Chromatin immunoprecipitation (चिप) का उपयोग ड्रोसोफिला ऊतक

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

हाल ही में उच्च throughput अनुक्रमण प्रौद्योगिकी बहुत Chromatin immunoprecipitation (चिप) के प्रयोग की संवेदनशीलता बढ़ गया है और शुद्ध कोशिकाओं या विच्छेदित ऊतक का उपयोग कर अपने आवेदन को प्रेरित किया. यहाँ हम एक विधि के साथ चिप तकनीक का उपयोग चित्रित करना

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Tran, V., Gan, Q., Chen, X. Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue. J. Vis. Exp. (61), e3745, doi:10.3791/3745 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Epigenetics एक तेजी से विकसित क्षेत्र बना हुआ है कि पढ़ाई कैसे chromatin राज्य अंतर विभिन्न विकास के चरणों पर विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के लिए योगदान देता है. Epigenetic विनियमन भ्रूण विकास और वयस्कता में homeostasis के दौरान सेलुलर भेदभाव सहित जैविक प्रक्रियाओं की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए योगदान देता है. Epigenetic अध्ययन में जांच करने के लिए कैसे विभिन्न histone संशोधनों और chromatin कारक जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए एक महत्वपूर्ण रणनीति है. इस पते, chromatin immunoprecipitation (चिप) व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है ब्याज की कोशिकाओं में डीएनए के साथ विशेष कारकों के सहयोग के एक स्नैपशॉट प्राप्त करने.

चिप तकनीक आमतौर पर सामग्री है, जो बहुतायत और एकरूपता में प्राप्त किया जा सकता है प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा उत्पन्न करने के लिए शुरू के रूप में संवर्धित कोशिकाओं का उपयोग करता है. हालांकि, वहाँ कई caveats हैं: पहला, पेट्री डिश में कोशिकाओं के विकास का वातावरण vivo में से अलग है, इस प्रकार हो सकता हैएक जीवित जीव में कोशिकाओं की अंतर्जात chromatin राज्य को प्रतिबिंबित नहीं. दूसरा, कोशिकाओं के सभी प्रकार सुसंस्कृत पूर्व vivo हो सकता है. सेल लाइनों का केवल एक सीमित संख्या है, जिसमें से लोगों के चिप परख लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त कर सकते हैं.

यहाँ हम एक चिप ड्रोसोफिला ऊतकों का उपयोग करके प्रयोग करने की विधि वर्णन. शुरू सामग्री एक जीवित पशु से ऊतक विच्छेदित है, इस प्रकार सही अंतर्जात chromatin से राज्य को प्रतिबिंबित कर सकते हैं. ऊतक के कई अलग अलग प्रकार के साथ इस पद्धति का अनुकूलन क्षमता के शोधकर्ताओं ने एक बहुत अधिक जैविक प्रासंगिक vivo में 1, 2 में epigenetic विनियमन के बारे में सवालों को संबोधित करने की अनुमति देगा. उच्च throughput अनुक्रमण (चिप seq) के साथ इस पद्धति संयोजन आगे शोधकर्ताओं ने एक epigenomic परिदृश्य को प्राप्त करने के लिए अनुमति देगा.

Protocol

(पूरी चिप प्रक्रिया लगभग दो दिन लगते हैं उच्च throughput अनुक्रमण के लिए चिप पुस्तकालयों की तैयारी एक और 2-3 दिन लगते हैं.)

1. काटना और चिप प्रयोग (~ 1 मिलियन कोशिकाओं) के लिए ऊतक तैयार

  1. ब्याज की ऊतक ठंड पीबीएस + 1x protease अवरोध करनेवाला (1 1.5 एमएल 1x पीबीएस में protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल की गोली भंग करने के लिए 7x स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए) में (ड्रोसोफिला testes के 200 जोड़े उदा) काटना + PMSF (अंतिम 100 / μg एमएल एकाग्रता). ऊतक दो बार कुल्ला और inhibitors के साथ एक ही पीबीएस समाधान की 200 μL में ऊतक resuspend के.
  2. नमूना को ठीक करने के लिए, 5.5 μL 37% formaldehyde (का उपयोग करने से पहले 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गर्म formaldehyde) जोड़ें. 37 ° सेल्सियस पर 15 मिनट, भंवर के बीच में हर 5 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. बर्फ पर 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए ऊतक के लिए नमूना रखें. 450 μL पीबीएस (protease inhibitors और PMSF के साथ) के साथ 2x कुल्ला. नमूना अब दुकान हो सकता है-20 डिग्री सेल्सियस पर घ. चिप के लिए पर्याप्त सामग्री प्राप्त करने के विच्छेदन कई बार दोहराएँ.

2. प्रोटीन डीएनए संयुग्मन के साथ चिप परख के लिए सतह पर तैरनेवाला तैयार

  1. 1.75 एमएल Eppendorf ट्यूब में 1.3 कदम से काफी नमूना मिश्रण.
  2. ऊतक के नमूने से पीबीएस निकालें. Lysis बफर के 200 μL (50 मिमी Tris - एचसीएल, 7.6 पीएच, 1 CaCl2 मिमी, 0.2% ट्राइटन X-100 या एनपी-40, 5 मिमी butyrate, और 1x proteinase अवरोध करनेवाला कॉकटेल). ताजा PMSF शेयर lysis बफर (0.5 मिमी PMSF अंतिम एकाग्रता) समाधान जोड़ें. नीले homogenizer (फिशर कैट 749,521-1590) के साथ Homogenize तक ऊतकों कोई एकत्रीकरण, 10 मिनट के लिए आर टी (कमरे के तापमान) में सेते हैं बिना पूरी तरह से अलग कर देना.
  3. Sonication: उपयोग 20 शक्ति में microtip sonicator (Misonix एच एस-XL200). बर्फ पर 10 सेकंड और बाकी के लिए 50 सेकंड के लिए Sonicate. दोहराएँ 4-5 बार (इष्टतम sonication empirically का समय निर्धारित किया जाना चाहिए, के रूप में लंबे समय तक sonication छोटे टुकड़ों निकलेगा Histon के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग चिप के लिए है.ई संशोधन, हम आम तौर पर 200-300 लगभग बीपी के लिए chromatin sonicate, प्रतिलेखन कारक या है chromatin नियामक (जैसे Polycomb प्रोटीन) के लिए, हम आम तौर पर 200-1000 बीपी chromatin sonicate. हालांकि, इष्टतम टुकड़ा आकार empirically का परीक्षण किया जाना चाहिए. नोट: हमेशा बर्फ पर SONICATING को हीटिंग से नमूना को रोकने के दौरान भी ट्यूब रखने!
  4. 1.8 एमएल RIPA (बफर जोड़कर नमूना पतला 10 Tris - एचसीएल, पीएच 7.6, 1 मिमी EDTA, 0.1% एसडीएस, 0.1% ना के Deoxycholate, 1% ट्राइटन X-100, protease inhibitors और PMSF साथ ही एकाग्रता में मिमी के रूप में वर्णित पहले से). 65 में 2 μL 5M NaCl सेते हैं और जोड़कर इनपुट नियंत्रण के रूप में 40 μL डिग्री सेल्सियस (ओ / एन) रातोंरात crosslink रिवर्स.
  5. मोती प्रतिरक्षी संयुग्म, 40 μL प्रोटीन 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब एक मोती को जोड़ने के लिए, फिर 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 600 μL पीबीएस और रॉक, जोड़ने चुंबक को मोती लागू है और सतह पर तैरनेवाला हटाने के. पीबीएस की 100 μL और ब्याज की प्रतिरक्षी जोड़ें (एंटीबॉडी की राशि निर्धारित की जा empir चाहिएically). 1 घंटे या 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस के लिए आर टी में सेते हैं.
  6. चुंबक से मोतियों से सतह पर तैरनेवाला निकालें और 2.4 कदम से मोती 1mL chromatin से निकालने में जोड़ें. 4 में घुमाएँ ° / सीओ एन.
  7. चुंबक चिप नमूना लागू करने के लिए और सतह पर तैरनेवाला हटाने के. 4 में निम्नलिखित बफर डिग्री सेल्सियस के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए मोती धो:
    RIPA बफर के 1 एमएल के साथ 2x [1.89 एमएल RIPA 'बफर' + 315 μL 7x protease inhibitors के + 20 μL PMSF];
    RIPA बफर के 1 एमएल के साथ 2x 0.3 + एम NaCl [1.89 एमएल RIPA बफर + 220 μL 3 एम NaCl];
    2x LiCl बफर के 1 एमएल (0.25 एम LiCl, NP40 0.5%, 0.5% NaDOC के) के साथ;
    1x 1 1x ते का एमएल के साथ 0.2% ट्राइटन एक्स-100;
    1x ते के 1 एमएल के साथ 1x.
  8. Crosslink रिवर्स, 100 μL ते बफर में मोती resuspend + 3 μL 10% एसडीएस + में proteinase कश्मीर (20 मिलीग्राम / एमएल) की 5 μL. 65 में सेते हैं ° / सीओ एन.
  9. चुंबक को मोती लागू करें और एक नया ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण. सतह पर तैरनेवाला आपका डीएनए नमूना शामिल हैं. 100 μL ते + 0.5 मीटर के साथ मोती धोNaCl और दो सतह पर तैरनेवाला गठबंधन.
  10. Phenol के क्लोरोफॉर्म डीएनए नमूने निकाल सकते हैं. Chlorofrom: 200 μL Phenol आई ए ए (25:24:1) के मिश्रण और भंवर. आर टी पर 5 मिनट के लिए 14k पर स्पिन. वैकल्पिक रूप से, डीएनए क्विएज़न पीसीआर शुद्धि किट का उपयोग करके निकाला जा सकता है.
  11. एक नया ट्यूब में स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला / जलीय परत, और 20 μg / एमएल (वैकल्पिक रूप से सतह पर तैरनेवाला के हर 1 एमएल के लिए 20 मिलीग्राम / एमएल में 1 ग्लाइकोजन की μL के अंतिम एकाग्रता रैखिक acrylamide जोड़ने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है ग्लाइकोजन के लिए प्रयोग किया जाता है बाद qPCR या पीसीआर विश्लेषण है जबकि रैखिक acrylamide assays के अनुक्रमण के लिए प्रयोग किया जाता है). 3M NaOAc की 20 μL और 500 μL 100% EtOH के जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और 80 पर सेते हैं ° C 10 मिनट के लिए. 4 में 20 मिनट के लिए अधिकतम गति पर स्पिन ° सी.
  12. सतह पर तैरनेवाला निकालें और 300 μL 70% EtOH से धो. एयर 50 μL ते बफर में सूखे और resuspend नमूना. नमूना अब -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है नमूना मात्रात्मक पीसीआर परख (qPCR) (चित्रा 1) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

