에 후 용해를 보여줍니다 HLA-클래스 I에 의존적이다. HLA-클래스 I 차단 또는 이소 타입 컨트롤 중 하나는 공동 배양 중에 추가되었습니다. 각 막대는 세중의 평균 (± SEM) 용해됩니다. 이 실험은 유사한 결과를 두 번 반복 하였다. 패널 D는 10시간 p369-특정 T 세포에 의해 여러 HLA-A2 +, HER-2/neu-expressing 종양 세포 라인의 T 세포 외에 후 % 용해를 보여줍니다. BT20, HLA-A2 음성 유방암 세포 라인은 음성 대조군으로 사용 하였다. 각 자리 세중 결정에서 계산 된 독특한 실험을 나타냅니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 4. 임피던스 기반의 분석은 종양 항원에 특정한 T 세포의 탐지를위한 크롬 출시 분석보다 더 민감하다. 보이는이 종양 T 세포에 대하여 5 시간 째 측정 p369-특정 T 세포의 농도 변화에 대한 응답으로 SKBR3 %의 용해이다 임피던스 기반의 분석 및 크롬 자료 분석을 모두 사용하는 혼합. 각 기호는 세의 평균 (± SEM) 복제입니다. 결과는 3 개의 분리 실험의 대표입니다.

그림 5
그림 5. 임피던스 기반의 T 세포 세포 독성 분석의 편차 % 내부 분석 계수. 보이는이 항원에 특정한 T 세포의 농도 범위 SKBR3의 용해의 변화의 평균 (± SD) % 내부 분석 계수이다. 각 기호는 복제 세의 평균이다. 그래프에 표시된 숫자는 t이다그는 %의 약력을 의미합니다. 삽입 된 패널은 (± SEM의, N = 3) p369-377-특정 T 세포의 농도 변화에 SKBR3 %의 용해를 의미 보여줍니다. 두 개의 분리 된 기증자의 T 세포를 사용하여 두 개의 독립적으로 생성 p369-특정 T 세포 라인이 표시됩니다.

Discussion

CD8 T 세포에 직접 감염된 또는 악성 세포에게 4를 죽일 수있는, 적응 면역 반응에 중요하다. 항원에 특정한 CD8 T 세포 (예 : ELISPOT, 사량, 유동 세포 계측법)의 수를 측정하는 방법은 여러 가지가 있지만, 종종 이러한 세포가 3 기능적 세포 독성 여부를 알고 도움이됩니다. 세포 독성 기능을 평가하기위한 가장 인식 할 수있는 분석은 황금 표준 분석 4 간주됩니다 CRA입니다. CRA의 주요 한계는 방사능 (1) 요구 사항, 감도 (2) 부족, 기계론의 정보 (3) 부족, 세포의 대량 (4)를위한 요구 사항, 그리고 (5) 힘드는 세트까지입니다. 따라서, 지난 10 년 동안, 이러한 한계를 최소화하기 위해 새로운 전략을 채택에 관심이있어왔다. 새로운 접근 방식을 포함하는 측정하는 caspase의 릴리스 4, BLT 에스 테라 activity5, 및 CD107 6 표면 발현.에게 본 논문은 제안하는로슈 xCelligence 시스템에서 수행 임피던스 기반의 분석은 또한 CRA에 대한 대안으로 유용 할 수 있습니다. 임피던스 기반의 접근 방식을 적용 할 수있는 능력은 표면에 단단히 부착하지 않는 T 세포, 따라서 측정과 T 세포의 직접적인 간섭의 우려를 감소 임피던스에 많은 영향을 미칠 것으로 나타나지 않는 것을 관찰에 달려있다. 임피던스 분석 시스템 사용에 필요한 노동력은 훨씬 적은 주로 방사능의 사용에 대한 규제 문제의 제거로 인해 것으로 예상된다. 임피던스 기반 시스템의 유일한 주목할만한 단점은 50,000 달러에서 $ 60,000 지출이 xCelligence 단위의 구입이 필요합니다 것입니다. 그러나 xCelligence 장치는 방사선 카운터에 대한 필요성을 제거하고 T 세포 독성 8 이외에 약물 및 마이그레이션에 대한 세포 반응을 평가하는데 유용되고, 훨씬 더 다재다능하다.

