Kolonisering av Euprymna scolopes Squid av Vibrio fischeri

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Metoden beskriver prosedyren der den hawaiiske Bobtail squid,

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Naughton, L. M., Mandel, M. J. Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri. J. Vis. Exp. (61), e3758, doi:10.3791/3758 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Spesifikke bakterier er funnet i sammenheng med animalsk vev 1-5. Slike host-bakterielle foreninger (symbiose) kan være skadelig (patogene), har ingen fitness konsekvens (Commensal), eller være fordelaktig (mutualistic). Mens mye oppmerksomhet har blitt gitt til patogene interaksjoner, er lite kjent om de prosesser som avgjør den reproduserbare oppkjøpet av gunstige / Commensal bakterier fra omgivelsene. Lyset-orgelet mutualism mellom de marine Gram-negative bakterien V. fischeri og den hawaiiske Bobtail squid, E. scolopes, representerer en svært spesifikk interaksjon der en vert (E. scolopes) etablerer et symbiotisk forhold med bare en bakteriearter (V. fischeri) i løpet av sin levetid 6,7. Bioluminesens produsert av V. fischeri løpet av denne interaksjonen gir en anti-rov fordel for E. scolopes under nattlige aktiviteter 8,9, mensden næringsrikt vert vev gir V. fischeri med en beskyttet nisje 10. Under hver vert generasjon, blir dette forholdet rekapitulert, og dermed representerer en forutsigbar prosess som kan vurderes i detalj på ulike stadier av symbiotisk utvikling. I laboratoriet, juvenile blekksprut luke aposymbiotically (uncolonized), og, hvis samlet i løpet av de første 30-60 minutter og overført til symbiont-fritt vann, ikke kan bli kolonisert med unntak av den eksperimentelle podestoff 6. Denne interaksjonen gir dermed en nyttig modell system der for å vurdere de enkelte trinn som fører til spesifikke oppkjøp av et symbiotisk mikrobe fra miljøet 11,12.

Her beskriver vi en metode for å vurdere graden av kolonisering som oppstår når nyklekkede aposymbiotic E. scolopes er utsatt for (kunstig) sjøvann som inneholder V. fischeri. Denne enkle analysen beskriver inokulasjon, naturlig infeksjon, og utvinningav bakteriell symbiont fra den gryende lysorganet E. scolopes. Care er tatt for å gi en konsekvent miljø for dyrene under symbiotisk utvikling, spesielt med hensyn til vannkvalitet og lette signaler. Metoder for å karakterisere det symbiotiske befolkningen beskrevet inkluderer (1) måling av bacterially-avledet bioluminesens, og (2) direkte koloni telling av gjenvunne symbionter.

Protocol

1. Utarbeidelse av Bakteriell Inocula

  1. Dag 0
    To dager før blekksprut inokulasjon, plate de aktuelle bakteriestammene på LBS 13 agar.
  2. Inkuber bakterier ved 25-28 ° C over natten.
  3. Dag 1
    Inokuler 3 ml LBS medium i et glass kultur rør med en koloni av hver V. fischeri belastning for infeksjon. Forbered duplisere rør som backup.
  4. Dag 2
    (Koordinere bakterielle skritt 01.04 til 01.06 med blekksprut trinn 3.7-3.10)
    1 time før inokulasjon, subkultur bakterier 1:80 (37,5 mL) i 3 ml LBS i et glass kultur rør og vokse i 1 time med lufting.
  5. Mål OD 600 av prøven før inokulasjon. Typiske målinger er 0,3 til 0,6 avhengig av belastningen.
  6. For et mål podestoff på 3-5 x 10 3 CFU / ml beregne podestoff volum som følger: podestoff volum (mL) = 1,25 / OD 600 (f.eks For OD 600 = 0,5, beregnet podestoff volum = 1.25/0.5 = 2,5 mL). Dette beløpet blir lagt direkte til sjøvann inneholder blekksprut i trinn 4.1. Denne beregningen må kanskje justeres for forskjellige stammer av V. fischeri eller for poding på lavere eller høyere nivå enn det som er angitt her.

2. Utarbeidelse av Agar Plater for Bestemmelse av Inocula

  1. For hver behandling, etikett LBS plater (2 per behandling) til plate prøver av podestoff i trinn 4.1.
  2. Legg 5 sterile plating perler per plate.

3. Innsamling av Squid Juveniles

  1. Mål saltholdighet av Instant Ocean med refraktometer og juster til 35 ‰.
  2. Filter 1 L av Instant Ocean bruke filtrering enhet og en vedlagt vakuum linje eller vakuum pumpe, for å generere filter-steriliseres Instant Ocean (FSIO). Oxygenate vannet ved å svinge kraftig før hver dispensering. The filter enhet kan gjenbrukes i 2 dager.
  3. Delmengde 40-50 ml FSIO i hver av de to (2) disponibel sample boller. Etikett en som earlies og en som timelies.
  4. Forbered et overskudd av plast overføring pipetter for å anskaffe juvenil blekksprut ved å kutte pipette ca 1 cm fra tuppen, over de laveste rygger (se figur 3). Dette muliggjør et større område der blekkspruten kan passere på samling. Kast eventuell overføring pipetter hvor det er en grov eksponert overflate.
  5. Bruke preparerte transfer pipetter, samle E. scolopes som klekket natten og overføre til earlies skål FSIO. Tidlige hatchlings har vært i egget systemet i over 1 time og er mottakelige for kolonisering av forurensende V. fischeri i egget systemet. Ikke bruk earlies for sensitive kolonisering eksperimenter.
  6. Sjekk egg tanker hver 30-45 min for nye hatchlings. Sikre at alle hatchlings er fjernet i løpet av hver cpokker. Fjern hatchlings med en overføringspipetten, og innskudd til timelies skål med FSIO. Dyr samlet i tide er tilgjengelig for kolonisering eksperimenter.
  7. Når samlingen er ferdig (~ 45 min etter skumring), overføre blekksprut til hoved laboratoriet. Empirisk er det en fordel å kolonisere dyra henhold uforstyrret laboratorieforsøk lysforhold for 3 t vaksinasjoner.
  8. For hver behandling, utarbeide en bolle med 40 ml FSIO. Legg blekksprut til skålene for analysen (maks n = 40 per bolle).
  9. Forbered en ekstra skål som en aposymbiotic (negativ) kontroll.
  10. Forbered en dedikert overføringspipetten for hver behandling.
  11. Avlive ekstra blekksprut i 2% etanol.

4. Squid Colonization

  1. Dag 2 - Bruk en P10 Pipetman, dispensere beregnet delmengde av bakterier (Step 1,5) inn i hver blekksprut bolle (Step 3,8) for hver behandling. Start en 3 t timer umiddelbart etterden første inokulasjon.
  2. For hver behandling, skaper en "vortex" i bollen med den dedikerte overføringspipetten ved å plassere pipette nær kanten av bollen og pipettering opp og ned flere ganger for å blande vann og blekksprut i ca 10 sek. Grundig blanding er kritisk.
  3. Plate 50 mL fra hver bolle til en LBS agarskål fra trinn 2,2 (for teknisk gjentak, plate to 50 mL plater per behandling). Inkuber ved 25-28 ° C over natten.
  4. Forbered vask boller (100 ml FSIO / ea) for hver behandling.
  5. Forbered Drosophila hetteglass (4 ml FSIO / ea) for hver blekksprut.
  6. Etter nøyaktig tre timer, overføre blekksprut til sine respektive vaske skålene (komplett for all behandling). Dette stopper inokulasjon.
  7. Fortsett å overføre enkelte blekksprut til sin egen Drosophila hetteglass med FSIO. Bruk en utpekt overføringspipetten for hver behandling.
  8. Flytt skuffer av Drosophila hetteglass til squid anlegget for å gå tilbake til den dagen / night lys syklus dyrene opplevde under embryogenese.
  9. Dag 3 - Prepare Drosophila hetteglass (4 ml FSIO / ea) for hver blekksprut.
  10. Før skumringen på 22-24 timer etter inokulasjon, overføre hver blekksprut til en ny Drosophila hetteglass. Bruk en utpekt overføringspipetten for hver behandling.
  11. Dag 4 - Forbered merket 1,5 ml Mikrosentrifugerør (1/squid).
  12. Før skumringen på 46-48 timer etter inokulasjon, måle og registrere luminescence av hver blekksprut i Drosophila hetteglasset (luminometer sett for 6 s integrering og auto-leser på lokket nedleggelse).
  13. Som en negativ kontroll for bakgrunn luminescence, måle en ampulle med FSIO som ikke inneholder noen blekksprut.
  14. Overfør hver blekksprut i et volum på ca 700 mL til et 1,5 ml mikrosentrifuge rør fra trinn 4.12. Flytt til en papp fryser boks. Når lokket er plassert på boksen, ikke fjerne den så lyset pekepinner for bakterier utvisning ikke er well-forstått.
  15. Frys Mikrosentrifugerør ved -80 ° C over natten.

5. Bestemmelse av kolonisering Levels

  1. For hver blekksprut, forberede to (2) Mikrosentrifugerør, hver med 475 mL FSIO (eller autoklaveres 70% Instant Ocean).
  2. Forbered pestles ved første å bruke en Kimwipe å rense stampe og fjerne brutto rusk og / eller vev.
  3. Place pestles tip-ned i en 50 ml begerglass som inneholder 95% etanol. Etanol bør legges til en høyde på ca 3 cm.
  4. For hver stampe, fjerne fra begerglasset og tørk i spissen med en Kimwipe.
  5. Dypp stampe tilbake i etanol bad, fjerne og sette inn (tips opp) inn en mikrosentrifuge tube stativ og la det lufttørke fullstendig i omtrent 15 minutter.
  6. Tine blekksprut i en mikrosentrifuge tube stativ (maks n = 8).
  7. Om nødvendig, juster volumet til 700 mL.
  8. Ved hjelp av en stampe fra trinn 5,5, forstyrre dyr vevet før blekket sac RUPTures (vannet vil bli en skummel grå farge).
  9. Fjern stampe og sikre alle vev forblir i røret.
  10. Vortex vevet kort i nøyaktig 10 sekunder (bruk et tidsur).
  11. La vev hvile i 10 min. Vevet vil bosette og bakterier og blekk forblir i løsning. For beregningene som følger, er bakterier / blekk løsning på [A] fortynning (dvs. E. scolopes lysorgan homogenat i 700 mL). Serial 1:20 fortynninger ([B], [C]) er beskrevet nedenfor.
  12. For [B] fortynning, legg 25 mL [A] til en av de Mikrosentrifugerør utarbeidet i trinn 5.1. Vortex.
  13. For [C] fortynning, legg 25 mL [B] til en av de Mikrosentrifugerør utarbeidet i trinn 5.1. Vortex.
  14. Plate 50 mL av hver fortynning på LBS agar, replikerer 2 per behandling.
  15. Inkuber platene ved 25-28 ° C over natten.

6. Data Analysis

  1. For å beregne CFU / lys organ (LO), landt kolonier på plate for hver behandling der 10-400 kolonier er til stede, og bruke riktig formel:
    CFU / LO = (koloniene på [A] plate) x 14, eller
    CFU / LO = (koloniene på [B] plate) x 280, eller
    CFU / LO = (koloniene på [C] plate) x 5600.
  2. Plott individuelle datapunkter og median på en logaritmisk skala.
  3. Dataene er ofte ikke normalfordelt, med ulike variasjoner, og uteliggere kan inneholde biologisk meningsfull informasjon. Derfor er ikke-parametriske testene gir en nyttig metode for å avgjøre om de behandlingene varierer betydelig.
  4. Bruk GraphPad Prism programvare for statistisk analyse. For to behandlinger, bruke Wilcoxon Rank Sum test. For sammenligninger mellom større enn to behandlinger, bruker Kruskal-Wallis test med nødvendige post-tester.

7. Representative Resultater

Resultater fra en prøve kolonisering analysen er vist i figur 4. To stammer av E. scolopes symbiont, ES114 14, og den lysere Sepiola Robusta symbiont, SR5 15,16. Lignende podestoff nivåer (Fig. 4A) fører til 100% kolonisering innen 3 timer. På 48 h, ble luminescence nivåene (Fig. 4B) og CFU teller (Fig. 4C) fast bestemt på å vurdere kolonisering ferdighet av belastningen. Bestemmelse av spesifikke luminescens (Fig. 4D; per bakterien) gir mulighet for bestemmelse av lysstyrken til hver bakteriestamme under symbiose.

Figur 1
Figur 1. Flow diagram av kolonisering prosedyren. Bakterier og blekksprut høstes separat, deretter blandes i den angitte podestoff. Squid er vasket, deretter overført til nytt vann på 3 t, 24 t, og 4 8 timer etter inokulasjon. På 48 t luminescence måles og dyrene er frosset, tjener som til overflaten-sterilisere dyrene. Lys-orgel kolonisert bakterier forbli levedyktig ved -80 ° C gjennom en tine (ingen ekstra fryse-tine sykluser).

Figur 2
Figur 2. Flytskjema illustrerer homogenisering og fortynning plating av bakteriene. Serial 20-fold fortynninger gi riktig dynamiske området for telling av koloniserte bakterier.

Figur 3
Figur 3. Overfør pipetter med en hensiktsmessig smal sjakt taper til en smal boring (A) som ville skade ungdomsfengsel blekksprut. Forbehandling ved å kutte av den smaleste delen med saks eller et barberblad gir et hensiktsmessig verktøy (B) for overføring av juvenile blekksprut.

s/ftp_upload/3758/3758fig4.jpg "/>
Figur 4. Innsamlede dataene for en kolonisering analysen. (A) Nivåer av bakterier i podestoff boller. (B) Luminescence av individuell blekksprut. (C) kolonitellinger av individuell blekksprut. (D) Spesifikk luminescence av individuell blekksprut. Apo, Aposymbiotic (uncolonized negativ kontroll).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Koloniseringen analysen beskrives tillater analyse av et naturlig symbiotisk prosess i et kontrollert miljø laboratorium. Som sådan kan den brukes til å vurdere kolonisering av muterte stammer, av ulike naturlige isolater og under ulike kjemiske regimer. Variasjoner på de eksperimentene som er beskrevet blir ofte brukt til å vurdere ulike sider ved symbiose. Kinetikken av kolonisering kan måles ved å undersøke luminescence under den første 24 timer, noe som kan oppdages automatisk i en scintillation skranke der tilfeldigheter detektoren har blitt fjernet. Videre kan den relative kolonisering evne en belastning i forhold til en annen måles ved en konkurransedyktig kolonisering analysen, der produksjonen forholdet av de to stammene i et sett av dyr er normalisert til inngangen ratio (differensial deteksjon av distinkt antibiotikaresistens, fluorescens , eller kromogene [LacZ / Xgal] markører). Endelig kan kolonisering bli fotografert direkte av confocal microscopy.

Det er viktig å bruke sunn juvenile blekksprut for eksperimentene. Atferdsmessige indikatorer på dårlig blekksprut helse inkluderer bading i sirkler (avlive dyret), eller dyr som forblir hvit og ikke endre sine chromatophores å bli brun på en mørk overflate (bruk med forsiktighet). Ettersom det finnes variasjon i verten populasjoner, er et større antall gjentatte eksperimenter med mindre antall dyr ofte mer verdifullt enn et mindre antall gjentatte eksperimenter med store utvalgsstørrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgements

Forfatterne takker Mattias Gyllborg for blekksprut anlegg støtte og for kommentarer til dette manuskriptet, Michael Hadfield og Kewalo Marine Laboratory for hjelp under felt innsamling, og medlemmer av Ruby og McFall-Ngai Laboratorium for bidrag til denne protokollen. Arbeid i Mandel Laboratory er støttet av NSF IOS-0843633.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter VWR international 47729-580
Caps for Glass Culture Tubes Fisher Scientific NC9807998
Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 Biowave CO8000 Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used.
GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer Promega Corp. E5311 Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder.
GloMax 20/20 Light Standard Promega Corp. E5341 For luminometer calibration.
Refractometer, Handheld Foster & Smith CD-14035 Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up.
Instant Ocean (artificial seawater concentrate) Foster & Smith CD-16881 Prepare at 35 ≥ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter.
Filtration Unit Nalge Nunc international 158-0020 Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters.
Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings.
Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) Comet T9S (9 oz.) Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼", lower diameter 2 ¼", height 3". Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9.
Drosophila Vials VWR international 89092-720 Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT.
1.5 ml Microcentrifuge Tubes ISC Bioexpress C-3217-1CS Tubes must fit the shape of the pestles.
Ethanol, 200 Proof Fisher Scientific BP2818-100
Pestles Kimble Chase 749521-1500
Plating Beads, 5 mm diameter Kimble Chase 13500 5 Prepare 5 per tube and autoclave.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
  3. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
  4. Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
  5. Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
  6. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
  7. Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
  8. McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
  9. Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
  10. Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
  11. Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
  12. Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. (2009).
  13. Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. PACON International. Honolulu, Hawaii. (2001).
  14. Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
  15. Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
  16. Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics