הכנת פרוסות Parasagittal לחקירת ארגון הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי מכרסמים entorhinal

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אנו מתארים הליכי הכנה הקלטה אלקטרו מן פרוסות המוח השומרים על הציר הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי entorhinal (MEC). בגלל קידוד עצבי של מיקום כדלקמן הארגון הגב, הגחון בתוך MEC, נהלים אלה להקל על החקירה של מנגנונים תאיים חשובים לניווט וזיכרון.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Pastoll, H., White, M., Nolan, M. Preparation of Parasagittal Slices for the Investigation of Dorsal-ventral Organization of the Rodent Medial Entorhinal Cortex. J. Vis. Exp. (61), e3802, doi:10.3791/3802 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

חישוב במוח מתבסס על הנוירונים ותגובה הולמת לכניסות הסינפטיים שלהם. נוירונים נבדלים המשלים שלהם והפצה של יון ערוצי קרום שקובעים איך הם מגיבים תשומות סינפטיים. עם זאת, הקשר בין מאפיינים אלה סלולריים תפקוד עצבי של התנהגות בעלי החיים אינה מובנת היטב. גישה אחת לבעיה זו הוא לחקור מעגלים עצביים המאורגנים טופוגרפית שבה עמדת מפות נוירונים בודדים על גבי המידע שהם לקודד או חישובים שהם נושאים את 1. ניסויים בגישה זו מצביעים על עקרונות כוונון של תגובות סינפטיים שבבסיס קידוד המידע מעגלים חושיות קוגניטיביות 2,3.

ארגון טופוגרפי של ייצוגים מרחביים לאורך הציר הגבי-הגחוני של הקורטקס המדיאלי entorhinal (MEC) מספקת הזדמנות ליצור קשרים בין מנגנוני זמן מחשב הסלולר אניmportant על קוגניציה מרחבית. הנוירונים בשכבה השנייה של MEC מכרסם לקודד המיקום באמצעות הרשת, כמו ירי שדות 4-6. עבור נוירונים שנמצאו בעמדות הגב ב MEC המרחק בין שדות ירי בודדים היוצרים ברשת היא בסדר גודל של 30 ס"מ, ואילו נוירונים ב עמדות בהדרגה הגחון יותר מרחק זה עולה ל מ גדול מ 1. מספר מחקרים גילו תכונות הסלולר של הנוירונים בשכבה השנייה של MEC, שכמו המרווח בין שדות הרשת ירי, גם משתנים בהתאם למיקום שלהם הגבי-הגחון, טוען כי נכסים אלה הסלולר חשובים לצורך חישוב מרחבי 2,7-10.

כאן נתאר את הליכי הכנה הקלטה אלקטרו מן פרוסות המוח השומרים על מידת הגבי-הגחון החקירה המאפשר MEC של ארגון טופוגרפי של נכסים biophysical ו האנטומי של נוירונים MEC. עמדה הגב, הגחון של n מזוההeurons יחסית ציוני דרך אנטומיים קשה לקבוע במדויק עם פרוטוקולים המשתמשים פרוסות אופקיות של MEC 7,8,11,12, שכן קשה לקבוע נקודות התייחסות המיקום הגבי-הגחון המדויק של הפרוסה. הנהלים אנו מתארים לאפשר מדידה מדויקת ועקבית של מיקום של תאים שנרשמו לאורך הציר הגבי-הגחון של MEC, כמו גם להדמיה מולקולרית של הדרגתיים 2,10. הנהלים שפותחו לשימוש עם עכברים בוגרים (> 28 יום) ואת כבר מצליחים עם עכברים עד 1.5 שנים. עם התאמות ניתן לעשות בהם שימוש עם עכברים צעירים יותר או מינים מכרסמים אחרים. מערכת סטנדרטית של הכנה ומדידה יסייעו חקירה שיטתית של תכונות הסלולר microcircuit של אזור זה.

Protocol

1. פורסים Parasagittal הכנה

1.1 לנתח את אונות המוח

כל ניסויים בבעלי חיים צריך לבצע ביקורת אתית המקומי תקנות לאומיות. במקרה של הניסויים שתוארו כאן, עבודה מתאימה לבעלי החיים בממלכה המאוחדת (הליכים מדעיים) חוק 1986. אנו משתמשים באופן שגרתי פריקה צוואר הרחם ללא הרדמה כדי להרדים את העכבר לפני הסרת המוח. לחלופין העכבר יכול להיות מורדם סופני, אבל במקרה הזה זה עשוי להיות נחוץ כדי לקבוע אם הבחירה של הרדמה משפיע על תכונות עצביים.

הסר את המוח של העכבר ומיד מקום קר (4-8 מעלות) חיתוך מלאכותית הנוזל השדרתי (ACSF) (ראה לוח 1 עבור יצירות פתרון) מבעבע כדי הרוויה עם carbogen (95% מ 2, 5% CO 2).

לאחר למקסימום של שלוש דקות, להסיר בזהירות את המוח מ גאוטינג ACSF בעזרת מרית בעדינות ומניחים אותו בתנוחה זקופה (צד הגב כלפי מעלה) על נייר הסינון, כי כבר טבולה ACSF חיתוך (איור 1 א).

כדי להקל מדויק הרכבה של שתי מחציות המוח, להשתמש בסכין גילוח או אזמל כדי להסיר כמה שיותר המוח הקטן ככל האפשר מבלי להשפיע MEC (הממוקם הקיצוני הזנב של המוח הגדול) ולהסיר את 3 מקורי של המוח על ידי חתך במישור העטרה (1B איור).

Hemisect המוח, מטפלת, כי בסעיף זה בדיוק במישור האנכי של קו האמצע (איור 1 ג).

להחזיר את ההמיספרות כדי ACSF חיתוך מבעבע אחד וחצי דקות.

1.2 הר ההמיספרות על vibratome

לפני ההרכבה, להבטיח את חוד החנית של להב vibratome הוא בזווית של 20 מעלות אופקי (

טיפול כדי למזער את ההשפעה הפיזית, הסר כל חצי הכדור מ ACSF חיתוך עם מרית ואת המיקום, כך פני השטח המדיאלי שלה נשענת על מרית וההיקף הגב שלה פונה לכיוון הלהב microtome. החלק בעדינות בכל חצי הכדור על הרצועה של דבק מגע, מקפיד להבטיח את פני השטח המדיאלי של האונה כל מקבילה לבסיס microtome. מצאנו כי עבור התוצאות הטובות ביותר לפני השטח הגבי של האונה כל צריך להיות במקביל ולהתמודד עם להב vibratome (1D איור).

1.3 אחזקת הכנה במהלך חיתוך

בעקבות גובר מיד להטביע את ההמיספרות של חיתוך ACSF קר (4 - 8 ° C). לשמור על temperaturE ו carbogen הרוויה לאורך ההליך חיתוך. אם הקירור מבעבע ישיר של הפתרון בחדר חיתוך אינה מעשית, מעת לעת לחדש את הפתרון ACSF חיתוך בתא מקורר עם פתרון ו מבעבע טרי.

1.4 סעיפים גזור

שימוש vibratome, להסיר קליפה משני חצאי במישור sagittal עד שתזהה את מידת ביותר לרוחב של MEC (בדרך כלל ~ 1 מ"מ מן השטח לרוחב) (איור 1F).

בין הקיצוצים להרים את הלהב vibratome עד ~ 200 מיקרומטר, כדי למנוע גרירת להב חזרה שוב לפגוע ברקמת חשוף. במקביל חותכים סעיפים 400 מיקרומטר parasagittal מן האונות הן (אם הם עומדים בשורה, כפי שמוצג באיור 1D הם גם להיחתך בעת ובעונה אחת) עד כמה המדיאלי של MEC הוא הגיע. זה יכול להיות מזוהה על ידי היעדרות של הלהקה לבן עבה בעיקול ventro-הזנב של Tהוא ההיפוקמפוס (כמוסה חיצוני), צורה לא קמורה של הגבול מקורי שלה זוויתי dorso-הזנב "בפינה". איור 1E מדגימה את המראה העגול של ההיפוקמפוס במישור parasagittal לרוחב כדי MEC. דמויות 1F-G להמחיש כמה חלקים בתוך MEC מופיעים לרוחב-המדיאלי עמדות שונות כאשר חיתוך. הערה בהדרגה יותר שעועית בצורת הופעתו של ההיפוקמפוס על עמדות המדיאלי יותר. האונה כל מניב בדרך כלל שתיים או שלוש פרוסות עבות 400 מיקרומטר המכילות MEC.

1.5 פרוסות דגירה

לאחר קיצוץ זה מיד להניח את הפרוסות carbogen רווי תקן ACSF שמרו באמבט מים 35 ° C. אפשר פרוסות כדי לדגור על 35 מעלות צלזיוס למשך כ 15 דקות ACSF לאחר חיתוך הושלמה.

הסר את מחזיק נתח מן האמבטיה במים ולהמשיך מבעבע עם carbogen בטמפרטורת החדר למשך lמזרחית 45 דקות.

2. Parasagittal דוגמה Slice ניסוי

ניסוי טיפוסי שימוש בתכשיר היא להפוך את הקלטות אלקטרו מתאי stellate בשכבה השנייה של MEC.

2.1 מטב אופטיקה

לפני ההקלטה, להבטיח כי הקבל בפוקוס על המטוס פרוסה (קוהלר תאורה), והוא מרוכז בהגדלה גבוהה (למשל 40X) אובייקטיבית.

2.2 לזהות תאים בעלי עניין

שימוש בהגדלה נמוכה (למשל 4x) המטרה לזהות באזור הקלטה משוער בתוך MEC (איור 2 א ', ב'). מעבר למטרה בהגדלה גבוהה כדי לזהות תאים קיימא בתוך האזור (איור 2 ג, ד).

כדוגמה, המשוערים שכבה II של תאים stellate מזוהים עם diame ראייה דומה על ידי הצורה polygonal או הביצה שלהם דנדריטים העיקריים מרוביםter, והיעדר בקוטר גדול אחד הפסגה דנדריט 2,13,14. הם מזוהים באופן מהימן על קצה הגבול שכבה I / II, היכן הם נמצאים בשפע ולעיתים קרובות מופיעים בקבוצות קטנות 2,9 (איור 2 ג, ד). סוגי תאים אחרים, כמו interneurons תאים פירמידליים צריך להיות גם לזיהוי.

בשלב זה הניסוי יכול להתבצע, למשל באמצעות כל תא תיקון, מלחציים להקליט פוטנציאל ממברנה או קרום הנוכחי של נוירונים שזוהו, ושיטות חשמל או optogenetic להפעיל תשומות הסינפטי לנוירון מוקלט. נוירון זהות ניתן לאמת מתוך המאפיינים אלקטרו של נוירון הוקלט על ידי כולל תוויות ניאון בתוך פתרון תאיים.

3. למדוד את מיקום לאורך ציר Dorso-הגחון

3.1 תמונה המיקום של עניין פרוסת שמסביב

כדי לקבוע את המיקום של recorנוירון ded לאורך הציר הגבי-הגחון, 1 משתמש המטרה בהגדלה נמוכה לתמונה באזור MEC של הפרוסה והסביבה. לסמן את המיקום של עניין על ידי, למשל, כולל אלקטרודה הקלטה בתמונה (איור 3 א) או על ידי פורש הסרעפת איריס שדה לעזוב עיגול בוהק סביב מיקומו של עניין תמונת כפול. כדי לאתר את המיקום הקלטה בתוך תמונה כפול אז יכול להיות על גבי התמונה הראשונית של המיקום ההקלטה וסביבתו (איור 3 ב). עד הגדלה 3 נמוכה נפרד (4x) תמונות שיידרש כדי לכסות את השטח ממיקום ההקלטה הגחון לגבול הגב של MEC. התמונות האלה אז יכול להיות מאוחה באמצעות תמונה מניפולציה תוכנה לספק תמונה מדידות מרחק ניתן לקחת (איור 3). אימות נוסף של זהות נוירון ומיקום ניתן לבצע לאחר ההקלטה על ידי הכללתסמנים לא פעילים כגון צבעים biocytin או Alexa בתוך פתרון תאיים ולאחר מכן באמצעות עיבוד מתאים של רקמות לאחר הקלטת 2.

3.2 קבע את הגבול הגב של MEC

הגבול הגב של MEC מספק נקודת ציון נוחה ממנו למדוד את הגב, הגחון עמדה. הגבול הגחון של MEC לא מוגדר היטב.

איור 4 מדגים כיצד ציוני דרך הסלולר MEC שהוגדרו פרוסות מוכתמים Nissl ב-המדיאלי לרוחב בתפקידים שונים מופיעים תחת תאורה DIC.

איור 4 מראה את ההיפוקמפוס עגול (איור 4 (i)) וחוסר בליטה parasubicular לתוך שכבה I (איור 4 (ד)) קשורה פרוסות parasagittal המכילים Cortex entorhinal לרוחב (LEC).

איור 4 לפנה"ס להראות פרוסות טיפוסי המכילים MEג החלק הגבי של האזור הכהה הבולט entorhinal / Parasubicular הגב הגבול בין פרוסות מוארים הקית"ם מכיל שטח של parasubiculum. אזור parasubiculum מתגלה בבירור מכתים Nissl בתמונות המתאימים בעמודה (iii). הגבול הגב של (חיצים שחורים 4B ועמודה 4C (ד)) MEC הוא הגחון לקבוצה של תאים parasubicular הבולטת הרחק אל תוך שכבה I (חיצים אדומים 4B ועמודה 4C (ד)).

להשוות את נתוני 4 ב ועמודות 4C (ב ') וכן (iii) מראה כי הגבול הגב של MEC בסעיפים Nissl מקבילה למקום אשר הגחון עד קצה הגב האזור entorhinal / Parasubicular כהה הגבול ב פרוסה (DIC חיצים שחורים). המיקום של הגבול ניתן להעריך מתמונות הקית"ם והשוואה תמונות התייחסות (ראה גם השופט. 14). אימות העתיד של הגבול MEC הגב עם סמנים מולקולריים יהיה לשפר את הדיוק של אומדן זה. נציין thaלא מוכתם סעיפים הפניה ולאחר קטעים מעובדים זיהוי מורפולוגי של נוירונים שכותרתו, עשוי להיות כפוף התכווצות ניכרת. השוואה בין מרחקים אבסולוטיים ביחס ציוני דרך ב DIC וחתכים התייחסות ולכן 1 דורש מדידה תיקון הצטמקות (ראה למשל נ"צ 2).

3.3 כיול ולמדוד מרחקים

כדי להקל על מדידה של מרחק קל בתמונות, השתמש המטרה אותה בהגדלה נמוכה לדימוי רשת התייחסות להקים פיקסל: יחס ההמרה המרחק. למדוד את המרחק פיקסל מהגבול הגב של MEC למיקום של עניין לאורך קווי המתאר של MEC באמצעות תוכנית גרפיקה ולהמיר המרחק פיקסל למרחק של מיקרומטר (5 א 'איור). אם הנוירונים מלאים סמן כגון biocytin, אז מיקומו של תא עצב רשמה אז יכול גם להיות התאושש על ידי עיבוד מתאים (ראה למשל נ"צ 2).

4. Representative תוצאות

איור 5 א מציג דוגמה בהגדלה נמוכה (4x) תמונה מורכבת של פרוסת parasagittal לאחר ההקלטה, עם המיקומים של נוירונים רשמה ומדריכים מדידה על גבי זו. הקלטות של התאים המסומנים stellate הגב ועל הגחון מוצגים איור 5 ב. הקלטות אלה מסייעים לקבוע את זהות התאים להמחיש עד כמה התכונות החשמליות של MEC שכבת תאים השנייה stellate שונים במקומות הגב ועל הגחון.

איור 1
באיור 1. הכנת פרוסות parasagittal. המוח כולו מונח בצד הגב כלפי מעלה על גבי נייר פילטר טבולה חיתוך ACSF. ב ' C. Hemisected מוכן גובר. רכוב D ההמיספרות על רצועת דבק במקביל חיתוך קצה הלהב vibratome לפני השקיעה בחיתוך ACSF וחותך. E מראה סעיף המכיל הבקר במהלך מראה חיתוך ההליך לאחר הסרה של רקמת לרוחב ולא המדיאלי עדיין מספיק בשביל פרוסת תקן MEC parasagittal. F של חלק "לרוחב" של MEC לאחר הסרת נוספים 400 מיקרומטר של רקמות (לפני השטח הוא 400 מיקרומטר המדיאלי לזה המוצג . (F)) מראה G של חלק "מדיאלי" של MEC אחרי פרוסה 400 מיקרומטר parasagittal נחתך schematics היי של EF בהתאמה המצביעים על ציוני דרך אנטומיים, c:., L המוח הקטן: לרוחב entorhinal קליפת המוח (LEC), מ ': התיכוניים entorhinal Cortex (MEC), שעות: ההיפוקמפוס, תפוז: כמוסה חיצוני, כחול: כפיס המוח, ציאן: gyrus משוננת, גרםeen: CA3 & CA1. המראה של הגבול מקורי של ההיפוקמפוס של פרוסות המכילים הבקר הוא קעור (חץ שחור H) ואילו פרוסות המכילות רק MEC, הגבול יכול להיות ליניארי (חץ אדום אני) או קעור (חץ אדום J). צורות המשוער של ציוני דרך אנטומיים צבעוניים התקבלו את ההסברים של המוח אלן אטלס ( http://mouse.brain-map.org/atlas/ARA/Sagittal/browser.html ).

איור 2
איור 2. זיהוי MEC שכבת תאים השנייה תחת תאורה DIC. תמונה לדוגמא שילוב של סעיף המוח פרוסה sagittal בהגדלה נמוכה (4x). תמונות נפרדות כבר בציר מעורבב להסיר קצוות מסיח vignetting. ציון דרך חשוב H תחומים:, ההיפוקמפוס מ ':. MEC יבול ב' מן התמונה בהגדלה נמוכה הפרט (4x) המכילה שכבה II של MEC, הנראה כמו פס אנכי חשוך ליד קצה יד ימין C MEC שכבה II בהגדלה גבוהה (. ) 40X עם תאורה DIC. התמונה הוא מורכב בציר מעורבב של מספר תמונות. צפוף המרכזי "טור" של תאים היא שכבה II. D הגדלה חד תמונה גבוהה DIC מראה קבוצה של תאים בריאים stellate ו interneurons המשוערים בשכבה II. כפי שניתן לראות כאן, stellate תאים מתרחשות בקבוצות על גבול שכבת I / II. תאים פירמידליים נוטים להימצא קרוב יותר לגבול שכבה II / III. את קווי המתאר המנוקדים ב AC לציין את מידת BD בהתאמה. ברים בקנה מידה: ב A ו-B 500 מיקרומטר, ב-C ו-D 100 מיקרומטר.

איור 3 "src =" / files/ftp_upload/3802/3802fig3.jpg "/>
איור 3. מדידת מיקום הגב, הגחון של מקומות בעלי עניין. בהגדלה נמוכה מיושר (4x) תמונות הכוללות במידה כולו dorso-הגחון של MEC בין המיקום של עניין (מסומן על ידי קצה האלקטרודה הקלטה) ואת האזור חשוך entorhinal / Parasubicular הגבול ציון (לצורך הקמת הגבול הגב של MEC - ראה איור 4) B כמו בתמונה אבל כולל עם גבי עצר את השדה הסרעפת איריס (ועליהן אטימות מופחת) במקום אלקטרודה הקלטה כדי לסמן את המיקום של עניין..

איור 4
באיור 4. הערכת הגבול הגב של MEC מתמונות הקית"ם של פרוסות parasagittal. מתח AC סעיפים Parasagittal (לרוחב המדיאלי) של קליפת המוח entorhinal. סעיפים הקית"ם ו Nissl הם מן מיקרופון אחרדואר עמודה AC (אני):.. פרוסות parasagittal כולו (400 מיקרומטר עבה) (בציר מרוכבים מעורבב של ההגדלה (4x) תמונות נמוך) עמודה AC (ב): תקריב של קליפת entorhinal עם האזור מאפיין entorhinal / Parasubicular כהה הגבול ב באזור העליון של כל תמונה. AC (ג) טור פרוסות Nissl מוכתמים (40 מיקרומטר עובי) של העכבר אחר מתואם עם תמונות AC (ב '). כהה יותר, שכבה צפופה של תאים היא השכבה השנייה. השוואת עמודות (II) (III) מראה כיצד תאים מוכתמים Nissl מופיעות תמונות הקית"ם עמודה AC (iv). פרט פרוסות מוכתמים Nissl. בעמודה B ו-C (ד) כוללים תאים parasubiculum (החלק הגבי של האזור entorhinal / Parasubicular כהה הגבול בתמונות DIC) ותאים של MEC הגב. ב '(ד) ו-C (ד) את התיקון הגבי גדול של תאים parasubicular המרחיבה עמוק לתוך שכבת אני גלוי בקלות (חיצים אדומים). קצה הגחון של תיקונים אלה מתאים בו הגביrder של MEC (חיצים שחורים). ב (ד) תיקון parasubicular התאור, המציין כי פרוסה לרוחב הוא גם להכנת פרוסה parasagittal תקן MEC. לוחות כל החצים מצביעים שחורים הגבול הגב של MEC. החצים מצביעים על גריי הגבול הגחון המשוער של MEC.

איור 5
איור 5. נציג תוצאות. חלק מעורבב קצוץ של התמונה באיור 3. העמדות של תא הגב ואת תא הגחון מסומנים בכחול עיגולים ירוקים מילאו בהתאמה. החץ השחור מסמן את הגבול הגב מוערך של MEC, והוא נמשך גם אל תוך השכבות העמוקות של הקו המקווקו לבן. קו לבן מוצק הוא מדריך המראה את נתיב מתאר שלאורכו פיקסל מדידה של מרחק מהגבול הגב של MEC לתא ממוקם ventrally נלקח. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר B אלקטרו.עקבות הפיזיולוגיות של תאים שאליהם נרשם א 'משמאל לימין - תגובות התת עד השלבים הנוכחיים המשמשים לחישוב התנגדות קלט, תוקעים בתגובה צעד גדול הנוכחי חיובית, פרט ספייק.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי להקל על החקירה של נכסים MEC מעגלים הבאים הארגון הגב, הגחון שתיארנו כאן בפירוט תהליך ייצור הכנת פרוסת parasagittal שמשמר את מידת הגבי-הגחון של MEC.

צעדים קריטיים

הסרת המוח של החיה. לטפל בפרט, כדי למנוע הפעלת לחץ על המוח. זה חשוב יותר להסרה מהירה של המוח.

חיתוך. Slice יש מודבקים היטב לרצפה של החדר מחזיק. Vibratome צריך Z-ציר <רטט 2 מיקרומטר ויש להשתמש בהם עם אמפליטודה גבוהה הגדרות למהירות נמוכה. הגדרות אופטימליות יכולים להיות שונים בין הדגמים ויש שהוקמה על ידי ניסוי וטעייה.

מעקב אחר הטמפרטורות פתרון. אנו מוצאים כי איכות פרוסת רגישה לטמפרטורה במהלך ואחרי חיתוך. Outsid דואר הטמפרטורה המומלצת נע מספר הנוירונים בריאים מצטמצם, הנוירונים יכול להיות קשה יותר תיקון ותגובות קלט סינפטי יכול להיות מופחת.

הדמיה. תאורה קוהלר ו מרכוז של הסרעפת בתחום איריס חשובים ויזואליזציה של תאים לפני ההקלטה.

פתרון בעיות

פרוסות מכילים תאים בריאים בלבד. החלף פתרונות. בדוק Z-ציר תזוזה על vibratome. יש לבדוק את הטמפרטורה של פתרונות. יש לבדוק את הכיוון של פרוסת כאשר חיתוך.

נוירונים פרוסת קשה לראות. בדוק תאורה קוהלר מוגדר כהלכה. יש לבדוק את עדשות המיקרוסקופ נקיים.

Gigaseals קושי להרכיב. בדוק את הצורה של אלקטרודות הקלטה. בחן את פרוסת סימנים של מוות של תאים, כגון צורות תאים עגולים, או תאים בעלי ניגודיות גבוהה.

"ve_content> תמונות של הפרוסה קשה ליישר. ודא פרוסות נמצאים במוקד ללכוד בפירוט מרבי. עבור יישור התמונה אוטומטית> חפיפה תמונה 40% הוא בדרך כלל מספיק.

מגבלות

מגבלה אחת פוטנציאל של הכנת פרוסת parasagittal היא כי קשרים ארוכי טווח מאוד סינפטיים בתוך MEC לא יכול להריץ במקביל ישירות אל המטוס parasagittal 9, 15 ולכן לא יישמר. שמירה על קשרים אלה עשויים לדרוש שינוי הליך הכנת לשנות את זווית פרוסה לחתוך או על ידי hemisecting או הרכבה ההמיספרות של המוח על vibratome בזווית במישור מקורי, הזנב. שיקולים דומים עשויים לחול לשימור קשרים אחרים, לדוגמה מביא כניסות מ מחצה המדיאלי.

בהשוואה אופקיים ההכנות פרוסה MEC

  1. מדידה מדויקת של מיקום הגב, הגחון חשובלהקמת מערכות יחסים כמותיים בין העמדה יחד על הציר הגבי-הגחון תכונות פיזיולוגיות. בהכנות פרוסה אופקיים 7,8,11,12 קשה לקבוע את המיקום המדויק הגב, הגחון של חתך וזה מסבך הקמת המיקום התייחסות עקבית. לעומת זאת, בהכנת פרוסה parasagittal הגבול הגב של MEC קל להקים גם נקודת התייחסות וידע מעמיק של נוירון ב פרוסה אין צורך למדוד את עמדת הגב, הגחון שלה. פרוסות Parasagittal ולכן מאוד להקל מדידה מדויקת של מיקום הגב, הגחון, המאפשר בדיקה מהירה ומדויקת של יחסים כמותיים בין מיקום הגב, הגחון ומאפיינים הסלולר מעגל.
  2. הדרגתיים מולקולרית חשובים לארגון מעגל הטופוגרפי ב MEC ויכול להיות דמיינו שימוש בטכניקות תיוג הקרינה או אחר. בהשוואה פרוסות אופקיות, בהם ההאות e יהיה צורך בהשוואה בין פרוסות על הגב, הגחון במקומות שונים, הכנת parasagittal מאפשר ראיה, קל יותר מדויקת ואמינה יותר וכימות של הגב, הגחון הדרגתיים מולקולרית.
  3. . הגב-הגחון הדרגתיים של קישוריות סינפטי עשויים לשחק תפקיד חשוב בתפקוד MEC. הכנת פרוסת parasagittal יכול לשמור על קשרים סינפטיים בין אזורים הגב ועל הגחון בתוך MEC, שהוא חשוב חוקרת כיצד חיבורים שונים בתוך ובין במקומות שונים לאורך הציר הגבי-הגחון של MEC ועל שמירה על שלמות המעגל באותה מידה שונה הגבי-הגחון מקומות. אם קישוריות משתנה באופן משמעותי לאורך הציר הגבי-הגחון, פרוסות אופקיות נוטים פחות שווה כוללים microcircuits פונקציונליים שלמים בכל אחד קיצוני.

התפתחויות עתידיות ויישומים

ידיעת הגורמים המולקולרייםהזהות הסלולר MEC יאפשר אפיון סופי של זהות העצבית ולאפשר קביעה מדויקת יותר של מיקום הגב, הגחון.

באמצעות הכנת פרוסת parasagittal, תגובות המאורגנים טופוגרפית של סוג הפעילות של התא מיקום ספציפי של נוירונים מרובים יכול להיבחן בו זמנית (למשל באמצעות צבעים רגישים מתח או הדמיה סידן) בתוך פרוסה אחת.

בשילוב עם כלי optogenetic, הכנת parasagittal מאפשר הפעלה סלקטיבית של עמדות שונות לאורך הציר הגבי-הגחון. לשאול איך microcircuitry על הגב, הגחון במקומות שונים מגיב ההפעלה ממוקד מרחבית יכול לספק תובנות חשובות פונקציה microcircuit MEC.

אנו צופים כי לקראת זה יספק בסיס פשוט, חזק ואחיד על חקירת הגב, הגחון הדרגתיים של תכונות פיזיולוגיות להקלהבנה של האופן שבו הדרגתיים אלה לתרום את מאפייני עיבוד המידע של MEC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין מה לחשוף.

Acknowledgements

אנחנו מודים הבאים על תמיכתם: חבר העמים ועדת מלגות בבריטניה מימון (HP), EPSRC (HP), BBSRC (MFN) והאיחוד האירופי מארי קירי פעולות (MFN).

References

  1. O'Donnell, C., Nolan, M. F. Tuning of synaptic responses: an organizing principle for optimization of neural circuits. Trends Neurosci. 34, 51-60 (2011).
  2. Garden, D. L. F., Dodson, P. D., O'Donnell, C., White, M. D., Nolan, M. F. Tuning of synaptic integration in the medial entorhinal cortex to the organization of grid cell firing fields. Neuron. 60, 875-889 (2008).
  3. Kuba, H., Yamada, R., Fukui, I., Ohmori, H. Tonotopic specialization of auditory coincidence detection in nucleus laminaris of the chick. Journal of Neuroscience. 25, 1924-1934 (2005).
  4. Hafting, T., Fyhn, M., Molden, S., Moser, M. -B., Moser, E. I. Microstructure of a spatial map in the entorhinal cortex. Nature. 436, 801-806 (2005).
  5. Sargolini, F. Conjunctive representation of position, direction, and velocity in entorhinal cortex. Science. 312, 758-762 (2006).
  6. Fyhn, M., Hafting, T., Witter, M. P., Moser, E. I., Moser, M. -B. Grid cells in mice. Hippocampus. 18, 1230-1238 (2008).
  7. Giocomo, L. M., Zilli, E. A., Fransén, E., Hasselmo, M. E. Temporal frequency of subthreshold oscillations scales with entorhinal grid cell field spacing. Science. 315, 1719-1722 (2007).
  8. Giocomo, L. M., Hasselmo, M. E. Time constants of h current in layer II stellate cells differ along the dorsal to ventral axis of medial entorhinal cortex. Journal of Neuroscience. 28, 9414-9425 (2008).
  9. Burgalossi, A. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70, 773-786 (2011).
  10. Dodson, P. D., Pastoll, H., Nolan, M. F. Dorsal-ventral organization of theta-like activity intrinsic to entorhinal stellate neurons is mediated by differences in stochastic current fluctuations. J. Physiol. (Lond). 589, 2993-3008 (2011).
  11. Nolan, M., Dudman, J., Dodson, P., Santoro, B. HCN1 channels control resting and active integrative properties of stellate cells from layer II of the entorhinal cortex. Journal of Neuroscience. 27, (2007).
  12. Boehlen, A., Heinemann, U., Erchova, I. The range of intrinsic frequencies represented by medial entorhinal cortex stellate cells extends with age. Journal of Neuroscience. 30, 4585-4589 (2010).
  13. Klink, R., Alonso, A. Morphological characteristics of layer II projection neurons in the rat medial entorhinal cortex. Hippocampus. 7, 571-583 (1997).
  14. van Groen, T. Entorhinal cortex of the mouse: cytoarchitectonical organization. Hippocampus. 11, 397-407 (2001).
  15. Dolorfo, C. L., Amaral, D. G. Entorhinal cortex of the rat: organization of intrinsic connections. The Journal of Comparative Neurology. 398, 49-82 (1998).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics