に対する抗生物質の有効性をテストするための人工痰培地の使用

Immunology and Infection
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Summary

現在の診断抗菌薬感受性試験では、栄養豊富な、好気的条件下での分離株のプランクトンの成長に依存しています。ここでは、嚢胞性線維症の肺のより代表的な好気性および微好気性条件の両方の下で緑膿菌バイオフィルムの抗菌薬感受性を検討する別の人工痰媒体を採用しています。

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Kirchner, S., Fothergill, J. L., Wright, E. A., James, C. E., Mowat, E., Winstanley, C. Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung. J. Vis. Exp. (64), e3857, doi:10.3791/3857 (2012).

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Abstract

Pの分離株に適用した場合にin vitroで抗菌薬感受性試験の関連性についての懸念が高まっている嚢胞性線維症(CF)患者から緑膿菌 。既存の方法は好気的及びplanktonically成長した単一または少数の単離に依存しています。所定のカットオフは、細菌が敏感であるか、または任意の抗生物質を1に耐性があるかどうかを定義するために使用されます。しかし、CF、P.の慢性肺感染症の中に緑膿菌の集団は、バイオフィルム内に存在し、環境が2大部分は好気性であるという証拠があります。診断テスト中に肺の中の細菌とそれらの間に条件の厳しい違いは、信頼性、さらにはこれらのテスト3の妥当性に疑問を呼びかけている。

人工痰媒体(ASM)は、アミノ酸、ムチンと遊離DNAを含む、CF患者の痰の成分を含有する培養培地である。P.緑膿菌<自己凝集バイオフィルムの構造と人口発散4,5,6の形成とCFの感染時にASMを模倣し成長に/ em>に成長。本研究の目的は、Pの抗菌薬感受性を検討するためのマイクロタイタープレートアッセイを開発することでした緑膿菌は、微好気性、好気条件の両方に適用可能であるASM、成長に基づいています。

ASMアッセイは、マイクロタイタープレート形式で開発されました。P.は、緑膿菌のバイオフィルムは、24時間ごとに異なる濃度で前の抗菌剤とのインキュベーションの3日間用に開発させた。バイオフィルムの破壊後、細胞生存率はレサズリンで染色することによって測定した。このアッセイは、15種類のPのトブラマイシンの付着細胞の最小発育阻止濃度(SMIC)を確認するために使用された好気性および微好気条件とSMICの値の下で緑膿菌分離株は、標準的な培養液成長で得られたものと比較した。があったしながら、それらのプランクトンと比較すると、ASMで育った菌株の増加MIC値のいくつかの証拠が、最大の違いは、ASM、システム内のトブラマイシンに向かって> 128倍に多くの抵抗の増加を示した微好気性条件でテスト細菌で見つかったとき好気的条件下で行われたアッセイと比較されます。

現在の感受性試験の方法と臨床転帰の間に関連性の欠如は、3つの現在の方法の妥当性を疑問視しています。 in vitroモデルのいくつかは、P.を研究するために以前に使用されている緑膿菌バイオフィルム7、8。 ASMバイオフィルムは、CFの肺9で観察されたもの似ているのに対し、しかしながら、これらの方法は、表面に接続されたバイオフィルムに依存しています。さらに、粘液の減少酸素濃度は、Pの動作を変更することが示されている緑膿菌 2および10抗生物質感受性に影響を与えます。したがって、ボイジャー微好気条件下でのG ASMは、抗菌薬感受性を勉強するのより現実的な環境を提供することがあります。

Protocol

1。人工喀痰中(ASM)の調製

  1. 数時間の期間にわたって非常にゆっくりと魚の精子から250 mlの滅菌水に4gのDNAを追加します。 DNAが完全に溶解し、室温で一晩撹拌することができますいくつかの時間を要します。
  2. ムチンは、完全に溶解するまで250ミリリットルの滅菌水に徐々に豚の胃(タイプII)から5グラムのムチンを追加します。溶液は4℃で一晩攪拌することができ℃の
  3. 100ミリリットルの滅菌水に、L-チロシンとL-システインを除いて、それぞれの本質的な、非本質的なL-アミノ酸の0.25グラムを溶かす。 0.5 M水酸化カリウムの25ミリリットル(M rを 56.11グラム/モル)および25 mlの滅菌水にL-チロシンの0.25グラムのL-システインの0.25グラムを溶かす。
  4. 5.9 mgのジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、滅菌水100ml中の塩化カリウム5gのNaClと2.2グラムを溶かす。
  5. 1リットル瓶の中にDNA、ムチン、L-アミノ酸、DTPA、NaClおよびKClを兼ね備えています。
  6. 卵黄eの5ミリリットルを追加します。mulsionと滅菌水で約850ミリリットルに記入してください。
  7. 1 Mトリス(pHは8.5であり、M R 121.14)で6.9にpHを調整し、滅菌水で1リットルにボリュームをもたらします。
  8. それぞれ、0.22μmと45ミリメートルの細孔と首のサイズを持つVacuubrand ME 2ダイヤフラム真空ポンプとミリポアSteritopフィルターユニットを用いてろ過してASMを殺菌。各Steritopフィルターユニットは、3回すぐに再使用できますが、フィルターは再使用前に滅菌水で2回リンスする必要があります。ろ過処理は低速であり、2日間にわたって行うことができます。 ASMの他のバージョンではなく可能な薬物相互作用のためにろ過しかし11日の抗生物質の添加を使用することを開発されている、我々は、この特定のアプリケーションのための方法をお勧めしません。
  9. フィルタされていないとASMのフィルタは、暗闇の中で4℃で保存する必要があります。新鮮なASMを使用すると、しかし、それは1月の最大のためにこれらの条件の下で維持することができることをお勧めします。

    2。プランクトン付着細胞の代謝最小発育阻止濃度(PSMIC)の決定

    1. 15 planktonically成長Pの最小の代謝阻害濃度(PSMIC)の値を決定するために、抗菌化学療法BSAC 12英国の学会のガイドラインで説明したように緑膿菌分離株は、微量液体希釈法は、実行する必要があります。この場合、トブラマイシン硫酸の選択の抗生物質は、連続的に抗生物質の濃度の適切な範囲を提供するために、96ウェルマイクロタイタープレートにルリア - ベルターニ(LB)培地中で希釈されています。
    2. Pの一晩培養物を希釈する0.05のOD 600にLBで緑膿菌 (±0.01)および連続希釈した抗生物質の100μlを含む96ウェルマイクロタイタープレートのウェルに100μlのボリュームを追加します。 0.5μg/ mlの - この場合には、トブラマイシン硫酸の最終濃度は、512との間であった。 8人がそれぞれのantibの複製されますiotic濃度を実行する必要があります。
    3. 各分離株のネガティブコントロールのウェルはなく抗生物質が追加されませんされている、設定する必要があります。また、8ウェルは、下流の解析(2.6節)の間に空白として使用するための唯一のLBを含める必要があります。
    4. (5%O 2、10%CO 2、85%N 2)好気性または微好気性条件下で振とうせずに37℃で2日- 1の96ウェルマイクロタイタープレートをインキュベートします。微好気条件は、大規模な嫌気ジャーにCampyGenガス発生パックを使用して取得されます。
    5. インキュベーション後、細菌の増殖はFluostarオメガマイクロプレートリーダーとMARSデータ解析ソフトウェアを用いて波長600nmにおける各ウエルの細菌培養物の吸光度を測定することによって決定される。
    6. 抗生物質で処理したプランクトンの培養( 抗生物質処理された浮遊細胞 )および陰性対照( ネガティブコントロール )からの吸収からの吸収は引くことによって修正する必要があります唯一の井戸を含むLB( 空白 )から得られたバックグラウンドの吸光度のイオン。生存率のパーセント阻害はその後×100%( 抗菌処理された浮遊細胞を意味する / ネガティブコントロールを意味する )として計算されます。 PSMIC 90は浮遊細菌の増殖を90%阻害を引き起こす抗生物質濃度として定義されています。
    7. 選択した抗生物質で処理した後に細菌の生存率を決定するために、0.02%、10μlの(v / v)のレサズリンは(蒸留水で希釈)を各ウェルに添加し、プレート1の好気的条件下でインキュベートされる - 37℃で2時間° C、150 rpmで振とうしながら。生細胞は、ピンクの蛍光レゾルフィンフォームに青レサズリン色素を減らすことができます。
    8. レサズリンとのインキュベーション後、各ウェルの540nmの励起波長とFluostarオメガマイクロプレートリーダーで590nmの発光波長を用いて蛍光を監視することができます。である説明したようにデータが分析されるべきである低い。

    3。バイオフィルム付着細胞の最小発育阻止濃度(BSMIC)の決定

    1. Pの一晩培養緑膿菌 (この場合は、 緑膿菌の15菌株が使用されます)新鮮なASM(総量1.8ミリリットル)で、さらに希釈1:100 0.05のOD 600(±0.01)にLB中で希釈されるべきである。
    2. 希釈した培養液(1.8 ml)を24ウェル組織培養処理プレートの各ウェルに追加する必要があります。 3つのウェルは、下流の解析時に空白(3.9節)として使用するためにASMを含める必要があります。
    3. 75 rpmで振とうしながら、37℃で好気的または微好気性条件下で3日間の実験パラフィルムとインキュベートし、24ウェルプレートを固定します。微好気条件は、大規模な嫌気ジャーでCampyGenガス発生パックを使用して取得する必要があります。
    4. 新鮮で適切な濃度範囲を提供するために、この場合、トブラマイシン硫酸では、選択の抗生物質を希釈ASM。 1μg/ mlの - この例では、最終濃度は、512との間であった。 24ウェルプレートの適切なウェルに、200μlの容量で、抗生物質の各濃度を追加します。 4人がそれぞれの抗生物質濃度を複製し実行する必要があります。選択の抗生物質にさらされていないバイオフィルムは、ネガティブコントロールとして用いた。
    5. 75 rpmで振とうしながら、37℃でさらに24時間好気性または微好気性条件下で実験パラフィルムとインキュベートし、24ウェルプレートを固定します。
    6. 選択した抗生物質の存在下でインキュベートした後、[NaOHで4.6に水とpHが9.6 g / lでCitrate.H 2 0] 100 mg / mlのセルラーゼ(0.05Mクエン酸緩衝液で希釈した100μlのを使用して、細菌のバイオフィルムを混乱させる1時間、150 rpmで振とうしながら)と、37℃で好気的条件下で24ウェルプレートをインキュベートします。必要に応じて、バイオフィルムは、さらに、この段階でマニュアルピペッティングによって破壊される可能性があります。
    7. 代謝活動を決定するために、破壊されたバイオフィルムから放出される細菌の細胞から、0.02%の100μl(V / V)はレサズリンは(蒸留水で希釈)を24ウェルプレートの各ウェルに添加されるべきであり、1時間インキュベート - 37°Cで2時間、150 rpmで振とうしながら。
    8. レサズリンとのインキュベーション後、各ウェルの540nmの励起波長とFluostarオメガマイクロプレートリーダーとMARSデータ解析ソフトウェアで590nmの発光波長を用いての蛍光を測定します。
    9. 抗生物質で処理したバイオフィルム(F 抗生物質処理のバイオフィルム )とネガティブコントロール(F ネガティブコントロール )からの蛍光からの蛍光は、ASM含むウェルから得られたバックグラウンド蛍光の減算(F 空白 )で修正する必要があります。生存率のパーセント阻害はその後×100%(F 抗生物質治療をバイオフィルムの意味/ F 負の制御を意 ​​味する )として計算されます。 BSMIC 90 antibioとして定義されていますチック濃度は代謝活性の90%阻害を引き起こす。

    4。代表的な結果

    ASMバイオフィルム形成(2 ml)を少量で可能であるバイオフィルムは、完全に3日間( 図1A)内に形成されています。これは厳密に中断することが困難でなければなりませんバイオフィルムを、ピペッティングにより実証することができます。 microcoloniesは、大きなボリューム4( 図1B)で増殖させたものと同等である。 図2電子顕微鏡画像解析によって検出されたplanktonicallyとバイオで増殖した細胞の主な相違点を示しています。バイオフィルムの文化は明らかにバイオフィルム内の細胞と個々の構造を取り囲む細胞外マトリックスのかなりのレベルが識別することが困難であるを示しています。

    いくつかの研究は、バイオフィルムのライフスタイルは、抗菌薬感受性13、14に影響与える可能性を示唆している。私たちの小さな規模のASMアッセイはdeteするために使用することができ同時に複数の分離株の複数の抗生物質のBSMICをrmine。アッセイのワークフローを図3に示します。細菌の細胞の生存における抗生物質の効果は、レサズリンアッセイを用いて測定することができます。抗生物質、この場合、トブラマイシンで、確立されたバイオフィルムを追加することができ、24時間インキュベートした。この後、バイオフィルムが破壊され、レサズリンが追加されます。

    代謝活性を有する細胞は、青色(レサズリン)からピンク(レゾルフィン)〜15色の変更を伴うレサズリン色素を減らすことができます。 図4Aは、どのP.例アッセイを示しています。 緑膿菌がバイオフィルムの破壊とマイクロタイタープレートにおけるレサズリンの添加前にトブラマイシンの異なる濃度でインキュベートした。生細胞は、ピンクの蛍光形、レゾルフィンに色素を減少させる一方、青色の非蛍光色は、非生細胞を示しています。 SMICは、その後の割合に蛍光に変換することによって計算することができます。細菌の生存率を残っています。 図4Bは、増加するトブラマイシン濃度が%の生存率の変化を示しています。 10%の生存率は、SMIC 90を計算するために、カットオフとして選ば ​​れました。

    好気的条件下で、トブラマイシンSMIC 90の値は、浮遊培養に比べてフィルムのように増殖した細胞のために高くなっています。表1は、テストしたすべての分離株のPSMIC 90 BSMIC 90のバリエーションを示しています。 LB(浮遊モード)と比較して、ASM(フィルムモード)で培養された時に好気的条件下で、トブラマイシンに耐性が大幅に増加(2 SMICの> 32倍の増加に)は、ほとんどの分離株で観察されていることを表2に示す。好気的条件下で栽培バイオフィルムと比較した場合、さらに、微好気性条件下で栽培しバイオフィルムは、2〜> 128倍の増加SMICを示した。

    図1
    1。 ASM P.における緑膿菌のバイオフィルム形成緑膿菌株 PAO1は、ASMで栽培肉眼で見える塊を(microcolonies)を形成します。スクリューキャップガラスデュランフラスコB、2ミリリットルASM培養におけるバイオフィルム形成(成長7日後に30ミリリットルASM文化(大規模)で、バイオフィルム形成小規模)3日後、24ウェルのポリスチレンプレートの成長。

    図2
    図2。 ASMバイオフィルムのTEM顕微鏡写真/ CのTEM顕微鏡写真、PAO1のは、(x 27000)PAO1grownプランクトンのB / D TEM顕微鏡写真(x57、000)、それぞれplanktonicallyおよびASMで成長し、ASMで、それぞれ。 Planktonically成長した細菌は、LB培地で一晩培養した。バイオフィルムは、30ミリリットルASMの文化で7日間培養した。黒い矢印は、バイオフィルム内のセルを参照して、星が細胞外空間を参照してください。スケールバー= 1μmである。

    図3
    図3。 ASMバイオ抗菌薬感受性アッセイのワークフロー。

    図4
    図4。レサズリンを用いて決定した細菌細胞は、抗生物質の異なる濃度の、残りの代謝活性とインキュベートした抗生物質の感受性を決定するためにレサズリンの使用しています 。、レサズリンの青色の非蛍光性酸化型は非生存細胞を示し、代謝により低減されピンクの蛍光レゾルフィン。B、蛍光強度へのアクティブセルが残っている細菌の生存率のパーセンテージに変換されます。 10%の生存率はMSMIC90を計算するために、カットオフとして選ば ​​れました。 LARを見るにはここをクリックドイツ図。

    PSMIC 90(μg/ ml)を1 BSMIC 90(μg/ ml)を1
    好気性の 微好気性2 好気性の 微好気性2
    PAO1 4 4 8 > 512
    リバプール流行株(LES)隔離
    LESB58 21 8 64 64 128
    LES400 22 32 128 8 256
    LESB25 16 32 256 512
    LESB55 16 64 64 > 512
    LESB64 16 64 > 512 > 512
    LES431 22 4 8 32 > 512
    LESB49 16 64 64 256
    LES109 32 128 32 > 512
    非LES分離株
    49461 16 32 16 > 512
    59032 0.5 2 4 > 512
    59073 > 512 > 512 > 512 > 512
    59076 16 32 32 > 512 </ TD>
    27 8 16 4 > 512
    45 16 32 4 > 512

    表1。トブラマイシンに緑膿菌の感受性。

    PSMICsとBSMICsトブラマイシンの決定のために1が 2倍 ​​希釈で使用されていた
    512に至るまで - 0.5μg/ mlの(各濃度n = 8)および512から1μg/ mlの(n = 4のそれぞれに
    濃度)は、それぞれ; PSMICsは、標準を用いて決定された
    微量方法1。

    2微好気条件は、5%O 2、10%CO 2、85%N 2であった。

    歪み PSMIC 90 / BSMIC 90倍の変化1
    PSMIC 好気性
    微好気性 PSMIC
    BSMIC 好気性
    微好気性 BSMIC
    PSMIC 好気性
    BSMIC 好気性
    微好気性 PSMIC→
    微好気性 BSMIC
    PAO1 0 > 64 2 128
    LES隔離
    LESB58 8 2 8 2
    LES400 4 32 0.25 2
    LESB25 2 2 16 16
    LESB55 4 > 8 4 > 8
    LESB64 4 ND > 32 > 8
    LES431 2 > 16 8 > 64
    LESB49 4 4 4 4
    LES109 4 16 0 > 4
    非LES分離株
    49461 2 > 32 0 > 16
    59032 4 > 128 8 > 256
    59073 ND ND ND ND
    59076 2 > 16 2 > 16
    27 2 > 128 0.5 > 32
    45 2 > 128 0.25 > 16

    表2。PSMICsとトブラマイシンにBSMICsの倍の変化。

    決まっていない1 ND;太字の値は、SMIC倍の変化> 10を示しています。

Discussion

本研究では、P.を複製するためにASMに基づくin vitroモデル小説を使用CFの肺4内の緑膿菌バイオフィルムの状態。モデルは、抗菌剤の小規模、高スループットのテストのために正常に変更された。

このアッセイの重要な手順は次のとおりです。

  1. ASMメディアや保守性不稔性の一貫した準備。我々は、各コンポーネントは、再現性のある結果を毎回達成するために追加される方法を最適化することに長い時間を捧げてきました。 ASMのろ過が遅いですが、ムチンのコンポーネントを破損する恐れがありオートクレーブ、より好ましい。他の11で示唆したように、これはかなりの選択圧、ドライブの変異を課すプロファージの溶解16を誘導し、大幅に複数の細菌の遺伝子の発現を変更することがありますので、私たちは、抗生物質の添加をお勧めしません。
  2. アッセイは、ボリューム入出力に応じて最適化する必要がありますfはASMが使用されます。振とう速度は小さいボリュームのために増加しており、短いフィルムのライフサイクルが観察される。

小規模ASMバイオフィルムモデルの明白なアプリケーションでは、バイオフィルムの抗菌薬感受性(BSMIC 90) ​​のより現実的な判断である。嫌気性および微好気性のニッチは、CFの肺内に存在し、酸素が ​​成熟したバイオフィルム2、17の奥深くに制限されているという証拠がある。ここでは示している10月14日臨床P. ASMでの微好気性条件下ではトブラマイシンに対する感受性の低下- CF患者の喀痰から緑膿菌分離株は、かなり(≥128倍4)を示す。本研究の結果は、トブラマイシンなどの抗生物質が、P.に対してあまり有効であることが示唆された従来の感受性試験の方法によって示されるよりもCFの肺における緑膿菌感染症。これらの結果は、バイオ10の抗菌薬感受性に関する先行研究を反映しています。小スケールASMアッセイは、より良い治療の決定を通知するために意味のある抗生物質感受性データを生成するためのシンプルなハイスループットプラットフォームを提供します。アッセイは、全人口を代表できない場合があり、スクリーニングに拾われ、単一のコロニーで、従来の抗生物質感受性試験と同じ方法で制限されています。しかし、我々は非表面接続されたバイオフィルムの成長と微好気条件(II)を使用して適用されるアプローチは、(i)、明確な代替手段と、既存のメソッドへの潜在的な改善を表していると信じています。我々は、このアッセイはPを勉強するための適切なモデルであると結論緑膿菌のバイオフィルム集団。臨床現場での更なるテストは、抗生物質に対する感受性は、バイオフィルム成長P.に基づいてかどうかを確かめるだろう緑膿菌は、潜在的改善し、微生物学的および臨床転帰を持つ別の抗生物質の選択肢につながる可能性があります。古典的なバイオフィルムモデルを用いた同様の調査がBSMIC値が生じることが示された抗生物質治療5,17別の勧告に。

抗感染薬の有効性のテストに加えて、ASMシステムは、P.の多様化を理解することを目的としたものと研究のための動物モデルへの格安、簡単かつ再現可能な代替手段を表し、 緑膿菌の集団。我々は、P.の自然集団における広範囲の不均一性を観察した緑膿菌は、CF患者の痰18、19から回収された。同様の表現型および遺伝子型の多様化は、それCF肺疾患 in vitroモデル魅力的、ASM 4(と私たちの未発表データ)の成長中に観察することができます。 ASMモデルの相対的なシンプルさは、それが簡単に長期の適応実験はP.に抗生物質やその他のストレスの影響を監視することで、例えば、目的とした設計になります緑膿菌の人口発散。さらに、他の細菌性病原体がで成長させることができるASM。たとえば、2007年は、S.によるバイオフィルム形成を研究するためにASM Fouhy 使用しているmaltophillia 20。

Disclosures

利害の衝突が宣言されません。

Acknowledgments

私たちは、動物実験、ウェルカム·トラスト(グラント089215)を置き換えるために排他的に健康研究のためのイギリス国立研究所、人道的な研究のための博士Hadwenトラスト、英国有数の医療研究慈善団体の資金調達をサポートする非動物の研究技術を認める。我々はまた、ノバルティスファーマ英国株式会社(無制限の教育助成金)を認める。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DNA from fish sperm Sigma-Aldrich 74782
Mucin from porcine stomach, type II Sigma-Aldrich M2378
L-Alanine Acros Organics 102830250
L-Arginine Sigma-Aldrich A5006
L(+)-Asparagine monohydrate Acros Organics 175271000
L(+)-Aspartic acid Acros Organics 105041000
L-Cysteine Sigma-Adrich 168149
L(+)-Glutamic acid Acros Organics 156211000
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126
Glycine Acros Organics 220911000
L-Histidine Sigma-Adrich H8000
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000
L(+)-Lysine monohydrochloride Acros Organics 125222500
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625
L-Phenylalanine Acros Organics 130310250
L-Proline Sigma-Aldrich P0380
L-Serine Acros Organics 132660250
L-Threonine Acros Organics 138930250
L(-)-Tryptophan Acros Organics 140590250
L-Tyrosine Acros Organics 140641000
L-Valine Sigma-Aldrich V0500
Diethylenetriaminepentaacetic acid Sigma-Aldrich 32318
NaCl Fisher Scientific S/3160/60
KCl VWR BDH0258
KOH VWR BDH0262
Egg yolk emulsion Sigma-Aldrich 17148
ME 2 diaphragm vacuum pump Vacuubrand 696126
Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm) EMD Millipore SCGPT10RE
Luria-Bertani medium Sigma-Aldrich L2897
96-well microtitre plates Sarstedt Ltd 82.1581
24-well tissue culture-treated plates Iwaki, Asahi Techno Glass Corp. 3820-024
CampyGen gas generation packs Oxford Labware CN0025
Microaerophilic chamber Oxford Labware HP0011
Tobramycin sulphate Sigma-Aldrich T1783
Cellulase, from Aspergillus niger Sigma-Aldrich 22178
Resazurin Sigma-Aldrich 199303
Citrate.H20 VWR BDH0288
Fluostar omega microplate reader BMG-Labtech SPECTROstar Omega

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References

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2 Comments

  1. test comment

    Reply
    Posted by: Cory G.
    June 6, 2012 - 1:53 PM
  2. another test

    Reply
    Posted by: Cory G.
    June 6, 2012 - 1:53 PM

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