Préparation d'une souris Awake pour l'enregistrement des réponses de neurones et l'injection de traceurs

Neuroscience

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Summary

La caractérisation électrophysiologique des réponses neuronales est important pour comprendre le fonctionnement du cerveau et pour guider la mise en place de colorants pour voie de traçage. Cependant, de nombreuses études sont réalisées chez des animaux anesthésiés. Pour comprendre le fonctionnement du cerveau sans anesthésie, nous avons développé une méthode pour enregistrer les propriétés de réponse de neurones et d'injecter des colorants chez la souris éveillée.

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Muniak, M. A., Mayko, Z. M., Ryugo, D. K., Portfors, C. V. Preparation of an Awake Mouse for Recording Neural Responses and Injecting Tracers. J. Vis. Exp. (64), e3755, doi:10.3791/3755 (2012).

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Abstract

Il est bien connu que l'anesthésie modifie les propriétés de réponse de neurones dans différentes régions du cerveau. 13. Dans le système auditif, les propriétés fondamentales de la réponse neurones du tronc cérébral, y compris seuil, la spécificité de fréquence, et des bandes latérales inhibitrices sont modifiées de façon significative sous anesthésie 1-2. Ces observations invité physiologistes à chercher des moyens d'enregistrer à partir de neurones isolés, sans les effets contaminants de l'anesthésie. Un résultat a été une préparation décérébrée, où le tronc cérébral a été complètement sectionné au niveau du mésencéphale 4. Les inconvénients de cette préparation sont une chirurgie redoutable, l'élimination de descendre les projections de l'prosencéphale, et une incapacité à utiliser la stimulation sensorielle d'examiner les structures au-dessus du mésencéphale. Une stratégie différente a été d'implanter des réseaux d'électrodes de façon chronique à enregistrer à partir de neurones isolés et des grappes plusieurs unités alors que l'animal est éveillé et / ou de se comporter 5,6 7-9 10-12. En utilisant cette méthode, nous sommes en mesure de procéder à des enregistrements électrophysiologiques sur plusieurs jours chez la souris non anesthésié. A la fin des sessions d'enregistrement, on peut alors injecter un colorant à reconstruire les positions d'électrodes et des sites d'enregistrement ou d'injecter un traceur afin que les voies vers et à partir des loci d'enregistrement peut être déterminée. Cette méthode permet de bien isolées enregistrements d'un seul neurone sur plusieurs jours sans que les anesthésiques utilisation.

Protocol

1. Vue d'ensemble d'appui-tête

  1. Pour assembler un custom-built tête-post, insérer un 1/16 "en acier inoxydable rouleau broches perpendiculairement dans un trou percé dans un 3/32" tige en acier inoxydable pour former une croix. La pièce verticale de la tête-poste doit être d'environ 20 mm et la pièce transversale horizontale d'environ 15 mm. Appuyez sur une extrémité de la tige verticale à accepter une vis n ° 1-72. (Fig. 1).
  2. Au cours de la chirurgie et l'enregistrement, la tête-poste est fixée dans un laiton sur-mesure ou la barre de montage en aluminium avec un 1-72 # vis (Fig. 2). Le long morceau de la barre de montage devrait être d'environ 90 mm de long et 5-10 mm de large. Le chef-poste s'inscrit dans une rainure dans une extension de 15 mm au large de la longue barre qui est incliné à 45 degrés. Pour empêcher la rotation de tête, la traverse des niché tête de la poste dans une petite rainure sur le bas de la barre de montage.
  3. La barre de montage en ensuite attaché à un bloc en aluminium sur mesure de montagek (fig. 3). Le bloc de montage est d'environ 30 mm x 30 mm x 25 mm. Ce bloc de montage est fixé à un micromanipulateur afin que la position de la tête-poste ne peut être correctement placé le long de la ligne médiane et à Bregma. Le bloc de montage est fait de deux pièces emboîtées avec des vis. Un coupe-circuit dans le bloc permet à la barre de montage de glisser à l'intérieur et être fixé avec les vis. La barre de montage est parallèle à la surface de la table. Pendant l'enregistrement, fixer la barre dans un cadre personnalisé stéréotaxique (fig. 4). Le stereotax est conçu pour monter la barre dans la même position que dans le bloc de montage pendant la chirurgie. Cette disposition assure que la souris sera toujours aligné sur le cadre stéréotaxique à travers des sessions expérimentales.
  4. Couper une tige de tungstène (diamètre 0,010 ") à environ 5 mm de longueur, avec environ 1 mm coudé à 45 °. Ce tige sert de broche de terre (fig. 1).

2. Stéréotaxique Alignment pour craniotomie

Remarque: Toutes les procédures décrites ci-dessous suivent standards techniques chirurgicales aseptiques et ont été approuvés par le soin des animaux l'État de Washington University et le Comité d'utilisation et l'animal Comité d'éthique de l'Institut Garvan.

  1. Anesthésier la souris en plaçant dans une chambre d'induction avec 5% d'isoflurane. L'absence d'une réaction à la queue et / ou pincement de l'orteil en sorte que l'animal est entièrement anesthésié.
  2. Placez la souris dans un cadre stéréotaxique rongeurs équipé d'un adaptateur pour souris (Stoelting). Pour orienter la souris correctement, placer les dents à l'intérieur du trou de la barre de morsure et serrer la pince le nez de sorte qu'il soit bien ajusté. Placez la souris aussi droite que possible dans la barre de morsure et pince nez. Placez un masque fait à partir d'un morceau de gants en latex sur le nez de la souris, et de garder l'isoflurane à 5% jusqu'à ce que le taux de respiration de la souris est d'environ 1 respiration / sec. Tourner l'isoflurane à 1,5 - 2,0%. Fixer la tête en utilisant til l'oreille-bars en faisant attention à ne pas percer le tympan. Bars devrait être tendu mais pas pénétrer trop profondément dans les conduits auditifs.
  3. Placez un coussin chauffant sous la souris.
  4. Appliquer une pommade ophtalmique pour éviter que les yeux de se dessécher.
  5. Rasage du cuir chevelu d'entre les oreilles jusqu'à les yeux avec un rasoir petite ou d'une amende de point ciseaux.
  6. Nettoyer et stériliser le cuir chevelu en les essuyant avec du chlore et de hexidine (ou bétadine) gommage suivi par l'alcool rinçage répété 3 fois.
  7. Pour enlever la peau sur le dessus du crâne faire une incision le long de la ligne médiane de l'arrière de la tête aux yeux.
  8. Grattez le périoste sur les bords de l'incision avec un scalpel. Si nécessaire (en fonction de la cible expérimentale), soigneusement retirer la musculature à l'arrière du cou avec une pince, permettant au muscle de se déchirer le long de fascicules à minimiser les saignements. Appliquer gelfoam dessous du tissu pour réduire au minimum le cuir chevelu d'humidité et d'empêcher la peau de se déplacer sur le crâne.
  9. Sécher la surface du crâne avec un coton-tige imbibé d'alcool isopropylique pour améliorer la visualisation des points de repère du crâne.
  10. Aligner le crâne à la norme stéréotaxique coordonnées 13. Insérez une sonde à pointe fine dans le porte-électrode et l'attacher à la micromanipulateur stéréotaxique. Une tige de métal aiguisé fonctionne bien à cet effet (Fig. 5).
  11. Utilisez le point d'identifier Bregma (Fig. 5A) et Lambda (Fig. 5B) sur le crâne. Déplacez la sonde va-et-vient entre ces deux points, en vérifiant que la coordonnée latérale-médiale pour chaque emplacement ne diffère pas de plus de 50 um. Repositionner la tête, au besoin en prenant soin de desserrer les boucles d'oreilles bars, déplacement de la tête et des oreilles-bars latéralement, et en resserrant les oreilles-bars.
  12. Vérifiez que la hauteur dorso-ventral à chaque emplacement ne diffère pas de plus de 50 um. Réglez la hauteur du nez-clamp, qui fera tourner le crâne autour de l'axe des oreilles-bars,pour niveler la hauteur du crâne, si nécessaire. La hauteur de l'oreille-bar peut aussi être nécessaire d'ajuster.
  13. Utilisez un atlas de 13 à identifier les coordonnées de la cible d'intérêt (Fig. 5C) par rapport à Bregma. Marquez le crâne au-dessus de la cible (par exemple, un «X» ou d'utiliser l'encre de Chine pour dot quatre coins d'un carré), où une craniotomie sera faite (Fig. 5D).

3. Chef-poste et d'installation Broche de terre

  1. Utilisez gel de mordançage pour nettoyer le crâne. Utilisez l'applicateur de frotter et de diffuser gel de mordançage sur la surface (10 sec). Laver à l'eau et sécher complètement. Appliquer l'apprêt de ciment dentaire à la surface du crâne à l'aide de l'applicateur. Fais adhésif avec nouvel applicateur. Cure de l'adhésif avec une lumière UV-gun (1 cycle).
  2. Choisir un emplacement pour la broche de terre qui est distale du site cible. Soigneusement portait un petit trou dans le crâne avec la pointe d'un scalpel n ° 65 miniblade juste assez large pour l'extrémité courte de la p-chausséepour entrer et se reposer sur les méninges. La broche de terre doit être orienté de sorte qu'il est dirigée vers l'extérieur à partir Bregma et le futur tête-après (Fig. 6A).
  3. Fixer la tête-poste à la barre de montage et de bloquer et de joindre à la micromanipulateur. En déplaçant le micromanipulateur en trois dimensions, la position de la tête-post sur ​​Bregma, touchant tout juste le crâne (figure 6B). La base de la tête-post doit reposer à plat sur ​​le crâne.
  4. En utilisant des sondes de dissection, appliquez une petite quantité de ciment dentaire autour de la tête-poste et la broche de terre (Fig. 6C). Appuyez sur le ciment vers le bas pour assurer un bon contact avec le crâne. Remarque: Ne pas utiliser de ciment trop ou il ne sera pas durcira de façon égale. Cure du ciment avec une lumière UV-gun (3-4 cycles à partir d'angles multiples).
  5. Appliquer la deuxième étape de ciment et construire la base autour de la tête-après et couvrent les rainures de la tête-après (Fig. 6D).

4. Craniotomie

  1. Localisez la craniotomie marque de référence, qui sera partiellement masqué par l'amorce. Utiliser un scalpel # 65 pour marquer un carré de 3 mm x 3 mm autour de ce site et appliquez une goutte de la lidocaïne pour réduire la sensibilité et de minimiser les saignements.
  2. Assurez-scores multiples de chaque côté de la place (jusqu'à 10), en faisant attention de ne pas couper à travers l'os et dans le cerveau (Fig. 7A).
  3. Une fois le volet osseux devient lâche, utilisez la pointe du scalpel pour le soulever, laissant intacte la dure-mère (figure 7B).
  4. Couvrir avec de la cire d'os.

5. Post-chirurgie

  1. Éteignez l'anesthésie au gaz et enlever la souris à partir du cadre stéréotaxique.
  2. Utilisez un coton-tige à appliquer la pommade de lidocaïne autour peau exposée pour amortir la sensation autour de la plaie. Utilisez un autre coton-tige à appliquer Neosporin à la peau exposée. Injecter le kétoprofène (5 mg / kg IM ou IP en fonction des préférences individuelles des vétérinaires du IACUC) queun analgésique post-opératoire. Souris sera généralement lever et se déplacer à quelques minutes de l'arrêt de gaz.
  3. Placer la souris dans une cage au chaud et le moniteur jusqu'à ce qu'il soit prêt à retourner au logement des animaux.
  4. L'animal doit être vérifié au moins une fois par jour après qu'il a récupéré d'une intervention chirurgicale. Surveillez les signes de la mauvaise alimentation et / ou d'eau potable et le comportement apathique. Si la douleur est suspectée, de fournir kétoprofène toutes les 24 heures (même dose que à la fin de post-chirurgie) jusqu'à ce que soulagés. La lidocaïne peut être appliqué localement sur la plaie, si l'animal se gratte ou montre des signes d'inconfort. Animaux généralement récupérer de la chirurgie sans complications ou de la douleur.

6. Injection d'enregistrement et de Dye

  1. Attendez au moins un jour après la tête après chirurgie avant d'utiliser la souris pour les enregistrements.
  2. Placez la souris sur un dispositif de retenue de la mousse moulée sur le corps de la souris. La souris a déjà été adapté à cet appareil, réduisant ainsi son inquiétude. L'adaptation est typiquepour manipuler la souris tous les jours après le sevrage et pendant environ une semaine avant la chirurgie et des expériences, placez la souris dans le dispositif de la mousse pendant 1-5 minutes. Suspendre dans le dispositif de cadre stéréotaxique (fig. 4).
  3. Sécurisé tête-poste à la barre de montage, qui est maintenant fixée au cadre stéréotaxique (fig. 4).
  4. Connectez-vous à la broche de terre avec un fil terminé par un objet contondant de calibre 22 pointe de l'aiguille hypodermique.
  5. Retirer la cire d'os au cours de la craniotomie. Retirez-mère, si nécessaire en utilisant la pointe d'un scalpel miniblade.
  6. Entraînement électrode à l'emplacement approprié stéréotaxique et commencer l'enregistrement (Fig. 8). Pour seulement les enregistrements électrophysiologiques, une variété d'électrodes peuvent être utilisées. Le choix d'électrode est dépendante de l'emplacement et le type d'enregistrements requis. Le choix de l'électrode pour les enregistrements de la souris se réveillent sera la même chose que ce qu'un chercheur utilise dans une souris anesthésiée. Pour combinées avec des enregistrements électrophysiologiquescolorant / traceur injections, une électrode micropipette est utilisé à 10. La micropipette est rempli avec le colorant / traceur de choix de façon à pouvoir être injecté par iontophorèse à la fin de expériences électrophysiologiques. Électrodes Multibarrel peut également être utilisé afin que les manipulations pharmacologiques peuvent être faites. L'électrode multibarrel est monté sur une micropipette d'enregistrement unique (fig. 8). Ces techniques sont standard dans la littérature et ne sont pas différentes pour les enregistrements anesthésiés par rapport éveillé.
  7. Les enregistrements peuvent être réalisés pendant 4-5 heures sur 3-4 jours consécutifs.
  8. À la fin de la session d'enregistrement, le colorant / traceur peut être injecté. Parce qu'il n'ya pas de récepteurs de douleur dans le cerveau, l'injection iontophorétique de la teinture ou le traceur dans le cerveau est susceptible de provoquer l'inconfort. Cependant, une fois les propriétés de réponse électrophysiologique de la région où l'injection doit être faite sont caractérisés, l'animal pourrait être anesthésiés avec l'isoflurane fou l'injection. Cela permettrait d'éliminer toutes les sensations possibles indésirables. Parce que le colorant / traceur est déjà dans la micropipette, les fils actifs et la terre peut être commuté de l'enregistrement électrophysiologique set-up pour le générateur de courant à injecter du colorant iontophorèse / traceur. Utiliser le protocole approprié pour la teinture / traceur dans l'électrode. Retirer l'animal de la contrainte et à la retenue headpost corps et revenir à sa cage.
  9. A la fin de l'expérience, suivre le protocole approprié pour l'euthanasie et le traitement des tissus pour récupérer au site d'injection et de l'étiquetage.

7. Les résultats représentatifs

Une installation réussie de la tête-post permet à l'expérimentateur pour enregistrer les réponses simples et plusieurs unités d'un non anesthésié, la souris éveillée sur plusieurs jours. Le système de retenue permet à la stabilité des enregistrements électrophysiologiques de neurones isolés dans le cerveau. Excellente isolation des unités uniques et des réponses fortes tstimuli o peuvent être enregistrées à partir de la structure du cerveau même sur plusieurs jours, par exemple dans la souris colliculus inférieur (fig. 9A, le premier jour; figure 9B, deux jours). Avec une bonne tête après l'installation, chaque souris sera toujours alignée sur l'appareil de stéréotaxie et la souris stéréotaxique atlas, 13 résultant de la localisation fiable de noyaux du cerveau en particulier. Cette localisation permet fiables pour l'injection de colorants et des traceurs dans les structures spécifiques après des jours d'enregistrement multiples. Par exemple, pour évaluer en ordre descendant saillies du mésencéphale auditive à l'tronc cérébral, biotinylé dextrane aminé (visualisée en utilisant comme chromogène diaminobenzidine) peut être injecté dans la souris colliculus inférieur (fig. 10A) après l'identification des propriétés électrophysiologiques de réponse neuronales au niveau du site d'injection (dans la Fig. 10A, un neurone a été enregistrée avec une meilleure fréquence de 51 kHz), et après le traitement des tissus, uneétiquetage nterograde dans le noyau cochléaire controlatéral dorsale peut être visualisé et tracée (Fig. 10B). Photomicrographies à plus haute résolution peut également être obtenu pour afficher les axones marqués antérograde et des bornes (Fig. 10C).

Figure 1
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Figure 2
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Figure 3
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Figure 4
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Figure 5
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Figure 6

Figure 7
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Figure 8
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Figure 9
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Figure 10
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Discussion

L'avantage du système appuie-tête-poste pour des expériences électrophysiologiques et neuroanatomiques chez la souris, c'est que les expériences peuvent être réalisées avec non anesthésiés, les souris éveillées, élimination de la contamination potentielle due à la réponse des médicaments anesthésiques. En outre, la mise en place peut être utilisé sur plusieurs jours pour permettre une utilisation plus efficace des animaux.

La plupart des composants pour la tête-après sont disponibles dans le commerce-. Seul le chef de poste et les appareils de montage sont fabriquées sur mesure, qui sont tous deux relativement simple à construire et sont réutilisables. Si un atelier d'usinage n'est pas disponible dans un établissement, le chercheur peut probablement utiliser http://www.emachineshop.com/ pour fabriquer les composants nécessaires.

Compétent compétences chirurgicales sont nécessaires. Les chirurgiens doivent être compétents avec de fines techniques chirurgicales, dont certaines sont mieux faites sous un microscope. La chirurgie doit être faite dans des conditions aseptiques. Retrait de la trappe du crâne est le point le plus délicat de la procédure. Par soigneusement et doucement en plusieurs partitions avec un scalpel le long des 4 côtés du rectangle tout en regardant à travers un microscope opératoire, le volet du crâne peut être "sauté hors" avec saignement minime, laissant la dure-mère intacte. Familiarité avec le système vasculaire sous-jacente est essentiel, que de faire un cran au-dessus d'un vaisseau sanguin majeur crée un risque de saignement indésirable. Parce que notre recherche se concentre sur le système auditif, nous avons évité l'utilisation de perceuses pour réaliser craniotomies afin de minimiser le potentiel de l'os menée traumatismes de l'oreille interne.

Il est important pour obtenir le niveau de plan antéro-postérieur et dans l'alignement stéréotaxique avant de fixer la tête post. Cette précaution garantit que la tête restera niveau à travers des essais expérimentaux et facilite le repérage des lieux du cerveau en utilisant un atlas du cerveau.

tente "> Pour l'enregistrement, il est utile de manipuler la souris sur une base quotidienne pendant quelques jours avant la chirurgie. Le simple fait de la souris exposés à la manipulation et à la retenue dans le dispositif de mousse facilite sessions d'enregistrement plus longs avec le stress réduit beaucoup et le mouvement du souris. La clé est d'avoir la souris bien ajusté dans le sandwich mousse. Si l'animal peut se déplacer trop, elle tend à se battre en permanence. Si la souris se met à battre, il est préférable de mettre fin à la session d'enregistrement et de reprendre la prochaine jour. Mouvement des résultats de la souris dans biopotentiels grandes dans les enregistrements qui ne sont pas évoqués par les stimuli. Ce sont généralement plus grande amplitude que les potentiels d'action et sont intermittentes. des artefacts de mouvement peuvent également être générés par les fils d'enregistrement touchant l'animal. Il est important pour s'assurer qu'il n'y a pas de fils touchant l'animal. Dans l'ensemble, cette technique nous a permis de mener plusieurs études sur le traitement auditif et de l'anatomie sans l'utilisation d'anesthésiques.

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Disclosures

Nous n'avons rien à communiquer.

Acknowledgments

Soutenu par la NSF subvention 0920060, NIH DC004395, NHMRC subvention 1009482, NSW Bureau de la science et de la recherche médicale, et la Passe Garnett et Rodney Williams Memorial Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Etch gel for cleaning skull prior to dental cement Henry Schein 101-5396 12/pk with 1.2 mL syringes
Primer for dental cement Kerr Optibond 25881 8 mL bottle
Adhesive for dental cement Kerr Optibond 25882 8 mL bottle
Applicators for dental cement Kerr Optibond 24680 200/pk
Dental Cement Charisma, Heraeus Kulzer 66000085 4gm Syringe Refill
Tungsten Rod (Ground Pin) A-M Systems 717200 0.010" diameter
Economy UV Curing Light Henry Schein CU-80
Head-post Built in-house
Mounting bar Built in-house
Mounting block Built in-house
Stereotaxic Frame David Kopf Instruments 902
Mouse and Neonatal Rat Adaptor Stoelting Co. 51625
Deltaphase Isothermal Pad Braintree Scientific, Inc. 39DP

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References

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