그 관찰종양 세포의 임피던스 감소가 용량 의존적이며, 같은 간단한 보조 차 함수에 따라 합리적으로 가파른 기울기, 그림 2는 분석이 9 세포 독성 세포의 빈도를 추정하기 위해 희석 분석 (LDAs)를 제한하는 데 사용할 수 있다고 제안 . 임피던스 기반의 접근 방식을 가진 하나의 장점은 필요한 T 세포와 종양 세포의 수가 LDA는 잠재적으로 더 가능하고, CRA 미만이다. 예를 들어, CRA에 1시 40분 비율로 잘 당 1 × 10 5 종양 세포뿐만 당 4 X 10 6 총 T 세포를 필요로하는 도금입니다. 그러나, 임피던스 기반의 분석에 잘 당 1.5 × 10 4 종양 세포가 잘 당 6 × 10 5 총 T 세포를 소모하는 필요합니다. 따라서, 임피던스 기반의 분석은 85 % 이하 T 세포와 종양 세포를 사용합니다. 이 감소는 임피던스 기반의 시스템은 인간의 임상 실험에서 면역 감시에 적용 할 수 있다고 제안 여기서 t혈액의 그 볼륨은 제한 될 수 있습니다립니다. CRA가 하나의 시점에 제한되는 동안 또한, 임피던스 기반의 분석은 사용자가 최소한의 추가 노동과 세포와 같은 실험을 여러 용해 시점을 비교할 수 있도록, 지속적인 실시간 데이터를 수집합니다. 주파수 계산은 잠재적으로 총 10 항원에 특정한 CD8 T 세포에 기능적인 세포 독성 T 세포의 비율을 설정하는 등 사량 분석 등의 기능을 측정하지 않는 다른 전략과 결합 될 수있다. 임피던스 기반의 접근 방식의 가장 매력적인 기능 중 하나는 다른 대부분의 분석과는 달리, 세포 독성이 잠재적으로 쉽게 억제제 또는 항체의 사용과 세포의 상호 작용을 연구하고, 실시간으로 감시 할 수 있다는 것입니다. 또 다른 방법은 라벨에 저항 종양 세포에 적합 할 수 있다는 것입니다. 비 살해 종양 세포를 표시하고 유지되지 않기 때문에 마지막으로, 살균, 더 수확 T 세포 내성 세포 연구 possib입니다르.

두 시스템이 특정 T 세포의 질문에 답변 종양 살해 데이터를 제공하지만 요약하면, 임피던스 기반의 분석은 CRA보다 더 민감하고 더 유연한 플랫폼을 제공합니다.

Disclosures

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Acknowledgments

이 작품은 치료 재단과 NIH / NCI 9R01 CA152045 및 P50-CA116201를위한 수잔 G. 코멘에서 키스 L. Knutson의에 교부금에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03 Used to isolate PBMCs from blood
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV Cell culture media
FBS Denville Scientific FB5001-H Cell culture media
Human IL-2 eBioscience 14-8029-81 For stimulating growth of T cells
Human Interferon gamma Cell Sciences CR2026 For stimulating MHC expression in tumor cells
HER-2/neu p369-377 peptide Mayo Clinic peptide synthesis core amino acid sequence KIFGSLAFL Binds to HLA-A2
Influenza p58-66 peptide Mayo Clinic peptide synthesis core amino acid sequence GILGFVFTL Binds to HLA-A2
Human CD3/CD28 Dynabeads Invitrogen 111-61D For non-specific T cell activation and expansion
Chromium-51 MP Biomedicals 62015 CRA labeling reagent
E-plate Roche Group 05469830001 For xCelligence impedance unit
Luma plate 96 PerkinElmer, Inc. 6005630 For measuring radioactivity in the Top Count NXT.
xCelligence RTCA DP Station Roche Applied Science RTCA DP Impedance unit
Top Count NXT PerkinElmer, Inc. C990601 Scintillation & Luminescence Counter
Fas Ligand antibody BD Biosciences 556372 For blocking Fas-Fas ligand interactions
HLA-A2 BB7.2 antibody BD Biosciences 551230 For blocking HLA class I
Mouse IgG2b, κ BD Biosciences 555740 Isotype control for HLA class I
SKBR3 tumor line ATCC HTB-30 Adenocarcinoma
MCF7 tumor line ATCC HTB-22 Adenocarcinoma
HCC1419 tumor line ATCC CRL-2326 Primary ductal carcinoma
BT20 tumor line ATCC HTB-19 Carcinoma

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References

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