परख के लिए तरीके ड्रोसोफिला व्यवहार

Published 3/07/2012
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Neuroscience

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Summary

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर एक आनुवंशिक और behaviorally विनयशील मॉडल प्रणाली है कि एक एक सदी से भी अधिक के लिए कई महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं की आणविक और सेलुलर आधार को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है है ड्रोसोफिला अच्छी तरह से किया गया है मक्खी व्यवहार के आनुवंशिक आधार में अंतर्दृष्टि लाभ का फायदा उठाया है.

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Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to Assay Drosophila Behavior. J. Vis. Exp. (61), e3795, doi:10.3791/3795 (2012).

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Abstract

Protocol

ए लारवल क्रॉलिंग परख

1. लार्वा संग्रह

  1. मक्खियों (10-15 + पुरुषों 10-15 महिलाओं) के एक 8 औंस की बोतल सेट.
  2. 24 घंटे के लिए मक्खियों अंडे, तो मक्खियों की बोतल स्पष्ट करना. (एक नई बोतल में वयस्कों के स्थानांतरण और आवश्यक के रूप में दोहराएँ).
  3. 3-4 दिनों के लिए बोतल सेते हैं, या जब तक तीसरे instar लार्वा दिखाई दे रहे हैं.
  4. 50 जोड़ें - लार्वा साथ बोतल के लिए 20% sucrose के 100 मिलीग्राम और 20 मिनट के लिए बैठते हैं. लार्वा ऊपर फ्लोट जाएगा.
  5. लीजिए टिप के साथ एक 25 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक विंदुक का उपयोग लार्वा काट, और एक जाल टोकरी में जगह.
  6. जाल टोकरी में विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ दो बार लार्वा धो लार्वा अब प्रयोगों के लिए तैयार हैं.

2. दवा के साथ लार्वा का इलाज

  1. एक ब्रश का उपयोग करने के लिए 5 मिलीग्राम 5% समाधान + sucrose के दवा युक्त बीकर लार्वा की वांछित संख्या परिवहन.
  2. चलो कम से कम 15 मिनट के लिए लार्वा फ़ीड.
  3. एक जाल टोकरी में दवा इलाज लार्वा डालो और कुल्ला. वे अब कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए तैयार हैं.

3. लोकोमोटर परख (कुल दूरी को मापने कूच या शरीर दीवार संकुचन)

  1. एक ब्रश का उपयोग करने के लिए एक व्यक्ति लार्वा परिवहन:
    1. 15 सेमी पेट्री ग्राफ़ पेपर पर 0.2 सेमी 2 ग्रिड के साथ पकवान युक्त agarose 2% (पहले डाला और कड़ा करने की अनुमति दी है).
      1. 1 मिनट में पार कर ग्रिड लाइनों की संख्या गिनती.
    2. एक गिलास विच्छेदन एक कमजोर खमीर पेस्ट समाधान युक्त पकवान की अच्छी तरह से.
      1. एक मिनट में क्रमाकुंचन संकुचन (पीछे = 1 संकुचन आंदोलन के लिए पूर्ण पूर्वकाल) की गणना जबकि एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे देख.
  2. दोहराएँ जब तक लार्वा की वांछित संख्या गिना गया है.

बी तेज चलने का नकारात्मक geotaxis (रिंग) प्रोटोकॉल

यह परख मूल डेGargano एट अल 5 द्वारा मानते.

  1. एक मानक शीशी युक्त भोजन (या भोजन + दवा) में नव प्रकाश सीओ 2 anesthetization और स्थान के तहत उभरा वयस्क पुरुष मक्खियों लीजिए.
  2. बनाए रखने के कमरे के तापमान पर मक्खियों (बेंच शीर्ष पर ~ 22 डिग्री सेल्सियस) 2-3 दिन के लिए सीओ 2 से वसूली (और स्थिर राज्य दवा के स्तर का संचय यदि उचित हो) के लिए अनुमति के लिए.
  3. स्थानांतरण तैयार polystyrene शीशियों anesthetizing के बिना 25 मक्खियों के बारे में.
  4. रिंग उपकरण (चित्रा 1) में मक्खियों के साथ शीशियों को इकट्ठा करो.
  5. मक्खियों को पर्यावरण, 15-20 मिनट के लिए undisturbed, जलवायु के अनुकूल बनाना करने के लिए अनुमति देते हैं.
  6. इस समय जगह डिजिटल कैमरा के दौरान ~ ध्यान केंद्रित तंत्र के सामने (अगर शीशियों के मध्य ऊंचाई पर लेंस के केन्द्र संरेखित करने के लिए आवश्यक एक मंच पर) में 1 मीटर, और तंत्र पर कैमरा ज़ूम, और एक टाइमर सेट करने के लिए 3.0 सेकंड.
  7. ध्यान रिंग तंत्र के अपने बाएँ हाथ से जिले को पकड़ ले तो के रूप में नहींURB मक्खियों, और अपने दहिने हाथ के साथ टाइमर पकड़ो.
  8. तेजी से तंत्र नल नीचे बेंच तीन बार की सतह पर, यह सुनिश्चित करना है कि नल के लिए कड़ी मेहनत करने के लिए नीचे शीशियों के नीचे करने के लिए सभी मक्खियों दस्तक करने के लिए पर्याप्त है.
  9. इसके साथ ही तीसरे नल के पूरा होने के साथ, 3 दूसरी उलटी गिनती घड़ी शुरू.
  10. तीन सेकंड में एक तस्वीर ले लो.
  11. 1 मिनट के लिए घड़ी रीसेट करें और शुरू. इस समय के दौरान और तंत्र पर फोकस कैमरा रीसेट करने के लिए, और तीन सेकंड के लिए टाइमर का एक और चैनल सेट.
  12. 1 मिनट के बाद, दोहराने 1.7-1.10 कदम
  13. कुल 5-6 परीक्षणों के बाद, एक कंप्यूटर पर अपलोड छवियों और अपने पसंदीदा छवि दर्शक का उपयोग करने के लिए खुला, और स्कोर औसत ऊंचाई शीशी में से प्रत्येक के लिए चढ़ गए.
  14. अपने विभिन्न समूहों की तुलना मतलब चढ़ ऊंचाई पर सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन करते हैं.

सी. प्रेमालाप और संभोग परख

  1. सुबह में पहली बात, स्पष्ट FLI की अच्छी तरह से उत्पादन की बोतलेंतों इस्तेमाल किया जा करने के लिए.
  2. दिन (हर 3-4 घंटे) के पाठ्यक्रम के दौरान, नव उभरा यौन अनुभवहीन पुरुषों और महिलाओं को इकट्ठा:
    1. माध्यम साथ शीशियों या ट्यूबों में पुरुषों को अलग - अलग रखें.
    2. शीशी / ट्यूब प्रति 5-6 महिलाओं को एक साथ रखें.
    3. 25 ° C पर 12 घंटा प्रकाश / 5 दिनों के लिए अंधेरे के तहत एकत्र मक्खियों अलग.
    4. एक संभोग पहिया के चेंबर में एक महिला स्थानांतरण.
    5. एक संभोग पहिया के कक्ष में एक पुरुष स्थानांतरण.
    6. निम्नलिखित व्यवहार के लिए एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे जोड़ी निरीक्षण
      1. उन्मुखीकरण (महिला की ओर पुरुष orients)
      2. दोहन ​​(पुरुष महिला नल)
      3. विंग गीत (पुरुष प्रदान करता है और एक पंख कंपन)
      4. चाट (पुरुष licks के महिला जननांग)
      5. कर्लिंग (पुरुष खुद के तहत अपने पेट कर्ल)
      6. शयन करने का प्रयास (कर्लिंग गतिविधि महिला माउंट करने का प्रयास करते समय)
  3. 1 के लिए निरीक्षण0 मिनट या सफल शयन तक, जो समय पर प्रत्येक व्यवहार होता है टिप्पण (विलंबता) (कुल शयन तक प्रेमालाप व्यवहार (प्रेमालाप सूचकांक की गणना करने के लिए), साथ ही जोड़े की संख्या है कि सफलतापूर्वक दिया व्यवहार करने में लगे समय ) आवृत्ति. जंगली प्रकार जोड़े के 100% आम तौर पर 5 मिनट के भीतर दोस्त होगा.
  4. गणना समय विभाजित करके एक प्रेमालाप सूचकांक (CI) शयन तक कुल समय से विभाजित प्रेमालाप में बिताया. जंगली प्रकार जोड़े के लिए यह आम तौर पर 0.6-0.8 के बीच पर्वतमाला.

प्रतिनिधि डी. परिणाम

परख रेंगने

सामान्य जंगली प्रकार लार्वा ~ 3 सेमी / मिनट, और प्रदर्शन ~ एक मिनट में 40-50 शरीर दीवार संकुचन भटकना होगा. हमने हाल ही में / fus TLS से संबंधित amyotrophic पार्श्व काठिन्य कि लार्वा रेंगने दोष, कम जीवन अवधि और चढ़ाई वयस्क 6 हानि से पता चलता है की एक ड्रोसोफिला मॉडल विकसित किया है. हम अभिव्यक्ति ओ लक्षितच जंगली प्रकार और मोटर न्यूरॉन्स ड्राइवर ठीक-371-gal4 और fus / टीएलएस की उत्परिवर्ती रूपों एक लार्वा रेंगने परख प्रदर्शन किया. जैसा कि नीचे दिखाया गया है, जंगली प्रकार लार्वा 12 सेमी करने के लिए क्रॉल, जबकि जंगली प्रकार fus की अभिव्यक्ति लगभग 6 सेमी लार्वा रेंगने क्षमता की कमी हुई. ALS के कारण fus / टीएलएस में उत्परिवर्तन R521C व्यक्त पशु उनके रेंगने आंदोलन में एक बहुत गंभीर हानि (चित्रा 1) प्रदर्शित करता है, केवल बारे में 1 सेमी / मिनट रेंगने.

नकारात्मक geotaxis रिंग परख

युवा जंगली प्रकार वयस्क मक्खियों ~ एक समय 3 सेकंड की अवधि में 4-5 सेमी (3 सेकंड से समय समायोजित किया जा सकता है अलग अलग उपभेदों या गतिविधि के स्तर को समायोजित करने के लिए एक औसत ऊंचाई को परिभाषित एक दिया की एक औसत ऊंचाई चढ़ाई होना चाहिए /) उपचार तनाव. मक्खियों है कि तल पर रहना 0 के एक मूल्य सौंपा है. यह शीशी प्रति 25 से अधिक मक्खियों का उपयोग करें, क्योंकि यह तो मुश्किल हो जाता है ऊंचाई मापने के लिए प्रत्येक व्यक्ति के लिए मक्खी के स्थान निर्धारित करने के लिए नहीं की सलाह दी है. एनओ विसुग्राहीकरण पर देखा गया है 6 लगातार अलावा एक मिनट है कि हम कार्यरत हैं दूरी परीक्षण के लिए. यह महत्वपूर्ण है डेटा की प्रारंभिक सेट के बाद इस परख में polystyrene परीक्षण शीशियों को पुन: उपयोग नहीं कर रहे हैं इकट्ठा क्योंकि नई प्रयुक्त शीशियों में रखा ताजा शीशियों में मक्खियों के रूप में उसी हद तक नहीं चढ़ जाएगा.

चित्रा 1
चित्रा 1 रिंग परख के लिए सेटअप. डिजिटल कैमरा ~ 1 मीटर polystyrene शीशियों में मक्खियों युक्त उपकरण के सामने रखा जाता है, तंत्र पर ध्यान केंद्रित करने और कैमरा ज़ूम, और 3.0 सेकंड के लिए एक टाइमर सेट.

चित्रा 2

चित्रा 2. लार्वा रेंगने का उपयोग परख से प्रतिनिधि डेटा ectopically से यूएएस-fus WT व्यक्त मक्खियों, R521C और मोटर न्यूरॉन ड्राइवर (OK371 gal4) के नियंत्रण के तहत यूएएस-fus.

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Discussion

ड्रोसोफिला व्यवहार कस आनुवांशिक और पर्यावरणीय कारकों द्वारा नियंत्रित किया जाता है. हम, और दूसरों को, पहले यहाँ वर्णित assays के व्यवहार और मानव neurodegenerative ड्रोसोफिला 5-19 में मॉडलिंग की बीमारियों के लिए उड़ान भरने के संबंधित जीन की जांच करने के लिए डेटा इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया है. रेंगने परख के लिए, 3 Rd instar लार्वा के सावधान चयन एक महत्वपूर्ण कदम है. यदि एक दवा के साथ इलाज, यह 10-15 मिनट (या अधिक प्रकार और दवा की प्रकृति पर निर्भर करता है) लेने के लिए अधिक से अधिक प्रभाव को प्राप्त अगर यह अच्छा विलेयता है. इसलिए, हम नियमित रूप से 15 मिनट के लिए दवा मक्खियों फ़ीड, और फिर परीक्षण से पहले एक अतिरिक्त 15 मिनट तक प्रतीक्षा करें. यह महत्वपूर्ण है, तथापि, समाधान में दवा सांद्रता रखने के, और उपचार समूहों के बीच जोखिम बार, सटीक तुलना के लिए ही है. सीएनएस सक्रिय दवाओं आमतौर पर एक अधिक से अधिक स्थायी प्रभाव ~ 45 मिनट होगा. (या खिला खोदा) चयन करने के लिए मक्खी भोजन को हटाने और लार्वा के बाद अच्छी तरह से धोया जाना चाहिएअनुमति रेंगने परख शुरू करने से पहले 1 मिनट के लिए acclimatized. अगर प्लेट एक घंटे के लिए कमरे के तापमान (~ 22 डिग्री सेल्सियस) में रखा जाना चाहिए, के रूप में कम तापमान लार्वा रेंगने की क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं. हालांकि लार्वा रेंगने परख गतिविधि के स्तर के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं, यह सूक्ष्म समन्वय घाटे के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है. इसलिए, एक स्क्रीनिंग मंच के रूप में यह पहली बार एक सकल गतिविधि घाटे की जांच पारित करने के लिए सबसे उपयुक्त है.

एक वयस्क व्यवहार है कि ठीक मोटर समन्वय शामिल है प्रेमालाप और संभोग है. यह व्यवहार करने के लिए मानव रोगों के लिए प्रासंगिक व्यवहार के पहलुओं की जांच करने का इस्तेमाल किया गया है, और ठीक मोटर 18 को नियंत्रित करने के लिए इसके अलावा में संवेदी प्रसंस्करण (घ्राण, दृश्य, ध्वनिक) शामिल है. जब एक पुरुष एक महिला नोटिस, वह प्रेमालाप अनुष्ठान है कि अभिविन्यास (व्यवहार की ओर मोड़ और महिला का पीछा करते हुए) के साथ एक स्टीरियोटाइप पैटर्न के शुरुआत में प्रगति शुरू की. यह wingsong, lickin द्वारा पीछा किया जाता हैजी और genetalia महिला के दोहन, महिला की ओर पेट के कर्लिंग, और शयन, जो पिछले 20-22 मिनट के कई दसियों में खत्म. क्योंकि प्रेमालाप के पहलुओं के कई दृश्य cues शामिल है, अंधेरे की स्थिति संभोग प्रदर्शन की गिरावट के लिए सीसा, और assays पर्याप्त प्रकाश के साथ किया जाना चाहिए इतना है कि मक्खियों एक दूसरे को देख सकते हैं. तदनुसार, सफेद आंखों मक्खियों को आम तौर पर हमारे वर्णित परख में बेहद खराब प्रदर्शन किया है और पाठकों प्रयोगों की योजना बना उन्हें इस प्रोटोकॉल के साथ उपयोग करने के खिलाफ सलाह दी जाती है. यदि एक दवा के साथ मक्खियों के उपचार, मध्यम में दवा डाल मक्खियों पर अलग कर रहे हैं (जैसे agarose 1% + 10% sucrose के + मानक के बजाय भोजन दवा जब दवा के साथ इलाज में सूक्ष्मजीवों द्वारा दवा के किसी भी संभावित गिरावट से बचने ) भोजन. आम तौर पर मक्खियों 5 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब है कि उन्हें भोजन की 300-500 मिलीलीटर, कपास के साथ खामियों को दूर में अलग कर रहे हैं. संभोग पहिया करने के लिए स्थानांतरण करने के लिए मक्खियों नहीं असंवेदनता उत्पन्न करना. यह मैंबिल्कुल संभोग पहिया बहुत के बीच अच्छी तरह से धोने के लिए गंभीर है किसी भी अवशिष्ट pheromones के हिल के साथ रात पर alconox साबुन की छोटी राशि के साथ गर्म पानी, फिर मिलाते साथ विआयनीकृत पानी में कम से कम 48 घंटे के लिए धोया, और पानी के कई परिवर्तन को दूर करने के लिए उपयोग करता है . एक और विचार जब परख हम वर्णन प्रदर्शन मौसम है. हमारे अनुभव मक्खियों में अगर यह बारिश हो रही है या अदालत नहीं होगा लगता है कि यह बरसात होगी. वे चमकदार धूप दिन पर सबसे अच्छा प्रदर्शन है, चाहे अगर प्रयोगशाला विंडोज़ या नहीं है. हमारे वर्तमान सिद्धांत है कि इस घटना के वायुमंडलीय दबाव से संबंधित है, लेकिन हम यह जांच नहीं की है.

पारंपरिक नकारात्मक geotaxis के परख मापने कितने मक्खियों 10 सेकंड (में वर्णित में एक पूर्व निर्धारित ऊंचाई से ऊपर चढ़ने पर निर्भर करता है http://www.jove.com/details.php?id=2504 ). हम मानते हैं कि रिंग परख परंपरागत परख पर कुछ फायदे हैं. एक टी हैhroughput, के रूप में छह स्वतंत्र प्रतिकृति एक साथ एक मानक परख की तुलना में मापा जा सकता है, और प्रणाली आम तौर पर स्केलेबल है. एक और संवेदनशीलता है, क्योंकि औसत ऊंचाई एक निर्धारित समय अवधि में चढ़ रहा है एक पास है / पूर्ण ऊंचाई के लिए असफल संख्या के बजाय मात्रा,. इस दृष्टिकोण का उपयोग, अधिक सूक्ष्म घाटे देखा जा सकता है. Throughput के स्तर की वजह से, परख और अधिक थकाऊ पारंपरिक नकारात्मक geotaxis के परख की तुलना में स्क्रीन के लिए अनुकूल है. इसके अलावा, Garagano एट अल (2005) एक कम्प्यूटरीकृत स्कोरिंग विधि का वर्णन है कि अगर आगे throughput बढ़ाने के लिए कार्यरत है. इस परख के लिए प्राथमिक विचार कर रहे हैं कि यह जरूरी है कि मक्खियों परीक्षण पहले संवेदनाहृत, नहीं कर रहे हैं और परीक्षणों के एक सेट के बाद दिया है कि ताजा शीशियों मक्खियों का एक नया बैच का परीक्षण कर रहे हैं पहले इस्तेमाल किया जाता है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

हम के लार्वा रेंगने डेटा पैदा करने के लिए आस्था Maltare धन्यवाद देना चाहूंगा. हम डॉ. निकोलस लांसन जूनियर पांडुलिपि पर अपनी टिप्पणी देने के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के जॉन्स हॉपकिन्स पर रॉबर्ट ए एल एस के लिए पैकार्ड केंद्र (UBP के लिए) और Amyotrophic पार्श्व स्केलेरोसिस एसोसिएशन (UBP) द्वारा समर्थित किया गया था, और मानसिक स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (CDN) से R01MH083689.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Agarose Invitrogen 16500-500
6 oz Drosophila bottle Genesee Scientific 32-130
Paint Brush (#1) Ted Pella, Inc. 11859
Cornmeal Fisher Scientific NC9109741
Agar Genesee Scientific 66-104
Molasses Fisher Scientific NC9349176
Propionic acid Acros Organics 14930-0010
Tegosept Apex 20-258
Ethanol Fisher Scientific BP2818-4
Yeast Genesee Scientific 62-107

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References

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Comments

4 Comments

  1. Thank you for sharing so wonderful video!
    I'm also working on drosophila. I just started to do some research on the mating behavior. I just wondered where to buy the courtship chamber shown in your video?

    Reply
    Posted by: 钰旻
    February 26, 2014 - 2:28 PM
  2. We had the courtship chambers made here locally in our university's shop facilities. You would need a 1 cm thick piece of plexiglass or plastic, bore holes of the correct diameter into it half way, and a second piece of ~2 mm thick clear plexiglass or plastic to cover (and one little holes in it to transfer the flies through to the chambers). We have some that are round with several chambers, and some with only 4 chambers that are square so we can fit four chambers simultaneously in a single field of a microscope for video recording.

    Reply
    Posted by: Charles D N.
    February 26, 2014 - 2:48 PM
  3. Can I order them for my lab from the internet?

    Reply
    Posted by: 钰旻
    February 26, 2014 - 5:16 PM
  4. Hi. I am a high school research student looking to gauge Drosophila locomotor activity through use of the Rapid Iterative Negative Geotaxis (RING) Protocol. Are there any important considerations for designing the physical RING apparatus? I am currently interested in simply utilizing an apparatus constructed from hot glued Elmer’s Foam Boards? Thank you.

    Reply
    Posted by: Sam M.
    April 14, 2015 - 9:12 PM

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