मल्टिप्लेक्स fluorometric immunoassay परीक्षण पद्धति और समस्या निवारण

Biology
 

Summary

Luminex निगम Xmap microsphere प्रौद्योगिकी का उपयोग करना, हम विभिन्न प्रयोगशाला जानवरों की प्रजातियों के serosurveillance के लिए मल्टिप्लेक्स fluorometric immunoassay (MFIA) विकसित किया है. एक निलंबन MFIA माइक्रोएरे जहां प्रतिजन, ऊतक नियंत्रण या immunoglobulins covalently रंग कोडित polystyrene microspheres से जुड़े होते हैं. MFIA परीक्षण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विधि विभिन्न समस्या निवारण विषयों को संबोधित किया है.

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Wunderlich, M. L., Dodge, M. E., Dhawan, R. K., Shek, W. R. Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting. J. Vis. Exp. (58), e3715, doi:10.3791/3715 (2011).

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Abstract

पशु जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में प्रयोग किया जाता मॉडल की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए हम नैदानिक ​​परीक्षण रणनीतियों और तरीकों के लिए निर्धारित करती है कि जानवरों के आकस्मिक संक्रामक एजेंटों (वायरस, mycoplasma, और अन्य दुराराध्य सूक्ष्मजीवों) को उजागर किया गया की एक संख्या विकसित किया है. असुरक्षित पशुओं के संक्रमण क्षणिक आम तौर पर कर रहे हैं, अभी तक संक्रमण के लिए सीरम एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं अक्सर सप्ताह के लिए दिनों के भीतर पता लगाया जा सकता है और मेजबान के जीवन भर जारी रहती है. सीरम विज्ञान प्राथमिक नैदानिक ​​पद्धति है जिसके द्वारा प्रयोगशाला पशुओं की निगरानी कर रहे हैं है. ऐतिहासिक अप्रत्यक्ष एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) serosurveillance के लिए मुख्य स्क्रीनिंग पद्धति किया गया है. एलिसा एक singleplex के रूप में किया जाता है, जिसमें एक माइक्रोबियल प्रतिक्रिया प्रतिजन एंटीबॉडी के प्रति अच्छी तरह से मापा जाता है. तुलना में MFIA एक मल्टिप्लेक्स परख के रूप में किया जाता है. चूंकि microspheres 100 अलग रंग सेट में आते हैं, के रूप में कई के रूप में 100 विभिन्न assays simultan किया जा सकता हैeously एक एकल microplate में अच्छी तरह से. इस नवाचार सीरम अभिकर्मकों, और disposables नियमित परीक्षण के लिए आवश्यक है, जबकि एक एक अच्छी तरह से परीक्षण से प्राप्त जानकारी की राशि में वृद्धि की मात्रा घट जाती है. इसके अलावा, हम कई आंतरिक नियंत्रण के मोती को शामिल करने के लिए नमूना और प्रणाली उपयुक्तता की पुष्टि और इस तरह के परिणामों की सटीकता को आश्वस्त करने में सक्षम हैं. ये ऊतक नियंत्रण और आईजीजी विरोधी परीक्षण सीरम प्रजातियों (αIg) immunoglobulin लेपित मनका सेट नमूना उपयुक्तता का मूल्यांकन करने में शामिल हैं. एलिसा और आइएफए में के रूप में, ऊतक नियंत्रण गैर विशिष्ट सीरम immunoglobulin के बंधन का पता लगाता है. αIg नियंत्रण (सीरम नियंत्रण) की पुष्टि करता है कि सीरम जोड़ दिया गया है और एक पर्याप्त immunoglobulin एकाग्रता शामिल है, जबकि आईजीजी नियंत्रण (सिस्टम उपयुक्तता नियंत्रण) मनका, सीरम प्रजातियों immunoglobulin साथ लेपित है, यह दर्शाता है कि लेबल अभिकर्मकों और Luminex पाठक ठीक से कार्य कर रहे हैं.

Protocol

1. MFIA प्रक्रिया की व्याख्या (1 चित्रा)

  1. MFIA चार्ल्स नदी प्रतिजन लेपित polystyrene (मोती) microspheres, परीक्षण सीरा, लेबल अभिकर्मकों (बैग, SPE) और buffers (प्राथमिक तनुकारक (वस्तु), परख बफर) की आवश्यकता है.
  2. अभिकर्मकों 96-अच्छी तरह से फिल्टर नीचे प्लेटें microtiter के कुओं stepwise जोड़ रहे हैं.
  3. के रूप में एक विषम परीक्षण अर्थ incubations फिल्टर धोने चरणों द्वारा पीछा कर रहे हैं अनबाउंड सीरम घटक को हटाने या लेबल अभिकर्मकों MFIA किया जाता है. धो समाधान प्लेट कुओं को जोड़ा जाता है अच्छी तरह से फिल्टर पैंदा, जो मोती बनाए रखने के माध्यम से आकांक्षा द्वारा हटाया.
  4. MFIA assays कमरे के तापमान (27 डिग्री सी / -2 डिग्री सेल्सियस) पर प्रदर्शन कर रहे हैं.
  5. एंटीजन एंटीबॉडी परीक्षण सीरम ऊष्मायन चरण के दौरान गठित परिसरों biotinylated बकरी विरोधी प्रजातियों (बैग) conjugates R-phycoerythrin लेबल streptavidin (SPE) द्वारा incubations द्वारा पता चला रहे हैं.
  6. परख पाठक, मोती एक समय में एक के माध्यम से गुजरतीएक डिटेक्टर, जहां वे दो लेज़रों को उजागर कर रहे हैं. एक लेजर आंतरिक रंगों है कि मनका रंग सेट है, जो एक परख के लिए मेल खाती की पहचान उत्तेजित, अन्य phycoerythrin संवाददाता परख के दौरान कब्जा डाई उत्तेजित. मोतियों की एक पूर्व निर्धारित संख्या में से परख प्रति पढ़ रहे हैं और phycoerythrin प्रतिदीप्ति की तीव्रता एक माध्य प्रतिदीप्ति इंडेक्स (एमएफआई) के रूप में सूचना दी है.

    चित्रा 1.
    1. MFIA प्रक्रिया चित्रा. Xmap आधारित MFIA एक निलंबन माइक्रोएरे जो रंग कोडित polystyrene 5.6 माइक्रोन मोती जो एंटीजन (या नियंत्रण) covalently जुड़े हुए हैं का इस्तेमाल है. चूंकि मोती 100 अलग रंग सेट में आते हैं, के रूप में कई के रूप में 100 विभिन्न assays एक एकल अच्छी तरह से परख चरणों में प्रदर्शन किया जा सकता फिल्टर नीचे प्लेटें microtiter में प्रदर्शन कर रहे हैं इतना है कि मोती एक निर्वात कई गुना पर आकांक्षा से धोया जा सकता है. प्रतिक्रियाओं Luminex Xmap 100 fluorometer के साथ पढ़ रहे हैं. phycoeryt की तीव्रताhrin प्रतिदीप्ति एक औसत प्रतिदीप्ति इंडेक्स (एमएफआई) के रूप में की सूचना दी है

2. इससे पहले प्रारंभ करना निम्नलिखित पर ध्यान दें:

  1. MFIA मोती प्रकाश के प्रति संवेदनशील होते हैं
    1. प्रत्यक्ष प्रकाश जोखिम की राशि को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रकाश जोखिम के सामान्य राशि है कि नियमित परीक्षण के दौरान होता है स्वीकार्य है, लेकिन लंबे समय तक निवेश मोती जो उन्हें परख पाठक द्वारा अपठनीय प्रस्तुत करना photobleaching के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
    2. कि MFIA मोती हमेशा निलंबन में vortexed कर रहे हैं और फिर sonicated (10-30 सेकंड) का उपयोग करने के पूर्व यह परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है.
    3. परख पाठक एकल मोतियों से ही जानकारी एकत्रित करता है. एकत्रित मनका समूहों के लिए अब समय पढ़ने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
  1. ऊष्मायन के सभी चरणों के दौरान परीक्षण प्लेट ढक्कन के साथ कवर प्लेट रखने परख समाधान के वाष्पीकरण से बचने के लिए सुनिश्चित.
  2. निजी सुरक्षा आवश्यक उपकरण: प्रयोगशाला कोट, जीएलoves और आंखों की सुरक्षा के सभी समय पर पहना जाना चाहिए, जबकि एक प्रयोगशाला स्थापित करने में काम कर रहे.

3. अभिकर्मकों

  1. तालिका 1 के लिए एक घर में MFIA प्रयोगशाला स्थापित करने के लिए आवश्यक सामग्री की सबसे शामिल हैं. अपर या डुप्लिकेट आइटम अपने विशिष्ट जरूरतों के आधार पर आवश्यक हो सकता है. कृपया ध्यान दें कि इस सूची में शामिल चार्ल्स नदी (MFIA मोती, नियंत्रण और पूरक अभिकर्मकों) से खरीदा अभिकर्मकों. कई biotinylated conjugates और streptavidin टैग phycoerythrin के वाणिज्यिक स्रोत उपलब्ध हैं. हालांकि चार्ल्स नदी से उपलब्ध अभिकर्मकों शोर स्कोर हमारे अभिकर्मकों के साथ इष्टतम संकेत उपज वैकल्पिक विक्रेताओं या अभिकर्मक स्थल का उपयोग किया गया titrated सिफारिश नहीं है.

    तालिका 1. सीआर rads Biotek से BioRad और स्वचालित microplate वॉशर से एक BioPlex सस्पेंशन ऐरे रीडर का उपयोग करता है. समतुल्य इंस्ट्रूमेंटेशन वैकल्पिक विक्रेताओं से उपलब्ध है.

    मद विक्रेता कुल संख्या
    उपकरण
    सस्पेंशन सरणी पाठक * BioRad 171-000205
    96 अच्छी तरह microplate वॉशर Biotek ELX50/8FMW
    अल्ट्रासोनिक क्लीनर / स्नान कोल पामर EW0884900
    एनालॉग भंवर मिक्सर VWR 58816-121
    -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर विभिन्न
    4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर विभिन्न
    12-चैनल pipettor, 20-200μl VWR 83009-718
    कक्षीय थाली हिलनेवाला VWR / लैब लाइन 57019-600
    एकल चैनल pipettors, सुझावों के साथ 20 200μl VWR 83009-732
    एकल चैनल pipettors, सुझावों के साथ 2 20μl VWR 83009-726
    एकल चैनल pipettors सुझावों के साथ 100-1000μl, VWR 83009-736
    Vacushield वेंट डिवाइस VWR 55095-006
    वैक्यूम दबाव पंप VWR 54908-037
    वैक्यूम प्रणाली अपशिष्ट जलाशय VWR 80200-640
    Disposables
    96-अच्छी तरह polystryrene प्लेट फिशर साइंटिफिक 14-245-145
    Multiscreen HTS-BV प्लेट, 1.2μm फिल्टर, styrene Millipore MSBV 50 N12
    15ml शंक्वाकार ट्यूब (polypropylene) Sarstedt 62554.002
    50ml शंक्वाकार ट्यूब (polypropylene) Sarstedt 62547.004
    सीरम शीशियों Sarstedt 72694.007
    एल्यूमीनियम पन्नी VWR 89079-068
    1L बोतलों बाँझ VWR 28199-246
    0.22μm बोतल टॉप फिल्टर VWR 28199-307
    अभिकर्मक जलाशयों (100ml) VWR 82026-356
    5ml, 10ml तरल अभिकर्मकों वितरण के लिए, 25ml pipets VWR
    अभिकर्मकों
    PBS, पीएच 7.4 1 बीएसए, पाउडर (पाउच) सिग्मा P3813
    300 ProClin / सिग्मा Supelco 48,912 - यू
    Microspheres Uncoated Luminex प्रकार के आधार पर विविध

4. अभिकर्मक तैयारी

  1. दो buffers MFIA प्रक्रिया के लिए आवश्यक हैं. प्राथमिक तनुकारक (वस्तु) चार्ल्स नदी से उपलब्ध है और मालिकाना अवरुद्ध एजेंटों को शामिल करने के लिए गैर विशिष्ट प्रोटीन बातचीत में कमी. परख धो बफर अपनी सुविधा पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों के साथ किया जाता है.
  2. परख धो बफर: पीबीएस / 1% BSA पीएच 7.4 सिग्मा Aldrich से एक पाउडर के रूप में उपलब्ध है.
    1. निस्पंदन द्वारा particulates हटाने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में इन particulates परख पाठक में मोज़री करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. बाँझ, लेबल कंटेनर में एक 0.2micron बोतल टॉप फिल्टर यूनिट के माध्यम से बफर फ़िल्टर करें.
    2. बैग और SPE उनकी परख धो बफर में 2X काम एकाग्रता पतला कर रहे हैं. नोट: SPE प्रकाश के प्रति संवेदनशील है और शould सीमित प्रकाश जोखिम है.

5. नमूना तैयार

  1. अपने परीक्षण सामग्री, अभिकर्मकों और disposables इकट्ठे.
    1. मल्टी और एकल चैनल micropipettes और सुझावों
    2. 96-ही कम प्रोटीन बाध्यकारी microtiter (सीरम dilutions) प्लेटें और फिल्टर नीचे प्लेटों (MFIA परख)
    3. अपने मानक प्रक्रिया के अनुसार रक्त नमूनों ले लीजिए. थक्का करने के लिए कमरे के तापमान पर centrifugation और सीरम हटाने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए उन्हें पकड़े द्वारा पूरी तरह से रक्त नमूनों की अनुमति दें. Undilute सीरम संक्षिप्त vortexed किया जाना चाहिए सीरम के नमूने के पूर्व घटकों मिश्रण.
    4. MFIA के लिए अंतिम परीक्षण कमजोर पड़ने 1/50 है. यह जरूरी है कि अपने परीक्षण सीरम की परख के लिए एक 2x नमूना (1/25). से 1 सीरम भाग 24 भागों MFIA प्राथमिक तनुकारक (वस्तु) जोड़कर undiluted परीक्षण सीरा पतला. अपने परीक्षण सीरम की एक microtiter 96 अच्छी तरह से थाली में संगठन काफी tes अपने नमूनों के हस्तांतरण के समय को कम कर देता हैटी थाली और अत्यधिक की सिफारिश की है.

6. टेस्ट प्लेट तैयार

  1. पूर्व टेस्ट 96-अच्छी तरह से थाली गीला करने के लिए उचित है, यह भी अच्छी तरह से निकासी बीमा की आवश्यकता है. यहां तक ​​कि अगर पूरी थाली इस कदम की आवश्यकता है शुरू में उपयोग नहीं किया जाएगा, तो आप बाद अभिकर्मक जोड़ने या खाली कुओं के लिए बफर धोने नहीं होगा.
    1. कुछ प्रयोगशालाओं परीक्षण प्लेट और एक बाद की तारीख में इन कुओं को फिर से उपयोग करने की योजना पर अप्रयुक्त कुओं सील द्वारा एक पूरी थाली 96-अच्छी तरह से कम चलाते हैं. हम इस पद्धति का उपयोग करते हैं क्योंकि यह परीक्षण थाली के समुचित निस्पंदन को प्रभावित कर सकते हैं सिफारिश नहीं है.
  1. उचित परीक्षण प्लेट आकांक्षा MFIA परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. नमूना कुओं की निकासी लगभग 5-10 सेकंड लेना चाहिए. अच्छी तरह से सामग्री भी जल्दी aspirating मनका एकत्रीकरण और धीमी गति से पढ़ा बार परख के अंत में करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
  2. हर w के बाद कागज तौलिये के साथ परीक्षण प्लेट के नीचे ब्लाटराख तरल जल निकासी सुनिश्चित करने के लिए कदम बंद कर दिया है. विफलता परीक्षण प्लेट को दाग तरल कुओं से बाहर ऊष्मायन और बकरी प्रजाति विरोधी और / या प्रजाति आईजीजी मनका स्कोर असफल में परिणाम के दौरान wicking अभिकर्मकों नेतृत्व कर सकते हैं. इन मोतियों को एक पूर्व निर्धारित MFI रेंज जब प्राथमिक सीरम और लेबल अभिकर्मकों की उचित मात्रा में एक अच्छी तरह से जोड़ रहे हैं के भीतर स्कोर करने के लिए डिजाइन किए हैं.

7. MFIA मनका सस्पेंशन तैयारी

  1. यह है कि मोती हमेशा और vortexed पहले sonicated उपयोग करने के लिए कर रहे हैं परख की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है. परख पाठक एकल मोतियों से ही जानकारी इकट्ठा, मनका समुच्चय या clumps बार अब पढ़ने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
  2. स्टॉक युग्मित भंवर मनका निलंबन (आमतौर पर ± 10 5 सेकंड)
  3. 10-20 सेकंड के लिए एक sonicator स्नान में sonication द्वारा पीछा मोती Resuspend.
  4. एक 2x काम प्राथमिक तनुकारक (वस्तु) में मनका निलंबन 20X स्टॉक निलंबन पतला. 2X मनका निलंबन की 50μl बांटनापूर्व गीला टेस्ट प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से परख.

8. टेस्ट और नियंत्रण सीरा के टेस्ट प्लेट के अलावा

  1. प्रत्येक 2X टेस्ट और सीरम नियंत्रण टेस्ट अपने पूर्वनिर्धारित प्लेट नक्शे पर आधारित प्लेट की पिपेट 50μl. एक इलास्टिक बैंड या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली और अंधेरे में एक कक्षीय, कमरे के तापमान पर हिलनेवाला पर 60minutes के लिए टेस्ट की थाली सेते हैं सुरक्षित ढक्कन.
    1. हिलनेवाला गति 400 से अधिक है, लेकिन कम से कम होना चाहिए 700rpm. यह महत्वपूर्ण है कि मोती निलंबन में रखा जाना सीरम एंटीबॉडी युग्मित प्रतिजनों के सभी सतहों के लिए उपयोग की अनुमति है. मोती को निलंबित रखने में विफलता के लिए कम आईजीजी मनका नियंत्रण स्कोर में परिणाम और परख के लिए दोहराया जाना चाहिए होगा.

9. वॉशिंग टेस्ट प्लेट

  1. अच्छी तरह से एक निर्वात कई गुना का उपयोग सामग्री Aspirate. नमूना कुओं की निकासी लगभग 5-10 सेकंड लेना चाहिए.
  2. पेप साथ परीक्षण प्लेट के नीचे ब्लाटr हर के बाद तौलिए के लिए तरल जल निकासी सुनिश्चित करने के लिए बंद कर दिया है.
  3. परख धो बफर के 50μl में मोती Resuspend. यह महत्वपूर्ण है कि मोती परख प्रक्रिया के दौरान बाहर सूखी की अनुमति नहीं है.

10. टेस्ट प्लेट बैग और SPE जोड़ना

  1. सभी MFIA मोती युक्त कुओं 2X काम कमजोर पड़ने बैग के 50μl बांटना. एक इलास्टिक बैंड या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली करने के लिए ढक्कन सुरक्षित है. इसके बाद के संस्करण के रूप में मिलाते हुए, साथ कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30minutes के लिए टेस्ट प्लेट सेते हैं.
    1. इस ऊष्मायन के बाद टेस्ट प्लेट धोने और परख धो बफर के साथ मोती resuspend पहले सीरम अलावा के बाद वर्णित.
  1. 2X काम कर रहे कमजोर पड़ने सभी MFIA मोती युक्त कुओं SPE के 50μl बांटना. एक इलास्टिक बैंड या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली करने के लिए ढक्कन सुरक्षित है. इसके बाद के संस्करण के रूप में मिलाते हुए, साथ कमरे के तापमान पर अंधेरे में 30minutes के लिए टेस्ट प्लेट सेते हैं.
    1. इस incu के बादbation टेस्ट प्लेट धोने और परख धो बफर के 125μl साथ मोती resuspend और प्लेट ~ दो मिनट के लिए हिला परख रीडर में रखने से पहले मोती resuspend.

11. टेस्ट प्लेट पढ़ना

  1. परख पाठक में मोती resuspending के 10 मिनट के भीतर परीक्षण प्लेट रखें. एक बिजली की विफलता या अन्य घटना की घटना में, टेस्ट प्लेट को पढ़ने के लिए तैयार करने के लिए 12 घंटे तक अंधेरे में कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है.
    1. पहले अच्छी तरह से नमूना सत्यापित करें कि चयनित मनका पैनल परीक्षण कुओं में मनका प्रोफाइल मैच को देखें. अगर वहाँ उनके नामित प्रोटोकॉल प्रदर्शन पर 'मनका क्षेत्र' के बाहर गिरने के मोती हैं, एक गलत प्रोफाइल चयन किया गया है.
    2. यदि मोती ठीक resuspended है कि वे उनके द्वारा निर्दिष्ट 'क्षेत्रों' परख पाठक सॉफ्टवेयर में संकेत में भरना चाहिए.
    3. यदि मोती एकत्रित कर रहे हैं कि वे अपने क्षेत्रों में एक धीमी गति पर भरना होगादर. आप पाठक से परीक्षण थाली को दूर कर सकते हैं और मैन्युअल कुओं resuspend. एक मल्टी चैनल pipettor 3-4 बार मनका समुच्चय को तोड़ने में सहायता करने के साथ प्रत्येक अच्छी तरह महीन चुर्ण बनाना. परीक्षण प्लेट रीडर में बदलें और जारी है.

12. प्रतिनिधि परिणाम

  1. मोतियों की एक न्यूनतम संख्या से परख प्रति पढ़ रहे हैं और तीव्रता के phycoerythrin प्रतिदीप्ति एक माध्य प्रतिदीप्ति (एमएफआई) सूचकांक 0 से 32,667 से लेकर के रूप में सूचना दी है. 25 की गिनती की तुलना करने के बाद, हम अच्छी तरह से 50 प्रतिशत या 100 मोतियों कोई सांख्यिकीय अंतर देखा और नियमित रूप से प्रति नमूना एजेंट प्रति 25 मोती अच्छी तरह से गिनती. अपर्याप्त मनका मायने रखता है या आईजीजी / विरोधी आईजीजी मनका स्कोर असफल के रूप में ऐसी त्रुटियों के लिए परिणाम की रिपोर्ट की जांच करना. इन मोतियों को एक पूर्व निर्धारित MFI सीमा के भीतर 'स्कोर' जब प्राथमिक सीरम और लेबल अभिकर्मकों की उचित मात्रा में एक अच्छी तरह से जोड़ रहे हैं डिजाइन किए हैं. त्रुटियों के साथ नमूना कुओं, (कम मनका मायने रखता है) या असफल आईजीजी नियंत्रण मनका स्कोर चाहिएमान्य परिणाम प्राप्त करने के लिए दोहराया.
  2. एक Excel कार्यपत्रक परिणाम निर्यात. हमारे डेटा की व्याख्या के लिए प्रत्येक परख सौंपा है:
    1. एक ऊतक नियंत्रण (टीसी) टेस्ट: सबसे कृंतक MFIA assays के लिए, ऊतक नियंत्रण जंगली प्रकार baculovirus संक्रमित कीट कोशिकाओं का एक उद्धरण है.
    2. एक परख Cutoff: यह मूल्य न्यूनतम प्रतिदीप्ति की उम्मीद है और प्रत्येक के निदान सटीकता को अधिकतम परख के लिए समायोजित. ज्यादातर assays के लिए, प्रतिदीप्ति cutoff 3000 है.
  1. नेट माध्य प्रतिदीप्ति सूचकांक (एमएफआई) निम्न सूत्र द्वारा प्रत्येक परख (ऊतक और आईजीजी नियंत्रण परीक्षणों को छोड़कर) के लिए गणना की है. दूसरे शब्दों में, विशिष्ट परख संकेत कुल परख एमएफआई ऋण टीसी एमएफआई (पृष्ठभूमि) यह मान तो 1000 से विभाजित है जो केवल 0-32 0-32,667 के बजाय के बीच नेट एमएफआई के रेंज सेट है.

    नेट एमएफआई = (एमएफआई एंटीबॉडी परख - एमएफआई ऊतक नियंत्रण) / 1000

    Neटी MFI और टीसी MFI परख प्रत्येक प्रतिजन के लिए विशिष्ट Cutoff तुलना से स्कोर करने के लिए परिवर्तित कर रहे हैं.

    चित्रा 2.


    चित्रा 2. प्रतिनिधि परीक्षण सीरा के लिए सभी आईजीजी के साथ MFIA डेटा गुजर नियंत्रित करता है.

  1. 12.4 MFIA व्याख्या
    1. टेस्ट प्लेट परिणाम केवल अगर नियंत्रण प्रणाली के उपयुक्तता और सीरम नियंत्रण (आईजीजी / विरोधी आईजीजी मोती) परिणाम तालिका 2 में सूचीबद्ध स्वीकृति मानदंडों को पूरा व्याख्या की जानी चाहिए. इन दो आईजीजी नियंत्रण मोतियों की विफलता अनुचित कमजोर पड़ने या अपर्याप्त मात्रा संयुग्म या एसपीई, अनुचित परीक्षण सीरम या एक immunocomprimised जानवर से सीरम के कमजोर पड़ने उपयोग के रूप में कई प्रक्रियात्मक त्रुटियों का संकेत कर सकते हैं.

      तालिका 2

      परख नियंत्रण के लिए स्वीकृति मानदंड
      नियंत्रण स्वीकार्य परिणाम
      स्कोर वर्गीकरण
      उच्च रेंज प्रतिरक्षा सीरम 4.5 ≥ सकारात्मक
      कम रेंज प्रतिरक्षा सीरम 1.5 ≥ ≥ बॉर्डरलाइन
      गैर प्रतिरक्षा सीरम 2.5 < ≤ बॉर्डरलाइन
      तनुकारक (वस्तु) 2.5 < ≤ बॉर्डरलाइन
      पुलिस महानिरीक्षक मनका * सेट Cutoff/1000 ≥ पास

      * मनका प्रजाति विशेष के सीरम विरोधी परीक्षण immunoglobulin (आईजी) के साथ लेपित सेट: इस नमूना उपयुक्तता नियंत्रण के लिए असफल स्कोर अपर्याप्त नमूना के अलावा से परिणाम, उच्च भी सकता है एक मन्दन नमूना, गलत प्रजातियों एक immunodeficient हो से या परीक्षण सीरमसेंट.

    1. यदि टेस्ट प्लेट परख नियंत्रण के किसी भी उच्च श्रेणी प्रतिरक्षा सीरम को छोड़कर असफल, परिणाम स्वीकार्य नहीं है और दोहराया जाना चाहिए. पासिंग कम रेंज सीरम नियंत्रण स्कोर महत्वपूर्ण हैं क्योंकि यह परीक्षण प्लेट का पता लगाने संवेदनशीलता स्तर को दर्शाता है.
    2. बकरी विरोधी प्रजातियों आईजीजी मनका स्कोर प्राथमिक परीक्षण सीरम की परख करने के लिए जोड़ा राशि पर आधारित है. यदि इस पर नियंत्रण मनका विफल रहे लेकिन प्रजातियों आईजीजी गुजरता (वैसे B1, Fig.3) तो यह इंगित करता है कि पर्याप्त परीक्षण अभिकर्मकों (बैग, SPE) अच्छी तरह परीक्षण करने के लिए जोड़ा गया था और यह एक सीरम से संबंधित मुद्दा है. यदि परीक्षण अभिकर्मकों की राशि एक विशेष रूप से अच्छी तरह से अपर्याप्त है दोनों आईजीजी और विरोधी आईजीजी नियंत्रण मोती (वैसे E1, Fig.3) असफल हो जायेगी.

      चित्रा 3.
      चित्रा 3 विफलताओं के साथ प्रतिनिधि MFIA परीक्षण के परिणाम (नारंगी में संकेत). वेल्स A1, C1, और F1 एक टीसी विफलता (ऊतक प्रतिक्रियाशील) से संकेत मिलता हैजहां टीसी स्कोर कोष्टक में प्रतिनिधित्व किया है. वेल्स B1 और E1 आईजीजी आंतरिक नियंत्रण विफलताओं, अपर्याप्त परीक्षण प्रतिरक्षी (बी 1) या (E1) परीक्षण अभिकर्मकों बैग / SPE क्रमशः के दो प्रकार वर्णन.

    1. यदि टेस्ट प्लेट परख नियंत्रण परिणाम संतोषजनक रहे हैं, व्यक्तिगत परख स्कोर 3 तालिका में दिखाया के रूप में वर्गीकृत किया जाता है. यह करने के लिए किसी भी सीमा या सकारात्मक एक वैकल्पिक परीक्षण विधि द्वारा खोज की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है.

      तालिका 3

      MFIA कुल वर्गीकरण
      स्कोर वर्गीकरण
      TC शुद्ध टीसी + नेट *
      2 ≥ 0.5 < 2.5 < (-) नकारात्मक
      2.5 ≥ टीसी रिएक्शन (टी)
      <2 1.5 < -
      1.5 ≤ एक्स <2.5 बॉर्डरलाइन (बी)
      2.5 ≥ सकारात्मक (+)

      * नकारात्मक एक वर्गीकरण अभी भी एक गैर शून्य टीसी स्कोर के साथ निर्धारित किया जा सकता है TC + नेट स्कोर (= एजी स्कोर) नकारात्मक है

Discussion

MFIA परीक्षण की प्रक्रिया अत्यधिक कुशल है, कम उपकरण और छोटे नमूना पारंपरिक singleplex परीक्षण की तुलना में और अभिकर्मक मात्रा की आवश्यकता होती है. मल्टीप्लेक्स प्रणाली की कार्यक्षमता उपयोगकर्ता के कई उपभेदों या आम एजेंटों के सीरमप्रकारों प्रयोगशाला कृन्तकों में (यानी coronavirus, parvoviruses आदि) के लिए एक साथ स्क्रीन लचीलापन देता है. यह भी हमारे लिए सक्षम बनाता है, ब्याज (ie. विशिष्ट वायरस परिवार) के क्षेत्र के आधार पर अनुकूलित मनका पैनल डिजाइन और साइटोकिन्स और अन्य biomarkers सहित biomolecules की स्क्रीनिंग के अन्य प्रकार के लिए अनुकूल है. इसके अलावा, यह हमें कई आंतरिक नियंत्रण assays को शामिल करने के लिए नमूना और प्रणाली उपयुक्तता को सत्यापित करने और इस तरह के परिणामों की शुद्धता को आश्वस्त करने के लिए अनुमति देता है. ये ऊतक नियंत्रण और आईजीजी विरोधी परीक्षण सीरम प्रजातियों (αIg) immunoglobulin लेपित मनका सेट नमूना उपयुक्तता का मूल्यांकन करने में शामिल हैं. एक ऊतक नियंत्रण मनका सीरम immunoglobulin के बंधन गैर विशिष्ट और αIg मनका नियंत्रण की पुष्टि करता है का पता लगाता हैकि सीरम जोड़ दिया गया है और एक पर्याप्त immunoglobulin एकाग्रता शामिल हैं. दूसरा नियंत्रण मनका, सीरम प्रजातियों की immunoglobulin साथ लेपित, यह दर्शाता है कि लेबल अभिकर्मकों और परख पाठक ठीक से कार्य कर रहे हैं. अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मल्टीप्लेक्स प्रारूप serologic assays (यानी, प्रोटीन ImmunoComb) परिणाम पुष्टि की यह एक ही स्तर पर नहीं की पेशकश कर सकते हैं.

परख की विफलता के संभावित स्रोत retesting करने से पहले नीचे संकीर्ण करने की क्षमता में मदद कर सकते हैं एक अन्वेषक समय और सामग्री को बचाने के. MFIA के महत्वपूर्ण पहलुओं को एक असफल नमूना दोहरा से पहले पुष्टि की जानी चाहिए. चूंकि परख परिवेश के तापमान पर आयोजित किया जाता है यह सत्यापित किया जाना चाहिए कि प्रयोगशाला तापमान लगभग 27 डिग्री सेल्सियस ± 2 डिग्री सेल्सियस, उच्च तापमान के नियंत्रण और नमूने के लिए उम्मीद स्कोर की तुलना में कम हो सकता है. वॉशिंग शायद इस परख में सबसे महत्वपूर्ण कदम है. बीमा है कि परीक्षण प्लेट ठीक से धोया जाता है blotted, और resuspended समाप्त कर सकते हैंकम मनका (एकत्रित मोती की वजह से) गिनती या अपर्याप्त अभिकर्मक अलावा परीक्षण थाली फिल्टर नीचे से बाहर wicking द्वारा खो कारण नमूना त्रुटियों के विशाल बहुमत. हम नियमित रूप से परख प्रति 25 मोती (एजेंट) गिनती और मोती जो भी थाली के लिए एक लंबे समय तक पढ़ने के लिए समय के लिए नेतृत्व करेंगे के उच्च संख्या गिनती कर परिणाम में कोई अंतर पाया गया सांख्यिकीय.

हम आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रयोगशाला जानवरों की कई प्रजातियों (माउस, चूहा, हैम्स्टर, गिनी पिग और खरगोश) MFIA की व्यापक सत्यापन अध्ययन का प्रदर्शन किया है करने के लिए जाना जाता है सकारात्मक और नकारात्मक सीरम नमूनों की बड़ी संख्या के परीक्षण के द्वारा निदान सटीकता, reproducibility, और ruggedness प्रदर्शन, और उनके एलिसा आइएफए, और MFIA परिणाम की तुलना. MFIA का पता लगाने सीमा (यानी, मानक प्रतिरक्षा सीरम अनुमापन endpoints) के बराबर थे, और कुछ मामलों में पार कर, उन इसी एलिसा के. नैदानिक ​​विशिष्टता, एसपीएफ़ कृंतक सीरा के साथ मापा, 99% से अधिक, समग्र पत्राचार between एलिसा और MFIA ज्ञात सकारात्मक और ज्ञात नकारात्मक सीरा पर प्रदर्शन के 95% से अधिक था. संक्षेप में, इन परिणामों से साबित कर दिया कि मल्टीप्लेक्स MFIA singleplex एलिसा के लिए एक अच्छा वैकल्पिक है, और प्रयोगशाला पशु कालोनियों के नियमित serosurveillance में अपने उद्देश्य का उपयोग यानी, के लिए उपयुक्त है.

Disclosures

सभी लेखकों चार्ल्स नदी rads, पशु रक्तोदकविज्ञान परीक्षण सेवाओं और अभिकर्मकों के एक प्रमुख प्रदाता के लिए काम करते हैं.

Acknowledgments

यहाँ प्रस्तुत शोध चार्ल्स नदी द्वारा समर्थित किया गया.

References

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