הכנת מיאלואידית תאים מדכאי נגזרים (MDSC) מן הגידול נושאות עכברים תמימים הלבלב באמצעות cytometry זרימה ומיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (AutoMACS)

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

זוהי שיטה מהירה ומקיפה של immunophenotyping מיאלואידית תאים מדכאי נגזרות (MDSC) ומעשירה GR-1

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

MDSC הם אוכלוסיה הטרוגנית של מקרופאגים בוגרים, אלא תאים דנדריטים ו גרנולוציטים המצטברים באיברים הלימפה במצבים פתולוגיים כולל זיהום טפילי דלקת, טראומה, השתל נגד מארח מחלות, סוכרת וסרטן 1-7. בעכברים, MDSC אקספרס Mac-1 (CD11b) ו Gr-1 (Ly6G ו Ly6C) אנטיגנים פני 7. חשוב לציין כי MDSC נלמדים גם בגידול נושאות צבאות שונים שם הם התרחבו באופן משמעותי ולדכא אנטי סרטניים התגובה החיסונית לעומת עמיתיהם נאיביות 7-10. עם זאת, בהתאם למצב פתולוגי, יש subpopulations שונים של MDSC עם מנגנוני ויעדים שונים של דיכוי 11,12. לכן, שיטות יעילות לבודד אוכלוסיות MDSC קיימא חשובים הבהרת המנגנונים המולקולריים השונים של דיכוי במבחנה in vivo.

לאחרונה, ה-Ghansah הקבוצה דיווחה על הרחבת MDSC ב מודל הלבלב Murine סרטן. MDSC הגידול נושאת שלנו להציג הפסד של הומאוסטזיס והגדילה את הפונקציה מדכאים לעומת MDSC תמים 13. אחוזי MDSC באופן משמעותי פחות תאים הלימפה של עכברים תמימים לעומת הגידול נושאת. זוהי אזהרה גדול, אשר לעתים קרובות מעכבת ניתוחים השוואתיים מדויקים של MDSC אלה. לכן, להעשיר GR-1 + leukocytes מעכברים תמימים לפני מיון Fluorescence Cell הופעל (FACS) משפר, הכדאיות טוהר מפחית באופן משמעותי את זמן המיון. עם זאת, העשרת GR-1 + leukocytes מן הגידול נושאות עכברים היא אופציונלית כמו אלה בשפע עבור FACS מהירים מיון. לכן, בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה היעילה ביותר של immunophenotyping MDSC ומעשירה GR-1 + leukocytes מן spleens של עכברים תמימים למיון MDSC מבעוד מועד. Immunocompetent עכברים C57BL / 6, מחוסן עם Murine Panc02 לספירהlls מתחת לעור ואילו עכברים תמימים לקבל 1XPBS. כ 30 ימים לפרסם חיסון; spleens נקצרים ומעובדים מתא בודד השעיות באמצעות תא דיסוציאציה מסננת. Splenocytes הן מכן כדורית דם אדומה (RBC) lysed ו aliquot של leukocytes אלה מוכתמות באמצעות fluorochrome-מצומדות נוגדנים נגד Mac-1 ו-GR-1 לאחוזים immunophenotype MDSC באמצעות cytometry הזרימה. בניסוי מקביל, leukocytes שלמים מעכברים נאיביות מגואלות ניאון מצומדות GR-1 נוגדנים, מודגרות עם PE-microbeads נבחרים באופן חיובי באמצעות מיון אוטומטי מגנטי נייד הופעל (autoMACS) Pro מפריד. לאחר מכן, aliquot של GR-1 + leukocytes מגואלות Mac-1 הנוגדנים לזהות את הגידול באחוזים MDSC באמצעות cytometry הזרימה. עכשיו, אלה + Gr1 leukocytes מועשר מוכנים FACS המיון של MDSC לשימוש בניתוחים השוואתיים (נאיבי לעומת הגידול נושאת) ב in vivo ו in vitro

Protocol

לפני שמתחילים, להכין את הפתרונות הבאים:

3 מכתים% Media (SM):

עוברי -3% בסרום שור (FBS) ב 1X מאגר מלוחים פוספט (PBS)

מאגר MACS (MB):

- 0.5% אלבומין סרום מ שור (BSA) ב 1XPBS

1. קציר spleens של עכברים

  1. תת עורי להזריק 6-8 בשבוע של C57BL גיל / 6 עכברים (הרלן) עם 1.5 x 10 5 Murine Panc02 תאים תלויה 100 μl 1x PBS (גידול נושאת; TB). עכברים שליטה (נאיבי) מקבלים 100 1XPBS μl.
  2. כ 4 שבועות הזרקת הודעה, להרדים עכברים ידי מחנק פחמן דו חמצני.
  3. Spleens קציר מעכברים ידי דיסקציה קהה באמצעות מלקחיים ומספריים ושוקלים באמצעות איזון. Spleens מקום ב נפרד, שכותרתו 50 מ"ל צינורות חרוטי המכילים 1 X PBS.

2. צור מתא בודד Suspension של Leukocytes מ spleens

הנהלים כל יש לבצע בסביבה סטרילית מתחת למכסה המנוע בטיחות ביולוגית תאים ונוגדנים שמרו על הקרח.

  1. להרכיב את התא דיסוציאציה מסננת ידי הוספת מסך רשת לתוך פתח הספל לתחתית. לאחר מכן, הכנס את הטבעת שמירה לאזור הליכי עם הצד מחוררת ולשימוש המפתח טבעת להדק את הטבעת שמירה, ובכך מחזיק את המסך במקום. מניחים את המסננת התאספו בצלחת פטרי שמכילה 10 מ"ל 1 X PBS.
  2. Spleens ביליארד וזכוכית ועלי שימוש לטחון spleens על המסך רשת של תאים דיסוציאציה מסננת לתוך צלחת פטרי. חזור על הפעולה עבור כל קבוצת טיפול של עכברים.
  3. תא ההשעיה מסנן לתוך צינור מ"ל 50 חרוטי באמצעות תא 70 מיקרומטר מסננת פיפטה 5 מ"ל סרולוגית. סרכזת 12,000 סל"ד (250-300 XG) במשך 5 דקות.
  4. הסר supernatant ו resuspend גלולה של 5 מ"ל 1 חיץ RBC x תמוגה לכל הטחול. Pipet למעלה ולמטה במרץ. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לעצור את התגובה על ידי הוספת 20 מ"ל של 1 X PBS. Pipet למעלה ולמטה במרץ. סרכזת 12,000 סל"ד (250-300 XG) במשך 5 דקות.
  5. הסר supernatant ו resuspend גלולה ב 20 מ"ל סטרילי 1 X PBS. Pipet למעלה ולמטה במרץ.
  6. ספירת תאים באמצעות trypan כחול hemacytometer ו resuspend בריכוז הרצוי SM 3% עד 50 μl שווה 5-5x10 1x10 6 תאים (1x10 -7 תאים / מ"ל - 2x10 7 תאים / מ"ל).

3. על פני קרום התא מכתים / Immunophenotyping של MDSC באמצעות cytometry זרימה

  1. לתייג את הבארות של צלחת 96-V גם למטה לבקרה דגימות הניסוי וכתמים בודדים עבור פקדים פיצויים (לא כתם, NS, Mac-1-FITC, Gr-1-APC ו DAPI).
  2. הוסף 5x10 5-1x10 6 תאים שווה ערך ל μl 50 / היטב splenocytes לבארות שלהם בצלחת V-96-התחתונה גם כן. סרכזתצלחת ב -12,000 סל"ד (250-300 XG) עבור 5 דקות.
  3. הכן "מיקס מאסטר" (מ"מ) של עכבר BD Fc בלוק (אנטי עכבר עכברוש CD16/32 נוגדן חד שבטי) מדולל SM 3%, בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל על הקרח. כנקודת מוצא, השתמש 1 מיקרוגרם Fc בלוק ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50, לפי היטב.
  4. מוציאים בזהירות את supernatant מבאר כל צלחת V-96-התחתונה היטב על ידי צלחת היפוך במהירות מצד אל צד, על מיכל הפסולת או כיור ללא הפרעה של כדורי סלולריים.
  5. וורטקס, בקצרה סרכזת MM Fc חסום למשך 5 שניות ומוסיפים 50 μl לכל כדורי בצלחת V-96-התחתונה גם כן. מערבבים היטב בעדינות pipetting למעלה ולמטה, והשאיר הדגימות בבארות שלהם. דגירה הצלחת במשך 15 דקות בחושך על הקרח. סרכזת צלחת 12,000 סל"ד (250-300 XG) במשך 5 דקות.
  6. הכן "מיקס מאסטר" (מ"מ) של fluorochrome-מצומדות נוגדנים בדילול ב SM 3% בצינור microcentrifuge 1.5ml על הקרח, בעוד דגימות דגירה עם בלוק FC. נוגדנים יש טיטרציהכדי לקבוע דילולים אופטימליים מכתים ההליכים. כנקודת מוצא, לשלב דילול של 1:25 Mac-1-FITC ו 1:20 דילול של Gr-1-APC ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50, לדגימה גם כן.
  7. מוציאים בזהירות את supernatant מבאר כל אחד גם 96-bottom-V כפי שתואר לעיל.
  8. וורטקס, בקצרה סרכזת מ"מ ניאון מצומדות נוגדנים צביעה למשך 5 שניות ומוסיפים 50 μl לשלוט כדורי ניסיוניים. מערבבים היטב בעדינות pipetting מעלה ומטה. עבור יחיד כתם פיצויים, להוסיף דילול של 1:25 Mac-1-FITC, 1:20 דילול של Gr-1-APC ו 75 ng / mL של DAPI, ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50 דולר גם לבארות, בהתאמה. הוסף 50 μl SM 3% ל בלא כתם היטב (לא הכתם). מערבבים היטב דגירה תאים 96-גם צלחת V-התחתונה למשך 30 דקות בחושך על הקרח.
  9. FACS תווית צינורות (5 מ"ל, 12 מ"מ x 75 מ"מ קלקר עגולים צינורות למטה) כדי מתאימות גם כל צלחת גם 96-V-התחתונה. הוסף 200 μl SM 3% לכל אחד FACSצינור.
  10. סרכזת צלחת 12,000 סל"ד (250-300 XG) במשך 5 דקות ולהסיר supernatants. לשטוף את כדורי על ידי הוספת 100 SM 3% μl לכל גלולה ומערבבים היטב בעדינות pipetting מעלה ומטה. סרכזת צלחת 12,000 סל"ד (250-300 XG) במשך 5 דקות. חזור על שלב לשטוף שוב.
  11. מוציאים בזהירות את supernatant מבאר כל אחד גם 96-bottom-V כפי שתואר לעיל. Resuspend כל גלולה ב SM 100 3% μl ומערבבים היטב.
  12. העברת 100 μl גלולה resuspended מבאר כל צלחת V-96-התחתונה היטב צינור FACS שכותרתו בהתאמה שלהם.
  13. לפני ניתוח תזרים cytometry, להוסיף 75 ng / ml DAPI לשלוט דגימות ניסויים ובקרה DAPI אחת פיצוי הכתם.
  14. בצע cytometric זרימת נתונים רכישת אחוזי MDSC. לבצע באמצעות פיצוי שלילי (אין שליטה כתם) ואת בקרות חיוביות בודדות. הגדר את העלילה נקודה המציג פיזור קדימה (FSC) לעומת הצד (SSC) בהיקף התחבר כדי אוכלוסיות של ליקוציטעניין ניתן לזהות. צייר שער גדול על כל leukocytes, למעט פסולת גושים עם קדימה הנמוך ביותר ולפזר בצד. מהשער אב זה, ליצור עלילה נקודה חדשה המציגה SSC לעומת DAPI והשער על DAPI-(Live) תאים. בחר אוכלוסיה מגודרת החדש וליצור עלילה נקודה המציג Mac-1 לעומת GR-1 ושער חיובית כפולה על שלך (Mac-1 + GR-1 +) MDSC.

4. העשרה המגנטי של GR-1 + Leukocytes

  1. 1x10 aliquot 7 leukocytes בלא כתם הנותרים לתוך צינורות FACS שכותרתו כראוי צנטריפוגות ב -12,000 סל"ד (250-300 XG) עבור 5 דקות.
  2. הכן MM של נוגדנים Gr-1-PE בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. עד 10 7 תאים, השתמש דילול 1:10 של נוגדנים Gr-1-PE ב -50 MB μl, לדגימה. למספרים סלולריים יותר, בהיקף של עד כרכים בהתאם. בקצרה סרכזת למשך 5 שניות, להוסיף leukocytes בשפופרות FACS ו דגירה של 15 דקות ב 4 ° C בחושך. הוסף 2 מ"ל של MB לצינורות FACS, צנטריפוגות ב -12,000 סל"ד (250-300 XG) עבור 5 דקות וזורקים supernatant.
  3. הכן מ"מ אנטי-PE microbeads בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. עד 10 7 תאים, השתמש דילול 01:04 נגד PE microbeads ב 200 MB μl, לדגימה. למספרים סלולריים יותר, בהיקף של עד כרכים בהתאם. בקצרה סרכזת למשך 5 שניות, להוסיף leukocytes בשפופרות FACS ו דגירה של 15 דקות ב 4 ° C בחושך.
  4. הוסף 2 מ"ל של MB לצינורות FACS, צנטריפוגות ב -12,000 סל"ד (250-300 XG) עבור 5 דקות וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 3 מ"ל של SB. לסנן דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חדש, שכותרתו 50 מ"ל חרוטית.
  5. להכין ראש אוטומטי MACS מפריד Pro. מילוי בקבוקים עם כל הפתרונות המתאימים ולרוקן בקבוק פסולת, במידת הצורך. הפעל על מכשיר ולבחון מעמדה של נוזלים מכלי ועמודה (ים) לאחר אתחול. כל הסמלים צריך להיות ירוק. בתפריט, בחר "הפרדה" מן העליון שורת התפריטים ואחריו "לשטוף עכשיו" משורת התפריטים נמוכה יותר. בחר "לשטוף" מן האפשרות מוקפץ ואחריו "הפעלה" כדי להתחיל את תהליך תחול. לאחר תהליך תחול הושלמה בהצלחה, המכשיר לאחר מכן להציג כי הוא "מוכן ההפרדה" תחת תפריט מצב.
  6. בחר צינור מתאים מדף מצונן עבור גדלים צינור ומקום 50 מ"ל צינור חרוטי עם תאים שכותרתו מגנטית ברציפות, 50 מ"ל צינור חרוטי עבור אוסף חלק שלילי ב שורה 15 צינור חרוטי מ"ל לאיסוף חלק חיובי בשורה ג
  7. בחר "POSSEL_S" הפרדת תאים תוכנית סלקציה חיובית של תאים היעד המוגדרים במצב רגיש דגימות. תאים היעד שכותרתו מגנטית נשמרות על עמודה האוטומטים, התאים שהוסרו מהן תוויות משתחררים לתוך צינור חלק שלילית האוסף ב 'בשורה על הכחשה אוטומטי של המגנט, התאים היעד שכותרתו ישוחררו לתוך צינור איסוף חיובי C שורה של הצינור מתלה.

> 5. לאחר מיון ניתוח GR-1 + Leukocytes מועשר

  1. לספר GR-1 + ו-GR-1 - שברים באמצעות trypan כחול hemacytometer. תאים Resuspend בריכוז הרצוי בינוני מכתים 3%, כך 50 μl הוא שווה 5-5x10 1x10 6 תאים (1x10 7 תאים / מ"ל - 2x10 7 תאים / מ"ל) ולהעביר 50 μl לצינורות FACS שכותרתו בהתאם.
  2. הכן מ"מ Mac-1 בלבד, בדילול 1:25 ב SM 3% עבור נפח סופי של μl 50 לדגימה. כתם תאים ולהכין פיצויים כתם יחיד של GR-PE, Mac-1 ו FITC DAPI לניתוח cytometry הזרימה. הוספת 200 SM 3% μl וצבע DAPI הכדאיות כפי שתואר לעיל.
  3. ביצוע הרכישה cytometric זרימת נתונים כדי לקבוע GR-1 + ו-GR-1 - אחוזים וכן גם להשוות את אחוזי MDSC העשרת לפני ואחרי-autoMACS.

6. נציג תוצאות

כאן אנו מראים R תוצאות epresentative עבור העשרת autoMACS של GR-1 + leukocytes מ, spleens אספו נאיביות עבור FACS הבאים המיון של MDSC (איור 1). 1x10 6 leukocytes נאיביות הוכתמו Mac-1-FITC ו Gr-1-APC הנוגדנים לזהות אחוזי MDSC באמצעות מכשיר LSRII BD, לפני מיון autoMACS. 1x10 7 leukocytes הנאיביים היו מוכתמים מכן עם אנטי GR-1-PE נוגדנים PE-microbeads עבור העשרת GR-1 + leukocytes באמצעות מפריד Pro autoMACS. לאחר autoMACS העשרה, GR-1 אחוזים ב GR-1 + ו-GR-1 - שברים אסף הוערכו באמצעות cytometry הזרימה. 1x10 6 GR-1 + leukocytes הוסרו מוכתם נוגדנים Mac-1-FITC לנתח ולהשוות אחוזים של MDSC מועשר, אספו leukocytes תמימים שאינם מועשר, נקווה הגידול נושאות leukocytes ידי cytometry הזרימה.

fig1.jpg "/>
1. איור AutoMACS העשרת נאיביות GR-1 + leukocytes עבור FACS MDSC מיון. Spleens נקצרו מעכברים הלבלב הגידול נושאות ותמים מעובד לתוך תא יחיד המתלים. Cytometry זרימה ניתוח של השטח leukocytes נאיבי מוכתם Mac-1 ו-GR-1 ניאון מצומדות נוגדנים, לפני העשרה autoMACS (א '). Cytometry זרימה ניתוח GR-1 + (ב) ו - GR-1 - (ג) שברים שלאחר autoMACS העשרת GR-1 + תאים leuckocytes נאיביות אספו מוכתמים GR-1-PE נוגדנים נגד PE microbeads. Cytometry זרימה ניתוח MDSC ו Gr-1 + אחוזים שלאחר autoMACS העשרת GR-1 + תאים leukocytes נאיביות אספו (ד ') לעומת הלא מועשר leukocytes אספו מן הגידול נושאות עכברים (ה) (עכברים נאיביות, N = 5 ; הגידול נושאות עכברים, N = 3). MDSC ו GR-1 אחוזים הם מגודרת בחלקות גובה ו היסטוגרמות מייצגים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זוהי שיטה מפורטת עיבוד immunophentyping אוכלוסיות MDSC כי הוא ישים הלימפה ברקמות שונות במודלים של בעלי חיים שונים. בפרט, להעשרת autoMACS יכול לשמש לבידוד של אוכלוסיות ליקוציט שונים, כולל דלדול-1 Gr של splenocytes 4, טיהור תת מיאלואידית מ splenocytes ובלוטות לימפה 5, בידוד של נויטרופילים במח העצם 14 וטיהור של CD8 + בתאי T של הטחול ואת בלוטות הלימפה 15. ללא קשר לאוכלוסייה התא של עניין, יצירת תא יחיד המתלים של leukocytes מן הרקמות הלימפה הרצויים נדרש מכתים משטח אופטימלי, ניתוח תזרים cytometry, העשרה autoMACS ומיון FACS. בפרוטוקול זה, השתמשנו כדי ליצור ניתוק מכני ההשעיה תא בודד של כדוריות דם לבנות. עם זאת, באמצעות אנזים העיכול כגון collagenase D הוא גם חלופה נאותה לפרוטוקול זה כדי להגדילתשואה של leukocytes מ spleens הלימפה או לאיברים אחרים 5.

Cytometry הזרימה היא טכניקה חשובה leukocytes immunophenotyping. לכן, הכנה מתאימה cytometry זרימת והעשרה גם מחייב שימוש מאגרים מתאימים ההשעיה התא דילול של ריאגנטים נוגדנים. פרוטוקולים רבים לסירוגין בין FBS ו BSA על הכנת התקשורת הכתים חיץ MACS. עם זאת, ריאגנטים אלה זמינים גם מבחינה מסחרית מחברות כגון eBioscience, BD Pharmingen ו Miltenyi BIOTEC. כפי שהסביר Miltenyi BIOTEC ו eBioscience, הן BSA ו FBS למנוע הלא ספציפית מחייב כאשר מכתים leukocytes עם fluorochrome-מצומדות נוגדנים. יתרה מכך, אחוזים נמוכים של החלבונים האלה בסרום בעלי חיים לשמור על יכולת הקיום ולמנוע clumping של leukocytes 16. עם זאת, מהניסיון שלנו, BSA עובד טוב יותר עבור צביעה אופטימלית ברזולוציה טובה יותר להעשרת autoMACS מ FBS והוא recommended בפרוטוקול תיאר.

בפרוטוקול זה, אנחנו מאופיינים MDSC Murine באמצעות CD11b-FITC ו Gr-1-APC ניאון מצומדות נוגדנים cytometry הזרימה. זה הכרחי כדי לכיל נוגדנים אלה לפני השימוש כדי להפחית את הקרינה רקע מכתים גבוהה כדי למנוע שאינם אופטימליים תוצאות. כמו כן, בעת בחירת נוגדנים לניתוח cytometry ססגוניות זרימה, חפיפה רפאים האפשריות של fluorochromes הוא גם גורם קריטי כדי להיחשב 17,18. לכן, פיצוי שולט בצורה של כתמי צבע אחד על נוגדנים fluorochome-מצומדות כל אחד חרוזים ריבית או פיצוי, ניתן לתקן בעיות של חפיפה רפאים 18. שיקול חשוב נוסף לקבלת תוצאות מדויקות cytometry הזרימה היא השימוש צבעים הכדאיות. תאים מתים שאינם יכולים להיקשר באופן ספציפי נוגדנים, ובכך ליצור תוצאות חיוביות שגויות 19. בפרוטוקול זה, אנו משתמשים חומצות גרעין כתם, DAPI כמו לצבוע את הכדאיותלהוציא תאים מתים מן הניתוחים שלנו זה הכי טוב משלים את הפאנל של fluorochrome-מצומדות נוגדנים בשימוש עם חפיפה מינימלית רפאים. עם זאת, הכדאיות צבעים אחרים כמו 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) ו יודיד propidium (PI) ניתן להשתמש בשיטות שתוארו צביעה בהתאם פאנל של נוגדנים בשימוש. נכון לעכשיו, יש גם כמה כתמים אפשר לתקן תאים מתים זמינים המאפשרים לתאי מוכתמים להיות קבוע ו permeabilized מבלי לאבד את היכולת להבחין הכדאיות (Invitrogen). בסך הכל, טכניקות צביעה אחרים חשובים אף הם על ניתוח תזרים מדויק cytometry. כך למשל, בפרוטוקול זה, השימוש גם 96-V-התחתונה צלחות מאפשר, בנפחים קטנים מרוכזים של תאים ריאגנטים כדי להשתמש בהם לצורך ניתוח של אחוזי MDSC ו ליקוציט באמצעות cytometry הזרימה. השימוש מיקס מאסטר (MM) הגישה גם טכניקה משמעותי עבור תיוג immunofluorescence שווה של leukocytes בכמויות קטנות באמצעות אחת גם 96-V-התחתונה PLאטס או צינורות FACS. טכניקות אלה מפחיתים את הסיכון של זיהום הצלב של דגימות, לשמור על נוגדנים סטריליים ולהפחית את כמות חומרים כימיים המשמשים ונוגדנים.

מפריד Pro autoMACS מאפשרת בידוד יעיל אוטומטי של אוכלוסיות תאים ממדגמים מרובים, מין שהוא. בפרוטוקול זה, תיוג מגנטי עקיפה leukocytes באמצעות GR-1-PE נוגדנים מגנטי PE microbeads משמש להעשרת autoMACS של GR-1 + leukocytes. הליך זה יכול להיות שונה להפרדה autoMACS באמצעות microbeads אחרים נוגדנים ראשוניים fluorochrome-מצומדות, biotinylated ו unconjugated להעשרה של אוכלוסיות תאים שונות 20. עם זאת, הליך זה, מומלץ מאוד להשתמש ב-PE מצומדות נוגדנים נגד PE-microbeads בניגוד FITC למשל, מולקולה PE הוא אמר שיש מספר רב של אתרי הקישור, ובכך וכתוצאה מכך תיוג מגנטי חזק יותר וטוב יותר (Miltenyi BIOTEC ). נוסף עמ 'שינוי ossible לפרוטוקול זה היא השימוש בתוויות מגנטי ישיר מכיוון שיש מגוון רחב של מחשבי Mac microbeads עבור בידוד של העכבר, אנושי leukocytes חולדה (Miltenyi BIOTEC). עם זאת, סימון מגנטי עקיף באמצעות נוגדן fluorochrome-מצומדות העיקרי מאפשר להערכת זרימת cytometry של שברים מועשר או מדולדל ליקוציט ללא צורך מכתים נוסף. יש גם מגוון של הפרדה בין מחשבי Mac זמינים אך מערכת Pro autoMACS מפריד יש יתרון שכן היא מאפשרת למיון, במהירות גבוהה אוטומטית של עד שש דגימות לבחירה עדין של leukocytes קיימא מאוד, בהשוואה מפרידים ידנית מחשבי Mac. עם זאת, הוראות הפרדה בין מחשבי Mac חלופות הולמות מפריד autoMACS Pro, אם הוא זמין. כדי להעשיר עוד יותר נאיבי GR-1 + leukocytes, שינוי פוטנציאל לפרוטוקול זה יהיה להפעיל מחדש את חלק שנאסף באופן חיובי באמצעות טור חדש autoMACS על מפריד autoMACS Pro. העשרהשל GR-1 + הגידול נושאות leukocytes באמצעות מפריד Pro autoMACS לא מומלץ בפרוטוקול זה מאז זה תוצאות הפחתה משמעותית של ההתאוששות של GR-1 שברים כמו תאים אלה נוטים להיצמד עמודות במהלך העשרה לעומת leukocytes נאיביות . על כן, פרוטוקול זה ממליצה איחוד הגידול נושאות leukocytes עבור FACS הבאים המיון של MDSC בת קיימא.

טרום מועשר, נקווה leukocytes נאיביות ונקווה הגידול נושאות leukocytes יכול לשמש ליישומים עתידיים דוגמת למהירות נמוכה FACS מיון לבידוד של אוכלוסיות MDSC. פרוטוקול זה היא תוכננה במיוחד כדי לעקוף FACS מייגע ועדכני המיון של MDSC מעכברים נאיביות, שאמור אחוזים נמוכים משמעותית של MDSC. העשרה AutoMACS של GR-1 + leukocytes מעכברים נאיביות אז FACS מאפשרת הפקודה, נוח ויעיל המיון של MDSC מעשית ופונקציונלית עבור השימוש בהם in vivo ובניסויים במבחנה. מיון ישיר עלוב אוכלוסיות תאים לידי ביטוי כגון MDSC נאיבי הוא תהליך יעיל מאוד פעמים מיון ארוך, עלויות גבוהות התאוששות התא הכדאיות מופחת. הכנה והעשרה autoMACS של GR-1 + leukocytes מעכברים נאיבי לוקח כ 45 דקות ועלייה באחוזי MDSC העולה פי 4 (איור 1). העשרה זו מפחיתה את זמן FACS המיון של כ 12 שעות לא מועשר leukocytes כ 20-30 דקות בידוד של לפחות 6 1x10 קיימא, מועשר MDSC מ leukocytes נאיביות אספו. Leukocytes עם זאת, FACS המיון של MDSC קיימא מן הלא מועשר, אספו מן הגידול נושאות עכברים ידרוש פחות זמן בשל ריבוי מוגבר באחוזים MDSC בתגובה נטל הגידול. חשוב לציין כי leukocytes MDSC אחרים ממוין לאחר מכן ניתן להשתמש בשני מבחני פונקציונליים, כגון תגובות לויקוציטים מעורבת (הקה"ע) in vivo ניסויים העברת המאמצים 21 כמו גם שאינם פונקציונליים, כולל מבחני qRT-PCR 22, מערב כתם 23 ו cytospin / ניתוחים מיקרוסקופיה 14. באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות שונה עבור immunophenotyping ואת העשרת leukocytes מדכאות חיסון אחרים של רקמות הלימפה או הדם ההיקפית של עכברים, חולדות ובני אדם כדי לשמש שפע של in vivo ו ב מבחני חוץ גופית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgements

אנו מכירים cytometry זרימה USF Core Facility. ברצוננו להודות לד"ר דניס קופר על שיתוף משאבים. אנו רוצים גם להודות מאיה כהן, לורה פנדלטון ודיאנה לאטור על עזרתם בהקמת והסרטה של ​​סרט זה. NN נתמך על ידי גשר NSF FG-LSAMP כדי אחוות דוקטורט HRD # 0929435. עבודה זו מומנה על ידי האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן מוסדי מרכז המחקר גרנט # סרטן 93-032-13/Moffitt הוענק TG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
  2. Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
  3. Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
  4. Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
  5. Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
  6. Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
  7. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
  8. Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
  9. Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
  10. Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
  11. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  12. Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
  13. Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
  14. Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
  15. Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
  16. Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
  17. Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
  18. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
  19. Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
  20. Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
  21. Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
  22. Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
  23. Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994 (2009).

Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics