L'uso di cistometria in piccoli roditori: A Study of Chemosensation vescica

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Summary

Cistometria è una tecnica efficace per misurare la funzione della vescica di piccoli animali

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Uvin, P., Everaerts, W., Pinto, S., Alpízar, Y. A., Boudes, M., Gevaert, T., et al. The Use of Cystometry in Small Rodents: A Study of Bladder Chemosensation. J. Vis. Exp. (66), e3869, doi:10.3791/3869 (2012).

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Abstract

Protocol

1. Animali da laboratorio

  1. Animali (topi, ratti) sono alloggiati in una struttura specializzata animale con un 12-hr ciclo luce-buio e ad libitum accesso all'acqua e pellet cibo standard. Sia l'età e il sesso degli animali sono parametri importanti che dovrebbero essere standardizzate in base alle esigenze. Noi di solito eseguire cistometria in 10 - 12 settimana animali vecchi femmine 5,6.
  2. Tutti gli esperimenti sugli animali siano effettuati in conformità con le linee guida comunitarie dell'Unione europea del Consiglio e approvato dal comitato etico locale.

2. Anestesia

  1. Anestesia isoflurano viene utilizzato per eseguire piccoli interventi chirurgici, poiché è facile da dosare a causa della sua breve emivita. Gas di scarico adeguata evacuazione è necessaria quando si utilizza l'isoflurano.
    1. Animali siano posti in una scatola chiusa, gasati con isoflurano 5% in ossigeno puro (1 l / min).
    2. Dopo l'induzione, l'anestesia al l appropriatoevel è mantenuto da una piccola maschera (un taglio siringa da 10 ml) di 0,8 - 1 l / min di ossigeno con 1 - 1,5% di isoflurano.
  2. Per i topi, l'anestesia uretano viene utilizzato durante le registrazioni funzionali (cfr. infra). Anestesia uretano viene utilizzato durante le registrazioni funzionali perché, a differenza di molti altri anestetici, il riflesso della minzione non è soppresso da questo agente anestetico 4. Uretano 1,2 g di peso corporeo / kg viene somministrato per via sottocutanea (sc) 60 min prima dell'inizio delle registrazioni. Se necessario, la dose di uretano necessario per ottenere l'anestesia adeguata può essere titolato con la somministrazione di dosi supplementari (0,1 g / kg) per via sottocutanea. Va notato, tuttavia, che l'anestesia supplementare può alterare l'efficienza svuotamento e di conseguenza la frequenza della minzione 7,8. Così, le registrazioni cistometrici devono essere attentamente monitorati ed eliminato ogni volta deviazioni significative dal comportamento di controllo siano rispettate. Anestetici non deve essere somministrato durante la provacomposti vengono applicati evitare errori di interpretazione dei dati.

3. Procedura chirurgica - Impianto catetere vescicale

  1. Strumenti chirurgici vengono sterilizzati in autoclave prima dell'uso. Radere l'addome dell'animale, disinfettare con etanolo al 70% e di eseguire una laparotomia mediana bassa per esporre la vescica.
  2. Sotto un microscopio operatorio, mettere una borsa di sutura nella cupola della vescica utilizzando un non-assorbibile, sutura monofilamento (dimensioni 6-0).
  3. Eseguire una cistostomia piccola (preferibilmente usare un ago da 18 G) all'interno della stringa borsa e inserire un catetere di polietilene PE 50, con un bracciale piccolo alla fine (ottenuta riscaldando cautamente il tubo) attraverso questo foro. Nelle nostre mani, sottili tubi PE (10) hanno una resistenza maggiore e più variabile. Il tubo può essere disinfettato mettendolo in una soluzione di etanolo al 70% o sterilizzati in autoclave. Prima dell'impianto, il tubo deve essere lavata con soluzione salina.
  4. Fissare la str borsazione attorno al tubo con un nodo di un chirurgo. Estrarre il catetere è posizionato delicatamente verso l'esterno fino a campana punta destra sotto la sutura. Inserire un pezzo di 18 catetere G verso la sutura per evitare perdite.
  5. Infondere un piccolo volume di soluzione fisiologica (100 - 200 pl) delicatamente per controllare eventuali perdite. Se le perdite sono presenti, una sutura supplementari vanno riportate.
  6. Chiudere i muscoli addominali utilizzando monofilamento, lasciando un passaggio per il catetere nella parte superiore dell'incisione.
  7. Tunnel il tubo alla regione interscapolare utilizzando un'asta cava di metallo, impedendo così agli animali di mordere il tubo durante l'esperimento.
  8. La pelle è chiuso con non assorbibili, monofilamento. Il catetere impiantato viene lavata con soluzione salina per verificare la permeabilità.
  9. Prima di risvegliare gli animali, gli analgesici sono somministrate per via sottocutanea (buprenorfina, 0,05 mg / kg).

4. Installazione e cistometria

  1. A seconda della sperimentale Questi,su (e le specie utilizzate) cistometria viene eseguita in sveglio (di restrizioni o di sfrenatezza) o uretano-anestetizzato animali. Considerando che cistometria è perfettamente realizzabile nei ratti coscienti, che tendono a mantenere la calma in un ambiente sobrio, di solito eseguire in anestesia cistometria uretano (1,2 mg / kg per via sottocutanea) quando si utilizza topi 3,5,6,9.
  2. In topi anestetizzati, temperatura corporea è costantemente monitorata e mantenuta a 36,5 ° C ± 0,2 ° C per mezzo di una sonda di temperatura ed una lampada di riscaldamento.
  3. Il set-up è calibrato prima di ogni esperimento secondo le istruzioni del fabbricante.
  4. Il catetere impiantato è collegata da un luer stub di un 3-way rubinetto, che è collegato al trasduttore di pressione (Edwards Lifesciences) su un lato e una pompa per infusione, dall'altro (Harvard Apparatus). Il trasduttore di pressione è collegato tramite un amplificatore (78534c monitor, Hewlett Packard) al sistema di acquisizione dati (DI-730-USB, Dataq strumenti) e un computer. Windaq / Lite software può essere utilizzato per la registrazione.
  5. La pompa di infusione viene avviata, consentendo l'infusione di soluzione salina o PBS a, per esempio, 100 pl / min (nei ratti) e 20 microlitri / min (nei topi). Come tale la vescica viene riempita a velocità costante, mentre la pressione intravescicale viene registrato.
  6. Figura 5 illustra una traccia tipica pressione: durante l'infusione di fluido, vi è un accumulo di pressione lenta nella vescica, finché un certo volume / pressione viene raggiunto, la soglia di minzione. Una volta che viene raggiunta questa soglia, la vescica si contraggono e successivamente lo sfintere urinario si apre, consentendo il passaggio di urina attraverso l'uretra. Come tale, la vescica si svuota, la contrazione si arresta e la pressione scende nuovamente al livello "basale".
  7. Come il ratto viene posto in una gabbia metabolica e sopra una bilancia digitale, il volume annullato possono essere misurati simultaneamente, fornendo informazioni riguardanti il ​​volume annullata. A causa dei piccoli volumi annullate in mice, può essere molto impegnativo tramite questo sistema. Pertanto, il volume svuotato è determinato utilizzando piccole carte da filtro pesati prima e dopo svuotamento.
  8. Tipicamente, si lascia il sistema equilibrare per 30 minuti, seguito da un periodo di registrazione di 30 min. Quindi, i farmaci possono essere somministrati per via sistemica o per via endovescicale e altri 30 minuti vengono registrati.
  9. I dati registrati possono essere esportati come file. Csv che possono essere importati in un software specializzato per l'analisi quantitativa. Si utilizzano in genere di origine (OriginLab Corporation, MA, USA).
  10. Dopo gli esperimenti, gli animali sono sacrificati mediante dislocazione cervicale (topi) o intossicazione da CO 2 (ratti).

5. Risultati rappresentativi

Figura 1
Figura 1. Panoramica laparotomia. A) Posizionare il ratto in posizione supina. B) Shave e asettico preparazione del sito chirurgico. C) incisione della pelle. D) Incisione of i muscoli addominali, e l'esposizione della vescica.

Figura 2
Figura 2. Una borsa di sutura.

Figura 3
Figura 3. L'impianto del catetere.

Figura 4
Figura 4. Tunnelling del catetere.

Esempi di misure di pressione intravescicale ottenuta durante la perfusione di soluzione salina in un ratto cosciente e un mouse anestetizzato sono mostrati in Figura 5. Parametri multipli può essere estratto dal segnale di pressione (ad esempio l'intervallo intercontractile, la pressione di riferimento e la pressione di soglia). Per una descrizione completa di questi parametri, vedere Andersson et al. (Rif. 4) e Yoshiyama et al. ( rif 10).

Abbiamo recentemente cistometria utilizzato per identificare i bersagli molecolari di olio di senape (MO), un composto altamente reattivo che è stato a lungo utilizzato in modelli sperimentali di infiammazione ed iperalgesia di organi viscerali come la vescica urinaria 11,12. Infusione intravescicale di 10 mM MO indotto un forte aumento della frequenza di minzione (diminuzione nell'intervallo intercontractile) in sorci di tipo selvatico (Figura 6A, B) e la diminuzione del volume annullata 6. È interessante notare che, MO indotto cambiamenti simili in topi deficienti del recettore TRPA1 MO. Al contrario, MO prodotto cambiamenti molto più deboli dei parametri cistometrici TRPV1 in topi KO rispetto ai topi WT ed è stato senza alcun effetto a Trpa1/Trpv1 topi KO. Insieme a misurazioni del rilascio del peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP) 6, questi dati indicano che dimostrano TRPV1 può giocare un ruolo chiave nella irritazione viscerale indotta da MO.

ve_content "> Figura 5
Figura 5. Tracce rappresentativi di pressione intravescicale registrata in un ratto conscio femmina (A) e in un mouse anestetizzato femmina (B). La pressione minima è definita come la "pressione basale" (frecce rosse). La pressione alla fine della fase di riempimento è contrassegnata con frecce blu. Il volume del liquido infuso tra questi punti, diviso per la differenza di pressione, permette di calcolare la compliance della parete della vescica (compliance = infuso volume / (pressione di soglia -. Pressione basale) Il "intervallo intercontractile" (ICI) è il tempo tra due contrazioni svuotamento.

Figura 6
Figura 6. Effetti dell'applicazione intravescicale di olio di senape sul modello cistometria in wild type e topi knockout TRPA1, TRPV1 e Trpa1/Trpv1.(A) gli esempi rappresentativi di variazioni di pressione intravescicale registrate nel WT, KO TRPA1, TRPV1 KO e Trpa1/Trpv1 topi KO in risposta alla infusione di soluzione fisiologica e 10 mM MO. (B) Naturalmente il tempo della frequenza media di svuotamento istantaneo, prima e durante l'infusione intravescicale di MO. Per tutti i topi, i dati sono stati normalizzati alla frequenza media ottenuta durante l'infusione salina. Questi dati sono adattato da Everaerts et al. (Rif 6), con il permesso di Elsevier.

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Discussion

La tecnica qui presentata cistometria permette di effettuare misure in vivo della funzione della vescica in modelli animali. I ratti sono probabilmente il modello animale più utilizzato. I topi sono più difficili da gestire, ma offrono il vantaggio di utilizzare animali geneticamente manipolati. A causa della difficoltà tecnica di utilizzare topi coscienti, che tendono ad essere molto attivo con conseguente allentamento del catetere impiantato e variazioni delle pressioni intra-addominale che possono influenzare la pressione intravescicale, si consiglia di tenerli anestetizzati con uretano durante l'intero cistometria protocollo. Naturalmente, i vantaggi di avere topi sedati, devono essere bilanciati con gli effetti degli anestetici. Come tale, uretano può avere un'influenza significativa sulla post-minzionale volume residuo 7,8. Abbiamo quindi aspettare fino a quando non hanno un grado stabile di anestesia, prima di cominciare le nostre registrazioni e interventi.

I ricercatori dovrebbero prendere in considerazione tegli differenze tra minzione roditori maschi e femmine 13. Inoltre, l'età degli animali è di grande importanza. Eseguiamo cistometria in animali che sono 10 - 12 settimane di età. Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti in un ambiente tranquillo, specialmente quando si usano animali coscienti. Un certo numero di velocità di infusione sono stati descritti per i nostri modelli animali. Si utilizzano in genere velocità di infusione di 20 l / min per topi e 100 microlitri / min per i ratti.

Come menzionato sopra, minzione nell'uomo e nei roditori differiscono significativamente. Ad esempio, l'ATP è un importante contributo alla contrazione del detrusore in topi e ratti, mentre negli esseri umani, la contrazione della vescica, in condizioni fisiologiche è mediato principalmente da acetilcolina 4. Tuttavia, le possibilità di effettuare misurazioni invasive che sono generalmente proibitivi nel contesto clinico e l'uso di animali geneticamente modificati, permettono esplorare i limiti attuali di fisiopatologia una vescicad farmacologia. In questo senso, significativi progressi sono stati ottenuti recentemente nel chiarire il ruolo di muscarinico 14, 15 e prostaglandina recettori adrenergici 16, neuropeptidi 17, Ca 2 +-attivata K + canali 18 e TRP canali 3,5,6.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del governo federale belga (IUAP P6/28), la Fondazione-Fiandre (FWO) (G.0565.07 e G.0686.09), la ricerca europea Astellas Foundation Award 2009 e il Consiglio di ricerca del KU Leuven (GOA 2009/07, e EF/95/010 PFV/10/006). PU e NOI siamo dottorandi della Research Foundation-Fiandre (FWO). MB è un borsista Marie Curie. DDR un fondamentale-clinica collega del FWO.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
urethane Urethane, Sigma-Aldrich 315419 group 2B carcinogen
isoflurane Isoba, Schering-Plough Animal Health
polyethylene catheter Intramedic Polyethylene tubing PE50, Becton Dickinson 427411
surgical microscope Op-Mi 6, Carl Zeiss Op-Mi 6
purse-string suture Prolene 6/0, Ethicon 8610H
fascia and skin suture Ethilon 4/0 or 5/0, Ethicon 662G or 661G
postoperative analgesics Temgesic, Schering-Plough Animal Health dosage for rats: 0.05 mg/kg
amplifier 78534c monitor, Hewlett Packard
analytical balances and balance data acquisition software FZ 300i, A&D FZ-300i
infusion pumps pump 33, Harvard apparatus HA33
cystometry recording system Dataq instruments, DI-730 series and Windaq/Lite DI-730-USB Windaq/Lite
temperature registration Fluke 52 KJ thermometer 52 KJ
pressure transducers Edwards Lifesciences, pressure monitoring set T322247A

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References

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