3a. चिप एड qPCR का उपयोग डीएनए का विश्लेषण

  1. निम्नलिखित एकाग्रता में जीनोमिक डीएनए पतला बनाने के लिए एक मानक वक्र: undiluted, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000.
  2. प्रत्येक प्राइमर जोड़ी के लिए, कदम 3a.1, इनपुट नियंत्रण और चिप - एड डीएनए से जीनोमिक डीएनए के साथ एक 96 अच्छी तरह से थाली में qPCR सेट नकल में:
    10 μL 2x SYBR पीसीआर मिश्रण (Fermentas, K0222);
    1 μL 10 माइक्रोन आगे प्राइमर;
    1 μL 10 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर;
    x μL डीएनए चिप एड (इनपुट नियंत्रण, या जीनोमिक डीएनए);
    वाई nuclease मुक्त μL एच 2 हे 20 μL करने के लिए प्रतिक्रिया की मात्रा को समायोजित करने के लिए.
  3. नीचे मिनी प्लेट स्पिनर (Labnet) के साथ 96 अच्छी तरह से थाली स्पिन.
  4. अबी 7300 वास्तविक समय पीसीआर (या अन्य वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली) प्रणाली निम्नलिखित शर्त का उपयोग के साथ qPCR प्रदर्शन करना:
    चरण 1: 50 ° सी, 2 मिनट, 1 चक्र के लिए
    चरण 2: 95 ° सी, 10 मिनट, 1 चक्र के लिए
    स्टेज 3: 15, 60 के लिए 95 ° C ° सी 1 मिनट के लिए, 40 गycles;
    स्टेज 4 (हदबंदी चरण): 95 ° 15 है, 60 डिग्री सेल्सियस के लिए सी 1 मिनट, 95 ° 15 सी.
  5. हदबंदी वक्र की जाँच करें: थर्मल हदबंदी भूखंड पर एक शिखर पीसीआर प्रतिक्रिया से एक amplicon पता चलता है. एक से अधिक शिखर प्राइमर जोड़ी के साथ गैर विशिष्ट उत्पाद को इंगित करता है, तो qPCR डेटा का प्रयोग नहीं किया जाना चाहिए.
  6. सूत्र है कि सीटी (चक्र दहलीज) मूल्य है, जो मानक वक्र का उपयोग 3a में पतला जीनोमिक डीएनए की श्रृंखला पर आधारित है के अनुसार डीएनए राशि को हल करने की गणना के द्वारा, प्रत्येक प्राइमर सेट के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया के घातीय प्रवर्धन के रैखिक चरण का निर्धारण करते हैं. 1.
  7. यदि चिप एड डीएनए और इनपुट नियंत्रण के मूल्य सीटी सीटी मूल्य के रैखिक सीमा के भीतर हैं, चिप एड डीएनए और 2.4 में इनपुट नियंत्रण के कमजोर कारक के अनुसार चिप एड डीएनए बनाम इनपुट के संवर्धन, गणना.

3b. उच्च throughput अनुक्रमण के लिए चिप एड डीएनए बढ़ाना.

  1. चिप एड डीएनए मिश्रण के अंत मरम्मत (का प्रयोग करेंEpicentre अंत मरम्मत किट डीएनए), बर्फ पर स्थापित:
    1-34 2.12 कदम (0.1 से 5 μg) से μl जीनोमिक डीएनए
    5 μl 10x एंड मरम्मत बफर
    5 μl 2.5 मिमी dNTP मिश्रण
    5 μl 10 मिमी एटीपी
    एक्स μl एच 2 हे 49 μl प्रतिक्रिया मात्रा समायोजित करने के लिए
    1 μl एनजाइम एंड मरम्मत मिश्रण (+ टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ टी -4 polynucleotide kinase)
    आर टी पर 45 मिनट के लिए सेते हैं. प्रतिक्रिया शुद्ध क्विएज़न MinElute रिएक्शन का उपयोग
    सफाई किट. 30 μl क्षालन बफर (EB) में Elute.
  2. 3 'के अंत तक एक - overhangs जोड़ें:
    कदम 3b.1 से 30 eluted डीएनए उत्पाद के μl
    5 μl 10x चोंच बफर # 2
    10 μl 1 मिमी dATP है
    2 μl DH 2 हे
    3 μl 5 यू / μl Klenow टुकड़ा (3 '5 →' exo-)
    37 पर 30 मिनट के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस प्रतिक्रिया शुद्ध MinElute ReactionCleanup किट का उपयोग. 10 μl EB में Elute.
  3. Solexa linker बंधाव:
    10 कदम 3b.2 से eluted डीएनए की μl
    10 μl DDH 2 हे
    2.5 औरम्यू, मैं 10x टी -4 डीएनए ligase बफर
    1 Illumina से μl अनुकूलक oligo मिश्रण (शेयर से 1/10-diluted)
    2.5 μl टी -4 डीएनए ligase (400 इकाइयों / μl)
    आर टी में 1 घंटे के लिए सेते हैं. प्रतिक्रिया शुद्ध MinElute ReactionCleanup किट का उपयोग. 20 μl EB में Elute. नमूना अब -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है
  4. कदम ई - जेल उपकरण का उपयोग कर 3b.3 से eluted डीएनए नमूना चलाएँ. जेल में 300-500 बीपी बैंड अलग करने और क्विएज़न जेल निकालना किट (इस कदम अनुकूलक oligo बंधाव से ~ 125 बीपी आत्म - ligated linkers समाप्त) का उपयोग कर शुद्ध. 12 μl EB में Elute.
  5. पुस्तकालय बनती अंत का उपयोग (पीई) Illumina से प्राइमरों बढ़ाना:
    कदम 3b.4 से 10.5 eluted डीएनए की μl
    मास्टर मिश्रण का 12.5 μl (2x Phusion HF, Finnzymes)
    PE1 पीसीआर 1 प्राइमर की एक μl
    PE2 पीसीआर 2 प्राइमर की एक μl
    पीसीआर हालत:
    98 ° सी 30 के लिए सेकंड
    (98 ° 10 सी सेकंड, 65 ° सी 30 सेकंड, 72 ° सी सेकंड 30) दोहराना, 20 चक्र
    72 ° C 5 मिनट के लिए.
  6. कदम 3b.5 से नमूने उचित आकार (300-500 बीपी) डीएनए मानक 2% agarose जेल का उपयोग कर का चयन करने के बाद चिप seq के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. नमूना अब -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है यह सबसे अच्छा है प्रदूषण को रोकने के लिए एक एकल जेल पर प्रत्येक चिप नमूना अलग. नमूने उच्च throughput अनुक्रमण के लिए प्रस्तुत किया जा सकता है.

3c. Solexa पाइपलाइन विश्लेषण

  1. 25 बीपी पढ़ता अनुक्रमण Illumina जीनोम (GA) विश्लेषक पाइपलाइन से प्राप्त किया गया.
  2. सभी पढ़ता ड्रोसोफिला (dm3) जीनोम अलंड (, nucleotide डेटा के कुशल स्थानीय संरेखण) सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए गठबंधन किया गया, संदर्भ अनुक्रम के साथ दो बेमेल अनुमति.
  3. विशिष्ट मैप पढ़ता बहाव के विश्लेषण के लिए बनाए रखा गया. कई समान पढ़ता के लिए, तीन प्रतियां पीसीआर प्रवर्धन से biases की संभावना को कम करने के लिए बनाए रखा गया.
  4. GA पाइपलाइन का उत्पादन ब्राउज़र एक्स्टेंसिबल (बीएड) डेटा फ़ाइलों को परिवर्तित कर दिया गया.
  5. उत्पन्न करने के लिएUCSC ब्राउज़र के दृश्य के लिए अपलोड करने के लिए विग फाइलें, हम एक अजगर स्क्रिप है जो विंडो का आकार के रूप में 4 बीपी और डीएनए टुकड़ा आकार के रूप में 160 बीपी के साथ पिछले 3 प्रकाशन में वर्णित किया गया है.
  6. मौन और व्यक्त जीन में ड्रोसोफिला जीन को वर्गीकृत करने के लिए, हम एक डिजिटल RPKM बुलाया संख्या (पढ़ता kilobase प्रति / exonic क्षेत्र विलय कर दिया / मिलियन प्रति मैप किए गए पढ़ता है) का इस्तेमाल किया. RPKM = 0 के साथ जीन मूक और साथ समूह जीन RPKM ≥ 1 व्यक्त समूहों, जो कम, मध्यम और उच्च अभिव्यक्ति के स्तर के साथ जीन के रूप में तीन subgroups में वर्गीकृत किया जा सकता है में वर्गीकृत किया गया है के रूप में वर्गीकृत किया गया है, और प्रत्येक समूह के बारे में एक ही नंबर है जीन.
  7. Histone संशोधन स्तर और जीन अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए, हम एक अजगर स्क्रिप्ट है जो पिछले एक प्रकाशन 3 में वर्णित किया गया है.

4. प्रतिनिधि परिणाम

चिप qPCR बेम का उपयोग कर परिणाम के उदाहरण (पत्थर के बैग) उत्परिवर्ती वृषण 1 चित्रा 4 में दिखाया जाता है. बेम वृषण में, वहाँ proliferative spermatogonia से 5 spermatocytes, 6 फर्क करने के लिए संक्रमण में एक विफलता है. हम बेम undifferentiated जर्म कोशिकाओं, जो इस ऊतक प्रकार में समृद्ध कर रहे हैं के लिए एक स्रोत के रूप में testes का उपयोग करें. भेदभाव शुक्राणु भेदभाव के लिए आवश्यक जैसे पुरुष विशिष्ट प्रतिलेखन कारक 87 (mst87F), डॉन जुआन (डीजे), और फजी प्याज (fzo) के जीन, बेम वृषण में नहीं व्यक्त कर रहे हैं. इन जीनों अत्यधिक दमनकारी H3K27me3 histone 7 संशोधन (चित्रा 1 ए) के साथ समृद्ध है, लेकिन सक्रिय H3K4me3 histone 8 संशोधन (चित्रा 1 बी), एक chromatin हस्ताक्षर के हम 'monovalent 7' कहा जाता है से रहित हैं. या तो H3K27me3 या H3K4me3 के संवर्धन एक रचनात्मक रूप में व्यक्त Cyclin (CycA) 4 जीन को सामान्य बनाने के द्वारा निर्धारित किया जाता है.

> चिप seq सामग्री बेम उत्परिवर्ती वृषण (चित्रा 2) qPCR परिणाम चित्र 1 में दिखाया तीन परीक्षण टर्मिनल भेदभाव जीनों के लिए मान्य mst87F डीजे, और fzo. के साथ एंटीबॉडी के एक ही सेट (यानी दमनकारी H3K27me3 और H3K4me3 सक्रिय) विश्लेषण का उपयोग , उनके जीनोमिक क्षेत्रों अत्यधिक H3K27me3 लेकिन नहीं H3K4me3 (चित्रा 2A -2 सी) के साथ समृद्ध कर रहे हैं इसके विपरीत, अनिवार्यता से में व्यक्त CycA जीन महत्वपूर्ण H3K4me3 लेकिन थोड़ा H3K27me3 अपने प्रतिलेखन शुरू (TSS) साइट (चित्र 2 डी) के पास बंधन है.

इसके अलावा, विभिन्न व्यक्त जीनों के चार वर्गों का TSSs पास H3K27me3 और H3K4me3 के चिप प्रोफाइल प्रत्येक histone संशोधन के समारोह के साथ संगत कर रहे हैं. चित्रा 3A में दिखाया गया है, की TSSs H3K27me3 बहाव के संवर्धन को inversely जीन की अभिव्यक्ति के स्तर के साथ सहसंबद्ध है. चुप जीन जबकि उच्चतम H3K27me3अत्यधिक व्यक्त जीनों कोई H3K27me3 बाध्यकारी है. ये डेटा जीन अभिव्यक्ति पर H3K27me3 की दमनकारी भूमिका के साथ संगत है. इसके विपरीत में, H3K4me3 TSSs के आसपास के संवर्धन के जीन की अभिव्यक्ति के स्तर (3B चित्रा), जीन अभिव्यक्ति पर H3K4me3 की सक्रिय भूमिका के साथ संगत के साथ विपरीत संबंध दिखाया.

चित्रा 1
चित्रा 1 चिप एड या तो दमनकारी H3K27me3 histone (ए) संशोधन या सक्रिय H3K4me3 (बी) सेल समृद्ध undifferentiated बेम उत्परिवर्ती testes में histone संशोधन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए डीएनए की qPCR विश्लेषण. (ए) बेम में testes, भेदभाव जीन (Mst87F, डीजे, fzo) H3K27me3 दमनकारी histone संशोधन के साथ समृद्ध कर रहे हैं. (बी) के भेदभाव जीन H3K4me3 सक्रिय निशान के साथ समाप्त किया जाता है. चिप डीएनए के लक्ष्य जीन (Mst87F, डीजे या fzo के) (चिप डीएनए / इनपुट) स्तर पहले लेव करने के लिए normalized था में नियंत्रण CycA जीन चिप डीएनए के एल. त्रुटि पट्टियाँ संकेत मिलता है तीन स्वतंत्र जैविक से मानक विचलन प्रतिकृति.

चित्रा 2
चित्रा 2. UCSC जीनोम ब्राउज़र H3K27me3 की फोटो और (ए) (बी) Mst87F डीजे और (सी), fzo, (डी) CycA जीन (डी) में H3K27me3 समृद्ध क्षेत्र की परिक्रमा पूरी जीनोमिक क्षेत्रों में H3K4me3 संवर्धन के chromatin स्थिति को दर्शाता है एक अतिव्यापी CG7264 जीन, जो बेम में नीच व्यक्त की है (= RPKM 1) वृषण लेकिन अत्यधिक जंगली प्रकार testes में व्यक्त (RPKM = 130) 8 (चिप seq से 7 डेटा). चित्रा 1 में चिप परिणाम की मात्रात्मक पीसीआर विश्लेषण में प्रयुक्त जांच प्रत्येक भूखंड के नीचे लेबल रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

/ tp_upload/3745/3745fig3.jpg ">
चित्रा 3. चिप seq प्रोफाइल को बेम में 7 वृषण H3K27me3 और H3K4me3 का उपयोग. चार जीन समूहों (७५०९ जीन) उनके जीन अभिव्यक्ति आरएनए seq 8 परिणामों पर आधारित स्तर के अनुसार वर्गीकृत किया गया है. जीनों के प्रतिनिधि वर्गों एक विशेष histone संशोधन के संवर्धन के लिए प्लॉट किए जाते हैं, उनके प्रतिलेखन शुरू साइटों (TSSs) के 3KB 3KB बहाव के लिए नदी के ऊपर से दृश्यों का उपयोग. (ए) (K27) H3K27me3 और (ख) H3K4me3 (K4) प्रत्येक समूह में चिप seq विश्लेषण के संवर्धन के एक प्रोफ़ाइल उत्पन्न बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल में चर्चा चिप विश्लेषण की बहुमुखी प्रतिभा के विभिन्न ऊतकों, जो एक biologically प्रासंगिक प्रणाली में chromatin राज्य अध्ययन का अवसर प्रदान करता है पर इस्तेमाल किया जा सकता है. चिप सुसंस्कृत सिस्टम से कोशिकाओं का उपयोग प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए है क्योंकि कोशिकाओं की बड़ी मात्रा में आसानी से प्राप्त किया जा सकता है सुविधाजनक हैं. हालांकि, संवर्धित कोशिकाओं जरूरी एक बहु सेलुलर वातावरण में कोशिकाओं को प्रतिबिंबित नहीं करते. यह जीवित पशुओं से विच्छेदित ऊतक का उपयोग तकनीक विकसित करके, हम पता कर सकते हैं कई सवाल है कि संवर्धित कोशिकाओं नहीं कर सकते हैं.

इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता के बावजूद, वहाँ कई निरंतर कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, ऊतक विच्छेदित अभी भी कई अलग अलग प्रकार के सेल के साथ विषम है. जबकि अपेक्षाकृत सजातीय कोशिकाओं के कीड़े की तुरीयावस्था (पूरे बन जाने की स्थिति) से संबंधित डिस्क, हिम्मत जैसे अन्य ऊतकों, वृषण, और अंडाशय जो सभी शामिल सीमित वयस्क स्टेम सेल विषम के रूप में ड्रोसोफिला ऊतकों में प्राप्त किया जा सकता है. इस जटिलता को आंशिक रूप से हो सकता हैशक्तिशाली ड्रोसोफिला आनुवंशिकी का उपयोग कर संबोधित किया. उदाहरण के लिए, हालांकि ऊपर चर्चा के ऊतकों में एक छोटी सी आबादी में वयस्क स्टेम सेल मौजूद हैं और चिप विश्लेषण के लिए पर्याप्त संख्या में पृथक होना अत्यंत कठिन हैं, स्टेम सेल जनसंख्या आनुवंशिक रूप से उत्परिवर्तित पृष्ठभूमि का उपयोग समृद्ध किया जा सकता है. बेम जीन ड्रोसोफिला germline वंश 5,6 में स्टेम सेल भेदभाव के लिए आवश्यक है. इसलिए बेम उत्परिवर्ती gonads समृद्ध undifferentiated जर्म कोशिकाओं के लिए एक अच्छा स्रोत हैं. चिप प्रदर्शन बेम उत्परिवर्ती का उपयोग करके, हम undifferentiated जर्म कोशिकाओं में एक epigenomic परिदृश्य प्राप्त कर सकते हैं.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

लेखकों के डा. Keji झाओ प्रयोगशाला (NIH / NHLBI) अनुक्रमण परिणाम प्रदान करने में उनकी मदद के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी के UCSC जीनोम परियोजना जीनोम ब्राउज़र का उपयोग करने के लिए मैप अनुक्रमण पढ़ता कल्पना के लिए शुक्रिया अदा करना होगा.

यह काम स्वतंत्रता पुरस्कार और NICHD, Lucile Parkard फाउंडेशन, और जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय से R01HD065816 शुरू XC के लिए धन R00HD055052 एनआईएच मार्ग द्वारा समर्थित किया गया है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Complete Mini protease inhibitor cocktail Roche Group 11836153001
Formaldehyde (37%) Supelco, Sigma-Aldrich 47083-U
PMSF Sigma-Aldrich 78830
Kontes pellet pestle Fisher Scientific K749521-1590
PCR Purification Kit Qiagen 28104
Linear polyacrylamide Sigma-Aldrich 56575-1ML
Glycogen Qiagen 158930
SYBR green/ROX qPCR Master Mix Fermentas K0223
Mini plate spinner Labnet International Z723533
Real time PCR system Applied Biosystems 4351101
Small Volume Ultrasonic Processor Misonix HS-XL2000 Model discontinued
Dynabeads, Protein A Invitrogen 100-01D
Dynamag magnet Invitrogen 123-21D
Phenol:Chlorofrom:IAA Invitrogen 15593-049
Epicentre DNA END-Repair Kit Epicentre Biotechnologies ER0720
MinElute Reaction Cleanup Kit Qiagen 28204
Klenow Fragment (3’→5’ exo-) New England Biolabs M0212S
T4 DNA ligase Promega Corp. M1794
Adaptor oligonucleotides Illumina PE-400-1001
Paired-End Primer 1.0 and 2.0 Illumina 1001783 1001 784
E-Gel Electorphoresis system Invitrogen G6512ST
2X Phusion HF Mastermix Finnzymes F-531

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kharchenko, P. V., Alekseyenko, A. A., Schwartz, Y. B., Minoda, A., Riddle, N. C., Ernst, J., Sabo, P. J., Larschan, E., Gorchakov, A. A., Gu, T. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster. Nature. 471, 480-485 (2011).
  2. Filion, G. J., van Bemmel, J. G., Braunschweig, U., Talhout, W., Kind, J., Ward, L. D., Brugman, W., de Castro, I. J., Kerkhoven, R. M., Bussemaker, H. J., van Steensel, B. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells. Cell. 143, 212-224 (2010).
  3. Barski, A., Cuddapah, S., Cui, K., Roh, T. Y., Schones, D. E., Wang, Z., Wei, G., Chepelev, I., Zhao, K. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129, 823-837 (2007).
  4. Chen, X., Lu, C., Prado, J. R., Eun, S. H., Fuller, M. T. Sequential changes at differentiation gene promoters as they become active in a stem cell lineage. Development. 138, 2441-2450 (2011).
  5. Gonczy, P., Matunis, E., DiNardo, S. bag-of-marbles and benign gonial cell neoplasm act in the germline to restrict proliferation during Drosophila spermatogenesis. Development. 124, 4361-4371 (1997).
  6. McKearin, D. M., Spradling, A. C. bag-of-marbles: a Drosophila gene required to initiate both male and female gametogenesis. Genes Dev. 4, 2242-2251 (1990).
  7. Gan, Q., Schones, D. E., Eun, S. H., Wei, G., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Monovalent and unpoised status of most genes in undifferentiated cell-enriched Drosophila testis. Genome Biol. 11, 42-42 (2010).
  8. Gan, Q., Chepelev, I., Wei, G., Tarayrah, L., Cui, K., Zhao, K., Chen, X. Dynamic regulation of alternative splicing and chromatin structure in Drosophila gonads revealed by RNA-seq. Cell Res. 7, 763-783 (2010).

Comments

1 Comment

  1. Hi Dr. Chen,
    I 'm trying to minimize ChIP with sepharose beads but I would like to try minimized conditions with dynabeads. Could you send me the part of the protocol where you are using it?
    Best regards

    Denis

    Reply
    Posted by: Denis S.
    January 28, 2013 - 4:32 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics