Multiplexade Fluorometrisk immunoassay testmetoder och felsökning

Biology
 

Summary

Använda Luminex Corporation xMAP mikrosfär teknik har vi utvecklat den multiplexerade Fluorometrisk immunoassay (MFIA) för seroövervakning olika försöksdjurart. Den MFIA är en suspension microarray där antigenet, vävnadskontroll eller immunglobuliner är kovalent bundna till färgkodade polystyren mikrosfärer. Den MFIA testmetoden samt olika felsökningsämnen riktar sig till.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Wunderlich, M. L., Dodge, M. E., Dhawan, R. K., Shek, W. R. Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting. J. Vis. Exp. (58), e3715, doi:10.3791/3715 (2011).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

För att säkerställa kvaliteten på djurmodeller som används inom biomedicinsk forskning har vi utvecklat ett antal diagnostiska tester strategier och metoder för att avgöra om djuren har utsatts för främmande smittämnen (virus, mykoplasma och andra kräsna mikroorganismer). Infektioner i immunkompetenta djur är i allmänhet övergående, men serum antikroppssvar infektionen ofta kan upptäckas inom några dagar till veckor och kvarstår under hela värden. Serologi är den primära diagnostiska metoder med vilka försöksdjur övervakas. Historiskt indirekt enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) har varit den främsta screening metod för seroövervakning. ELISA utförs som en singleplex, i vilken en mikrobiell antigen-antikroppsreaktion mäts per brunn. I jämförelse MFIA utförs som en multiplexerad analys. Eftersom mikrosfärerna kommer i 100 distinkta färguppsättningar, kan så många som 100 olika analyser utföras simultantappning i en enda mikroplatta väl. Denna innovation minskar mängden serum, reagens och förbrukningsvaror som krävs för rutintestning samtidigt öka mängden information som erhålls från en enda testbrunn. Dessutom kan vi införliva flera interna kontroll pärlor att verifiera prov och system lämplighet och därmed säkerställa noggrannheten av resultaten. Dessa inkluderar vävnadskontroll och IgG-anti-testserum arter immunglobulin (αIg) belagda pärla uppsättningar för att utvärdera prov lämplighet. Såsom i ELISA och IFA, detekterar vävnadskontrollen icke-specifik bindning av serum immunglobulin. Den αIg styrning (Serum kontroll) bekräftar att serum har lagts till och innehåller en tillräcklig immunglobulinkoncentrationen medan IgG-kontroll pärla (System Lämplighet kontroll), belagd med serum arter immunglobulin, visar att de märkta reagens och Luminex läsare fungerar korrekt.

Protocol

1. Förklaring av MFIA förfarande (figur 1)

  1. Den MFIA kräver Charles River s antigenbelagda polystyren mikrosfärer (pärlor), testserum, märkta reagens (BAG, SPE) och buffertar (Primär spädningsmedel, analysbuffert).
  2. Reagensen tillsätts stegvis till brunnarna i 96-brunnars filtrera-botten mikrotiterplattor.
  3. Den MFIA utförs som en heterogen prov betydelse inkubationer följs av filter-tvättsteg för att avlägsna obundna serum beståndsdelar eller märkta reagens. Tvätt-lösning till tallrik brunnar avlägsnas genom aspiration genom väl filter-bottoms, som behåller pärlorna.
  4. De MFIA analyser utförs vid rumstemperatur (27 ° C + / -2 ° C).
  5. Antigen-antikroppskomplex bildas under testserumet inkubationssteget detekteras genom inkubationer med biotinylerade get-anti-arter konjugat (BAG) följt av R-fykoerytrin-märkt streptavidin (SPE).
  6. I analysen läsaren, pärlorna passerar en i taget genomen detektor där de utsätts för två lasrar. En laser hetsar de interna färgämnen som identifierar pärlan färg set, vilket motsvarar en analys, den andra exciterar fykoerytrin reporterfärgämnet fångas under analysen. Ett förutbestämt antal kulor läses per analys och intensiteten av fykoerytrin fluorescens redovisas som en Median Fluorescence index (MFI).

    Figur 1.
    Figur 1. MFIA arbetsordningen. Den xMAP-baserade MFIA är en suspension microarray som använder färgkodade polystyren 5,6 micron pärlor som antigener (eller kontroller) är kovalent länkade. Eftersom pärlorna finns i 100 distinkta färguppsättningar, kan så många som 100 olika analyser utföras i en enda brunn Assay steg utförs i filter-botten mikrotiterplattor så att pärlorna kan tvättas genom aspiration på en vakuumrör. Reaktioner läses med Luminex xMAP 100 fluorometer. Intensiteten av phycoerythrin fluorescens redovisas som en median fluorescens index (MFI)

2. Innan Komma igång Vänligen notera följande:

  1. De MFIA pärlorna är ljuskänsliga
    1. Begränsa mängden direkt ljusexponering är avgörande. Den normala mängden ljusexponering som inträffar under rutintestning är acceptabelt men långvarig exponering kan leda till fotoblekning av pärlorna som gör dem oläsliga genom analys läsaren.
    2. Det är avgörande för framgången för analysen att MFIA pärlorna alltid vortexas i suspension och därefter ultraljudsbehandlades (10-30 sekunder) före användning.
    3. Analysen läsaren samlar in information från enstaka pärlor bara. Aggregerade pärla kluster kan leda till längre läsa gånger.
  1. Var noga med att hålla testplattan täckt med plattan lock under alla inkubationssteg för att undvika avdunstning av analys-lösningar.
  2. Personlig skyddsutrustning som krävs: laboratorierock, glOves och skyddsglasögon bör användas vid alla tillfällen när du arbetar i en laboratoriemiljö.

3. Reagens

  1. Tabell 1 innehåller de flesta av det material som behövs för att upprätta en egen MFIA laboratorium. Ytterligare eller dubbletter kan behövas beroende på dina specifika behov. Observera att denna inventering utesluter reagenser köpts från Charles River (MFIA pärlor, kontroller och kompletterande reagens). Flera kommersiella källor till biotinylerade konjugat och streptavidin märkt fykoerytrin finns tillgängliga. Emellertid reagensen tillgängliga från Charles River har titrerats för att ge den optimala signal-brus poäng med våra reagens, med användning av alternativa leverantörer eller partier reagens rekommenderas inte.

    Tabell 1. CR-RADS använder en BioPlex läsare Suspension Array från BioRad och automatiserad mikroplatt bricka från BioTek. Ekvivalent instrumentering är tillgänglig från alternativa leverantörer.

    Punkt Leverantör Katalognummer
    Utrustning
    Suspension array läsare * BioRad 171-000205
    96-brunnars mikroplatta bricka BioTek ELX50/8FMW
    Ultraljud renare / bad Cole Palmer EW0884900
    Analog virvelblandare VWR 58816-121
    -20 ° C frys Olika
    4 ° C kylskåp Olika
    12-kanals pipett, 20-200 | il VWR 83009-718
    Orbital plattskakare VWR / Lab-Line 57019-600
    Enkanaliga pipetter, 20-200 ^, med tips VWR 83009-732
    Enkanaliga pipetter, 2-20 ^, med tips VWR 83009-726
    Enkanaliga pipetter, 100-1000μl, med tips VWR 83009-736
    Vacushield Vent enhet VWR 55095-006
    Vakuum tryckpump VWR 54908-037
    Vakuumsystem avfall behållare VWR 80200-640
    Förbrukningsmateriel
    96-brunnars polystyren platta Fisher Scientific 14-245-145
    MultiScreen HTS-BV platta, 1.2μm filter, styren Millipore MSBV N12 50
    15ml koniska rör (polypropen) Sarstedt 62554.002
    50 ml koniska rör (polypropen) Sarstedt 62547.004
    Serumvialerna Sarstedt 72694.007
    Aluminiumfolie VWR 89079-068
    1L flaskor, sterila VWR 28199-246
    0.22μm flaska-top filter VWR 28199-307
    Reagensbehållare (100 ml) VWR 82026-356
    5ml, 10ml, 25 ml pipetter för utmatning av flytande reagens VWR
    Reagens
    PBS, pH 7,4 1 BSA, pulver (påsar) Sigma P3813
    ProClin 300 Sigma / Supelco 48.912-U
    Obelagd mikrosfärer Luminex varieras baserat på typen

4. Reagensberedning

  1. Två buffertar behövs för MFIA förfarandet. Primär utspädningsmedel är tillgänglig från Charles River och innehåller egna blockeringsmedel för att minska icke-specifika proteininteraktioner. Analys tvättbuffert görs på din anläggning med kommersiellt tillgängliga reagens.
  2. Analys Tvättbuffert: PBS / 1% BSA pH 7,4 är tillgängligt som ett pulver från Sigma-Aldrich.
    1. Borttagning av partiklar genom filtrering är avgörande eftersom dessa partiklar kan leda till träskor i analysen läsaren. Filtrera bufferten genom 0.2micron flaska-top filterenheten i sterila märkta, behållare.
    2. BAG och SPE späds till sin 2X arbete koncentration i analys tvättbuffert. Obs: SPE är ljuskänsligt och should har begränsad ljusexponering.

5. Provberedning

  1. Montera din testning material, reagens och engångsmaterial.
    1. Multi-och enkanaliga mikropipetter och tips
    2. 96-håls låg proteinbindning mikrotiterplattor (serumspädningar) och filter-bottenplattor (MFIA analys)
    3. Samla blodprover enligt din standardförfarande. Låt blodprover att koagulera helt genom att hålla dem i rumstemperatur i minst 30 minuter innan centrifugering och serum avlägsnande. Undilute serum bör vortex kort att blanda serumkomponenter före provtagningen.
    4. Den slutliga testningen utspädning för MFIA är 1/50. Det är nödvändigt att göra en 2X (1/25) prov på din testserum för analysen. Späd den outspädda testsera genom att tillsätta 1 del serum till 24 delar MFIA Primär Diluent. Organisation av din testserum i en 96-brunnars mikrotiterplatta minskar avsevärt överföringstiden för dina prover till TESt plattan och rekommenderas starkt.

6. Testplatta Preparation

  1. Förvätning av 96-brunnars platta test krävs för att säkerställa korrekt, även väl evakuering. Även om hela plattan inte ska användas detta steg initialt krävs kommer du inte lägga efterföljande reagens eller tvättbuffert de tomma brunnarna.
    1. Vissa laboratorier kör mindre än en full 96-brunnsplatta genom att avskärma de oanvända brunnar på testplattan och planerar att återanvända dessa brunnar vid ett senare tillfälle. Vi rekommenderar inte att använda den här metoden eftersom det kan inverka negativt på filtrering av provet plattan.
  1. Korrekt testplatta strävan är avgörande för framgång MFIA analysen. Evakuering av provbrunnar bör ta cirka 5-10 sekunder. Aspirera de väl innehållet alltför snabbt kan leda till pärla aggregering och långsam läsa gånger i slutet av analysen.
  2. Blot undersidan av testplattan med pappershanddukar efter varje vaska steg för att säkerställa flytande dränering har stoppats. Underlåtenhet att utplåna testplattan kan leda till flytande reagens fuktspridande ur brunnarna under inkubation och resultera i inte get anti-arter och / eller arter IgG pärla poäng. Dessa pärlor är utformade för att mål inom ett förutbestämt intervall MFI när lämplig mängd primär serum och märkta reagens sätts till varje brunn.

7. MFIA pärlsuspension Förberedelser

  1. Det är avgörande för framgången för analysen att pärlorna alltid virvlades och ultraljudbehandlades före användning. Analysen läsaren samlar in information från enstaka pärlor enbart kan bead aggregat eller klumpar leder till längre läsa gånger.
  2. Vortex beståndet kopplade pärlsuspension (typiskt 10 ± 5 sekunder)
  3. Återsuspendera pärlorna följt av sonikering i en sonikator bad i 10-20 sekunder.
  4. Späd 20X mäldsuspension till en 2X arbetar pärlsuspension i Primär diluent. Fördela 50 ^ av den 2X pärlsuspensiontill varje analysbrunn av pre-våta testplatta.

8. Tillsättning av test-och kontrollsera på testplattan

  1. Pipettera 50 pl av varje 2X Test och kontrollserum till testplattan baserat på din fördefinierade tallrik karta. Säkra locket på plattan med ett gummiband eller aluminiumfolie och inkubera testplattan för 60 minuter på en skakapparat, i mörker vid rumstemperatur.
    1. Shakern hastigheten skall vara större än 400 men mindre än 700rpm. Det är viktigt att pärlorna hållas i suspension för att tillåta serumantikroppar tillgång till alla ytor hos de kopplade antigenerna. Underlåtenhet att hålla pärlorna suspenderades kommer att resultera i låga IgG strängstyrning poäng och analysen måste upprepas.

9. Tvättning testplattan

  1. Aspirera väl innehållet med hjälp av en vakuum-grenrör. Evakuering av provbrunnar bör ta cirka 5-10 sekunder.
  2. Blot undersidan av testplattan med paper handdukar efter varje för att säkerställa flytande dränering har upphört.
  3. Återsuspendera pärlorna i 50 pl analysbuffert tvättbuffert. Det är viktigt att pärlorna inte får torka ut under analysprocessen.

10. Lägga BAG och SPE till testplattan

  1. Fördela 50 pl 2X arbeta utspädning BAG till alla brunnar innehåller MFIA pärlor. Säkra locket till plattan med ett elastiskt band eller aluminiumfolie. Inkubera testplattan för 30minutes med skakning såsom ovan, i mörker vid rumstemperatur.
    1. Efter denna inkubation tvätta testplattan och resuspendera kulorna med analys tvättbuffert som tidigare beskrivits efter serum tillägg.
  1. Fördela 50 pl 2X arbeta utspädning SPE till alla brunnar innehåller MFIA pärlor. Säkra locket till plattan med ett elastiskt band eller aluminiumfolie. Inkubera testplattan för 30minutes med skakning såsom ovan, i mörker vid rumstemperatur.
    1. Efter denna incubation tvätta testplattan och resuspendera kulorna med 125μl av analys tvättbuffert och skaka plattan ~ två minuter för att resuspendera kulorna före utsläppandet på analysen läsaren.

11. Läsa testplattan

  1. Placera testplattan i analysen läsaren inom 10 minuter från återsuspendering av pärlorna. I händelse av strömavbrott eller annan händelse kan testplattan förvaras i rumstemperatur i mörker upp till 12 timmar tills att läsa.
    1. Observera det första provet väl att kontrollera att den valda pärlan panelen matchar strängprofil i testbrunnarna. Om det finns pärlor som faller utanför deras utsedda "pärla region" på protokollet displayen har en felaktig profil val gjorts.
    2. Om pärlorna har rätt resuspenderas bör fylla i sina angivna "regioner" som anges i analysen Reader.
    3. Om pärlorna aggregeras de fyller i sina regioner i långsamtakt. Du kan ta bort testplattan från läsaren och manuellt resuspendera brunnarna. Finfördela varje brunn med en flerkanalig pipett 3-4 gånger för att hjälpa till att bryta upp aggregaten vulsten. Byt ut testplattan i läsaren och fortsätta.

12. Representativa resultat

  1. Ett minsta antal kulor läses per analys och intensiteten av fykoerytrin fluorescens redovisas som Median fluorescens index (MFI) som sträcker sig från 0 till 32.667. Efter jämföra räkningar av 25, 50 eller 100 kulor per brunn såg vi ingen statistisk skillnad och rutinmässigt räkna 25 kulor per medel per provbrunn. Undersöka resultaten rapporten för fel, såsom otillräckliga pärla räknas eller misslyckas IgG / anti-IgG pärla poäng. Dessa pärlor är utformade för att "poäng" inom ett förutbestämt område MFI när lämplig mängd primär serum och märkta reagens sätts till varje brunn. Provbrunnar med fel, (lågt pärla räknas) eller att inte IgG kontroll pärla poäng börupprepas för att förvärva giltiga resultat.
  2. Exportera resultatet till ett Excel-kalkylblad. För vår tolkning av data varje analys är tilldelad:
    1. En vävnad Control (TC) Test: För de flesta analyser gnagare MFIA är vävnadskontrollen ett extrakt av vildtyp baculovirus-infekterade insektsceller.
    2. En analys Cutoff: Detta värde är den minsta fluorescens väntat och justeras för varje analys för att maximera diagnostisk noggrannhet. För de flesta analyser, är den fluorescens cutoff 3000.
  1. Netto Median Fluorescence index (MFI) beräknas för varje analys (utom vävnad och IgG kontrolltester) genom följande formel. Med andra ord, är den specifika assaysignalen den totala analysen MFI minus TC (bakgrund) MFI-Detta värde delas sedan med 1000 som helt enkelt anger intervallet av Net MFI mellan 0-32 istället för 0-32,667.

    Net MFI = (MFI antikroppsanalys - MFI vävnadskontroll) / 1000

    Net MFI och TC MFI omvandlas till poäng i jämförelse med analysen Cutoff specifika för varje antigen.

    Figur 2.


    Figur 2. Representativa MFIA data för testserum med alla IgG kontroller passerar.

  1. 12,4 MFIA Tolkning
    1. Testplatta resultat bör endast tolkas om System-Lämplighet Control och Serum Control (IgG / anti-IgG pärlor) resultat uppfyller kriterier för godkännande som anges i tabell 2. Fel av dessa två IgG kontroll pärlor kan indikera flera processuella fel som felaktig utspädning eller otillräcklig volym konjugat eller SPE, felaktig testserum utspädning eller användning av serum från en immunocomprimised djur.

      Tabell 2

      Acceptanskriterier för analys Kontroller
      Kontroll Acceptabelt resultat
      Betyg Klassificering
      High Range immunserum ≥ 4,5 Positiv
      Lågväxel immunserum ≥ 1,5 ≥ Borderline
      Icke-immun serum <2,5 ≤ Borderline
      Spädmedel <2,5 ≤ Borderline
      Ig Bead Set * ≥ Cutoff/1000 Pass

      * Bead in belagd med artspecifik anti-testserum immunglobulin (Ig): sviktande poäng för detta prov lämplighet kontroll kan leda från tillsats av otillräckliga prov, för hög provspädning, felaktiga art eller testa serum från en immunbrist Host.

    1. Om någon av analysen testplatta Kontroller misslyckas utom för höga frekvenser immunserum, resultaten är inte acceptabla och måste upprepas. Passing lågväxel serumkontroll poäng är kritisk eftersom det visar nivån känslighet av testet plattan.
    2. Get-anti-species IgG pärla baseras på mängden primär testserum sattes till analysen. Om denna kontroll pärla misslyckas men arten IgG passerar (Well B1 Fig. 3) så indikerar det att tillräckligt tester reagens (BAG, SPE) sattes på prov bra och det är ett serum relaterad fråga. Om mängden testa reagenser är otillräcklig i en viss väl både IgG och anti-IgG pärlor kontroll kommer att misslyckas (Well E1, Fig. 3).

      Figur 3.
      Figur 3. Representativa MFIA testresultat med fel (som anges i orange). Wells A1, C1 och F1 indikerar en TC (vävnads reaktiv) feldär TC poäng är representerat i parentes. Wells B1 och E1 visar de två typerna av IgG intern kontroll misslyckanden, otillräcklig testantikropp (B1) eller testreagenser (E1) PÅSE / SPE respektive.

    1. Om Test plattanalys Kontroll resultat är tillfredsställande, individuella assay poäng klassificeras som visas i tabell 3. Det är viktigt att bekräfta varje gränsen eller positiva fynd av en alternativ testmetod.

      Tabell 3

      MFIA Score Klassificering
      Betyg Klassificering
      TC Net TC + Netto *
      ≥ 2 <0,5 <2,5 Negativ (-)
      ≥ 2,5 TC-Reaktion (T)
      <2 <1,5 -
      1,5 ≤ X <2,5 Borderline (B)
      ≥ 2,5 Positiva (+)

      * En klassificering av negativ kan fortfarande avgöras med en icke-noll som TC poäng TC + Net poäng (= Ag poäng) är negativ

Discussion

Den MFIA testprocessen är mycket effektiv, kräver mindre utrustning och mindre prov och volymer reagens än traditionella singleplex tester. Funktionaliteten hos multiplex systemet ger användaren möjlighet att sålla samtidigt för flera stammar eller serotyper av vanliga ämnen i smågnagare (dvs. coronavirus, parvovirus etc.). Det gör också att vi, för att utforma skräddarsydda pärla paneler baserade på området av intresse (dvs. specifika virus familj) och kan anpassas till screening andra typer av biomolekyler, inklusive cytokiner och andra biomarkörer. Dessutom tillåter det oss att införliva flera interna kontroll-analyser för att verifiera prov och system lämplighet och därmed säkerställa noggrannheten av resultaten. Dessa inkluderar vävnadskontroll och IgG-anti-testserum arter immunglobulin (αIg) belagda pärla uppsättningar för att utvärdera prov lämplighet. En vävnad kontroll pärla detekterar icke-specifik bindning av serum immunglobulin och αIg strängstyrning bekräftaratt serum har lagts till och innehåller en tillräcklig immunglobulinkoncentrationen. Annan kontroll pärla, överdragen med serum arter immunglobulin, visar att de märkta reagens och analys läsare fungerar korrekt. Andra kommersiellt tillgängliga multiplex format serologiska analyser (dvs. microarrays, Immunocomb) får inte erbjuda samma nivå av resultat bekräftelse.

Förmågan att begränsa den möjliga källan till analys inte före omprov kan hjälpa en utredare spara på tid och material. Kritiska aspekter MFIA måste bekräftas innan du upprepar en misslyckad prov. Eftersom analysen utförs vid omgivningens temperatur bör det verifieras att laboratoriet temperaturen är ca 27 ° C ± 2 ° C, kan högre temperaturer leder till lägre än förväntade poäng för kontroller och prover. Tvättning är kanske det mest kritiska steget i analysen. Säkerställande av att testplattan korrekt tvättas, blottades och återsuspenderades kan elimineraden stora majoriteten av urvalsfel på grund av låg vulst antal (på grund aggregerade pärlor) eller otillräcklig reagens tillsats (förlorade genom uppsugning ur testplatta filtrets botten). Vi räknar rutinmässigt 25 kulor per analys (medel) och har hittat ingen statistisk skillnad i resultaten genom att räkna högre antal kulor som också kommer att leda till en längre läsning tid för plattan.

Vi har utfört omfattande valideringsstudier av MFIA på flera arter av vanliga försöksdjur (mus, råtta, hamster, marsvin och kanin) för att visa diagnostisk noggrannhet, reproducerbarhet och robusthet genom att testa ett stort antal kända positiva och negativa serumprover, och jämföra deras ELISA, IFA och MFIA resultat. Detektionsgränserna (dvs standard immunserum titrering slutpunkter) i MFIA var jämförbara med, och i vissa fall överträffade de av motsvarande ELISA. Diagnostisk specificitet, mätt med SPF gnagare sera överskred 99%, den totala korrespondens mellan ELISA och MFIA utförs på kända positiva och kända negativa sera var större än 95%. Sammanfattningsvis visade dessa resultat att multiplex MFIA är ett bra alternativ till singleplex ELISA och är lämplig för det avsedda ändamålet, dvs rutinmässig seroövervakning av försöksdjur kolonier.

Disclosures

Alla författare arbetar för Charles River RADS, en stor leverantör av djur tjänster serologiska tester och reagens.

Acknowledgments

Den forskning som presenteras här stöddes av Charles River.

References

  1. MFIA Rodent Methods Manual [Internet]. Charles River. Available from: http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf (2011).
  2. Rodent MFIA Validation Summary Report [Internet]. Charles River. Available from: http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf (2007).
  3. Jacobson, R. H., et al. Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. Office International des Epizooties (OIE). France. 8-15 (1996).
  4. Wright, P. F. International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection. Rev. sci. tech. Off. int. Epiz. 17, (2), Office International des Epizooties (OIE). France. 527-533 (1998).
  5. Pepe, M. S. The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. Oxford University Press. Oxford, New York. (2003).
  6. Barr, M. C., et al. Comparison and interpretation of diagnostic tests for feline immunodeficiency virus infection. J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, 1377-1381 (1991).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics