Akım Sitometri ve Otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (AutoMACS) kullanarak Naive ve Pankreas Tümör taşıyan fareler ile myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) hazırlanması

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu myeloid türevi bastırıcı hücreler (MDSC) işaretleyicidir ve Gr-1 zenginleştirmek için hızlı ve kapsamlı bir yöntemdir

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

MDSC olgunlaşmamış makrofajlar, dendritik hücreler ve paraziter enfeksiyon, inflamasyon, travmatik stres, Graft-versus-host hastalığı, diyabet ve kanser de dahil olmak üzere 1-7 patolojik durumlarda lenfoid organlarda birikir granülosit heterojen bir nüfus vardır. Farelerde, MDSC ekspres Mac-1 (CD11b) ve Gr-1 (Ly6G ve Ly6C) yüzey antijeni 7. Bu MDSC de önemli ölçüde genişletilmiş, çeşitli tümör taşıyan konaklar incelenmektedir dikkat ve 7-10 naif muadillerine göre anti-tümör immün yanıtı bastırmak için önemlidir. Ancak, patolojik durumuna bağlı olarak, bastırma 11,12 ile farklı mekanizmaları ve hedefleri ile MDSC farklı alt nüfusları vardır. Bu nedenle, canlı MDSC popülasyonlarının etkin bir yöntem izole etmek için in vitro ve in vivo bastırma onların farklı moleküler mekanizmalar durulaştırmada önemlidir.

Son zamanlarda, Ghansah grubu, bir mürin pankreas kanseri modelinde MDSC genişlemesi rapor etmiştir. Bizim tümör taşıyan MDSC homeostazının kaybı görüntülemek ve naif MDSC 13 oranla baskılayıcı fonksiyonu artmıştır. MDSC yüzdeleri naif vs tümörü taşıyan farelerin lenf bölümlerinde önemli ölçüde azdır. Bu genellikle bu MDSC doğru karşılaştırmalı analizleri engellemektedir büyük bir uyarı vardır. Bu nedenle, önceden Floresans Aktif Hücre Sıralama (FACS) kadar naif farelerden Gr-1 + lökositleri zenginleştiren saflık, canlılığı artırır ve önemli ölçüde sıralama zamanı azaltır. Bu sıralama hızlı FACS için bolca bulunur Ancak, tümör taşıyan farelerin Gr-1 + lökositlerin zenginleştirme isteğe bağlıdır. Bu nedenle, bu protokol, biz MDSC işaretleyicidir ve zamanında MDSC sıralama için naif farelerin dalak gelen Gr-1 + lökositleri zenginleştiren son derece etkili bir yöntem tarif. İmmünokompetent C57BL / 6 fare mürin Panc02 ce ile inoküle edilmiştirLLS subkutan naif fareler 1XPBS alırsınız oysa. Yaklaşık 30 gün aşılama sonrası; dalak hücre ayrışma elek kullanarak tek hücre süspansiyonları içine hasat ve işlenir. Splenositlerin sonra Eritrosit (RBC) parçalanır ve bu lökositlerin bir kısım Akım Sitometri kullanarak immünfenotip MDSC yüzdeleri Mac-1 ve Gr-1 karşı florokrom-konjuge antikor kullanılarak boyandı edilir. Paralel bir deneyde, naif farelerin tüm lökositlerin otomatik Manyetik Aktif Hücre Sıralama (autoMACS) Pro Separator kullanarak PE-mikro inkübe ve olumlu seçilen floresan konjuge Gr-1 antikorları ile boyanan. Sonra, Gr-1 + lökositlerin bir kısım Akım Sitometri kullanarak MDSC oranlarda artış tanımlamak için Mac-1 antikorları ile boyanan. Şimdi, bu Gr1 + zenginleştirilmiş lökositler in vivo ve in vitro (naif vs tümör taşıyan) karşılaştırmalı analizlerde kullanılmak üzere MDSC sıralama FACS hazır

Protocol

Başlamadan önce, aşağıdaki çözümleri hazırlamak:

% 3 Boyama Media (SM):

1X Phosphate Buffer Saline -3% Fetal Bovine Serum (FBS) (PBS)

MACS Buffer (MB):

- 1XPBS içinde Bovine Serum (BSA) 0.5% Albumin

1. Fare ile Hasat dalak

  1. (; TB tümör taşıyan) subkutan 1.5 x Panc02 10 5 fare hücrelerini 100 ul 1x PBS asılı olan yaş C57BL 6-8 hafta / 6 fareleri (Harlan) enjekte edilir. Kontrol fareler (naif) 100 ul 1XPBS alırsınız.
  2. Yaklaşık 4 hafta sonra enjeksiyon, karbon dioksit asfiksisi ile farelerde euthanize.
  3. Forseps ve makas kullanılarak künt diseksiyon ile farelerin Hasat dalak sonra denge ağırlıklarından yararlanılarak. Ayrı yerde dalak, 1 x PBS içeren 50 ml'lik konik tüpler etiketli.

2. Tek hücreli Suspensio üretdalak gelen lökositler n

Tüm işlemler bir Biyolojik Güvenlik Hood ve buz üzerinde tutulmalıdır hücreleri ve antikorların altında steril bir ortamda yapılmalıdır.

  1. Dibe doğru bardağı ağzına örgü ekran ekleyerek hücre ayrışma elek birleştirin. Sonra, oluklu tarafı dişli alana istinat halkası eklemek ve böylece yerinde ekranı tutan istinat bileziğini sıkmak için halka tuşunu kullanın. 10 ml 1 x PBS içeren Petri içinde monte elek yerleştirin.
  2. Havuz dalak ve kullanım cam havaneli hücre ayrışma elek mesh ekrana ve Petri kabına dalak öğütmek için. Farelerin her tedavi grubu için tekrarlayın.
  3. Bir 70 um hücre süzgecinden ve 5 ml serolojik pipet kullanılarak bir 50 ml konik tüpe Filtre hücre süspansiyonu. 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) santrifüjleyin.
  4. Dalak başına 5 ml 1 x RBC parçalama tamponunda süpernatan ve Pastör pipetiyle pelet Kaldır. Pipet yukarı ve aşağı şiddetle. 5 dk için oda sıcaklığında inkübe edilir. 1 x 20 ml PBS ilave edilerek reaksiyon durdur. Pipet yukarı ve aşağı şiddetle. 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) santrifüjleyin.
  5. 20 ml steril 1 x PBS süpernatan ve Pastör pipetiyle pelet çıkarın. Pipet yukarı ve aşağı şiddetle.
  6. 50 ul 5x10 5-1x10 6 hücreleri (- 2x10 7 hücre / ml 1x10 7 hücre / ml) 'e denk olacak şekilde tripan mavi ve% 3 SM istenen konsantrasyonda bir hemasitometre ile Pastör pipetiyle kullanılarak hücreleri hesaplama.

3. Akım Sitometri kullanarak MDSC Hücre yüzey Boyama / İmmünofenotipleme

  1. (; Mac-1-FITC; Gr-1-APC ve DAPI No Leke, NS) kontrolü ve dengeleme kontroller için deneysel örnekleri ve tek bir leke için bir 96-kuyucuklu V alt levhanın kuyuları etiketlemek.
  2. 96-kuyulu plakalı V-altlı in / kuyu kendi kuyucuklara splenositlerin 50 ul eşdeğer 5x10 5-1x10 6 hücreleri ekleyin. Santrifüj5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) plakası.
  3. Buz üzerinde 1.5 ml mikrosantrifüj tüp,% 3 SM inceltilmiş Fare BD Fc Bloğu (Sıçan anti-fare CD16/32 monoklonal antikor) ve "Master Mix" (MM) hazırlayın. Bir başlangıç ​​noktası olarak, başına iyi, 50 ul son bir birim için% 3 SM 1 mikrogram Fc Blok kullanın.
  4. Dikkatle hücre peletlerin kesinti olmadan bir atık konteyner veya lavabo üzerinde, üzerinde hızla geri ters plakası tarafından 96-kuyucuklu V-altlı plakanın her gelen süpernatan kaldırmak ve.
  5. Vortex, kısaca 5 saniye Fc Blok MM santrifüj ve 96-V-alt plaka tüm peletlerine 50 ul ekleyin. Yavaşça kendi kuyularında örnekler bırakarak, aşağı yukarı pipetleme tarafından iyice karıştırınız. Buz üzerinde karanlıkta 15 dakika süreyle plaka inkübe. 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) plakası santrifüjleyin.
  6. Örnekleri Fc Blok ile inkübe ise, buz üzerinde bir 1.5ml mikrosantrifüj tüp içinde% 3 SM inceltilmiş florokrom-konjuge antikor "Master Mix" (MM) hazırlayın. Antikorlar titre edilmelidirboyama işlemleri için optimal seyreltme belirlemek için. Bir başlangıç ​​noktası olarak, iyi örnek başına 50 ul son hacim% 3 SM bir 1:25 Mac-1-FITC seyreltme ve Gr-1-APC 01:20 seyreltme birleştirir.
  7. Daha önce tarif edildiği gibi dikkatli bir şekilde 96-kuyucuklu V-altlı her bir yanı ile süpernatan kaldırın.
  8. Vortex, kısaca 5 saniye için floresan-konjuge antikor boyama MM santrifüj ve kontrol ve deney peletlerine 50 ul ekleyin. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Tek-leke tazminatlar için, oyuk başına 50 ul son hacim% 3 SM yağmurluk-1-FITC ile 1:25 seyreltme, Gr-1-APC ve 75 ng / ml 'lik DAPI 01:20 seyreltme, ekleme kendi kuyucuklara. (Hayır Leke) iyi lekesiz için 50 ul% 3 SM ekleyin. İyice karıştırılır ve buz üzerinde koyu içinde 30 dakika süreyle 96-kuyulu plakalı V-altlı hücreleri inkübe edilir.
  9. Etiket FACS borular (5 ml, 12 mm x 75 mm polistiren tabanı yuvarlak bir tüp) 96-kuyulu plakalı V-altlı her bir kuyucuğa karşılık. Her FACS üzere 200 ul% 3 SM eklemetüp.
  10. 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) plakası santrifüjleyin ve süpernatantlar çıkarın. Her pelet için 100 ul% 3 SM ekleyerek pelet yıkayın ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) plakası santrifüjleyin. Bir kez daha adım yıkayın tekrarlayın.
  11. Daha önce tarif edildiği gibi dikkatli bir şekilde 96-kuyucuklu V-altlı her bir yanı ile süpernatan kaldırın. 100 ul% 3 SM her pelletini ve iyice karıştırın.
  12. Bunların sırasıyla etiketli FACS tüpe 96-kuyucuklu V-altlı plakanın her 100 ul tekrar süspanse pelet transfer edin.
  13. Flow sitometri analizi öncesinde, 75 ng / ml DAPI kontrol etmek ve deneysel örnekler ve DAPI tek bir leke kompanzasyon kontrolü ekleyin.
  14. MDSC yüzdeleri flow sitometri veri toplama gerçekleştirin. Negatif (hiç leke kontrol) ve tek pozitif kontrolleri kullanarak tazminat gerçekleştirin. Böylece günlük ölçekte ileri (FSC) karşı tarafında dağılım (SSC) görüntüleyen bir nokta komplo kurmak ve lökositilgi tespit edilebilir. Enkaz ve en ileri ve yana yayılım ile topaklar hariç tüm lökositlerin büyük bir kapı çizin. Bu ana kapıdan, DAPI-(canlı) hücreleri üzerine SSC karşı DAPI ve kapı görüntüleyen yeni bir nokta arsa oluşturun. Bu yeni bağımlı nüfus seçin ve çift pozitif Mac-1 karşı Gr-1 ve kapı görüntüleyen bir nokta komplo oluşturmak (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC.

4. Gr-1 + Lökosit Manyetik Zenginleştirme

  1. 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) de uygun şekilde etiketlenmiş FACS tüpleri ve santrifüj içine tablet 1x10 7 kalan boyasız lökositlerin.
  2. 1.5 ml mikrosantrifüj tüp Gr-1-PE antikor MM hazırlayın. 10 7 hücre için, numune başına, 50 ul MB Gr-1-PE antikor 1:10 seyreltme kullanın. Daha fazla hücre sayıları için, buna göre hacimleri büyütmek. Kısaca, 5 saniye süreyle santrifüj FACS tüpler lökositlerin eklemek ve 4 15 dakika ° C'de karanlıkta inkübe edin. 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) de FACS tüpleri, santrifüj MB 2 ml ekleyin ve supernatant atın.
  3. 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü Anti-PE mikroboncuk MM hazırlayın. 10 7 hücre için, numune başına, 200 ul MB anti-PE mikroboncuk bir 1:4 dilüsyonu kullanın. Daha fazla hücre sayıları için, buna göre hacimleri büyütmek. Kısaca, 5 saniye süreyle santrifüj FACS tüpler lökositlerin eklemek ve 4 15 dakika ° C'de karanlıkta inkübe edin.
  4. 5 dakika 12.000 rpm (250-300 xg) de FACS tüpleri, santrifüj MB 2 ml ekleyin ve supernatant atın. SB 3 ml Pastör pipetiyle pelet. Yeni, etiketli 50 ml konik bir tüpe 70 mikron süzgeç süzülür.
  5. Hazırlayın ve prime Otomatik MACS Pro Separator. Uygun çözümler ve boş atık şişe ile Dolum tüm şişeler, gerekirse. Enstrüman açın ve sıvı kapları ve başlatmasından sonra kolon (lar) ın durumunu incelemek. Bütün semboller yeşil renkte olmalıdır. Menüsünde, üst gelen "Ayrılık" ı seçinardından menü çubuğu alt menü çubuğundan "Şimdi yıkayın". Astarlama işlemini başlatmak için "Çalıştır" ardından pop-up seçeneği "yıkayın" seçeneğini seçin. Çimlendirme süreci başarıyla tamamlandığında, cihaz o Durum menüsü altında "Ayrılık için hazır" olduğunu gösterecektir.
  6. Satır B negatif fraksiyon toplama ve satır C. pozitif fraksiyon toplanması için 15 ml konik tüp için bir satır, 50 ml konik tüp manyetik etiketli hücreleri ile tüp boyutları ve yeri için uygun soğutulmuş tüpü rakı 50 ml konik tüp seçin
  7. Örneklerinden duyarlı modda etiketli hedef hücrelerin pozitif seçimi için "POSSEL_S" hücre ayırma programı seçin. Manyetik etiketli hedef hücreler otomatları sütun üzerinde korunur; etiketsiz hücrelerin mıknatısın otomatik çekilmesi üzerine satır B'de negatif fraksiyon toplama tüpüne bırakılır, etiketli hedef hücreler tüp satır C pozitif toplama tüpüne çıkacak raf.

+ Zenginleştirilmiş Lökositler Post-Sıralama Analizi

  1. Gr-1 Recount + ve Gr-1 - tripan mavi ve hemasitometre kullanarak kesirler. % 3 boyama ortam içinde istenen konsantrasyonda Pastör pipetiyle hücreleri 50 ul 5x10 5-1x10 6 hücreleri (1x10 7 hücre / ml - 2x10 7 hücre / ml) 'e denk olacak şekilde ve buna uygun olarak etiketlenmiş FACS tüpler 50 ul transfer.
  2. Örnek başına 50 ul'lik bir son hacim% 3 SM bir 01:25 seyreltildiğinde, sadece Mac-1 bir MM hazırlayın. Hücreleri Leke ve akım sitometri analizi için Gr-PE, Mac-1 FITC ve DAPI tek leke tazminatlar hazırlamak. 200 ul% 3 SM ve DAPI canlılığı boya maddesi olarak daha önce tarif ekleyin.
  3. Yüzdeler ve ayrıca pre ve post-autoMACS zenginleştirme MDSC yüzdeleri karşılaştırmak için - Gr-1 + ve Gr-1 belirlemek için akım sitometri veri toplama gerçekleştirin.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Burada r göstermek MDSC (Şekil 1) sıralama sonraki FACS için toplandı, naif dalak gelen Gr-1 + lökositlerin autoMACS zenginleşmesi için epresentative sonuçlar. 1x10 6 naif lökositlerin önce autoMACS sıralama, BD LSRII alet kullanarak MDSC yüzdeleri tespit etmek Mac-1-FITC ve Gr-1-APC antikorları ile boyandı. 1x10 7 naif lökositlerin sonra bir autoMACS Pro Ayırıcı kullanarak Gr-1 + lökositlerin zenginleştirilmesi için anti-Gr-1-PE antikorlar ve PE-mikro ile boyandı. Post-autoMACS zenginleştirme, Gr-1 Gr-1 yüzdeleri + ve Gr-1 - Toplanan kesirler akım sitometri kullanılarak değerlendirildi. 1x10 6 Gr-1 + lökositleri akım sitometri ile tümör taşıyan lökositlerin toplanmış olmayan zenginleştirilmiş için naif lökositlerin toplanmış zenginleştirilmiş MDSC yüzdeleri, analiz etmek ve karşılaştırmak için Mac-1-FITC antikoru ile çıkarıldı ve boyandı.

fig1.jpg "/>
Sıralama MDSC FACS için naif Gr-1 + lökositlerin Şekil 1. AutoMACS zenginleştirme. Dalak pankreas tümörü taşıyan ve naif farelerin hasat ve tek hücre süspansiyonları içine işlendi. Naif lökosit yüzey Flow sitometri analizi öncesinde autoMACS zenginleştirme (A), Mac-1 ve Gr-1 floresan-konjuge antikor ile boyandı. Akış sitometrisi Gr-1 analizi + (B) ve Gr-1 - Gr-1-PE antikor ve anti-PE mikro-küreler ile boyanmış havuzlanmış saf leuckocytes gelen Gr-1 + hücrelerinin (C) fraksiyonlar post-autoMACS zenginleştirme. MDSC ve Gr-1 Flow sitometri analizi Gr-1 + yüzdeleri sonrası autoMACS zenginleştirme Tümör taşıyan farelere (E) olmayan zenginleştirilmiş toplanmış lökosit (naif fareler, n = 5 göre toplanmış naif lökosit (D) + hücre ; tümörü taşıyan farelere, n = 3). MDSC ve Gr-1 yüzdeleri temsilcisi kontur araziler ve histogramları ortasında korunaklı vardır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu, çeşitli hayvan modellerinde farklı lenf dokuları için de geçerlidir MDSC popülasyonlarının işleme ve immunophentyping için ayrıntılı bir yöntemdir. Özellikle, autoMACS zenginleştirme splenositlerin 4 Gr-1 azalması, dalak ve lenf düğümleri 5 ila myeloid alt saflaştırılması, CD8 kemik iliği nötrofiller 14 izolasyonu ve saflaştırılması + dalak den T hücreleri dahil olmak üzere çeşitli lökosit izolasyonu için kullanılabilir ve lenf düğümleri 15. Bağımsız olarak ilgi hücre popülasyonunun, istenen lenf dokularından lökositlerin tek hücre süspansiyonları üreten optimal yüzey boyama, akış sitometresi analizi, autoMACS zenginleştirme ve FACS sıralama için gereklidir. Bu protokolde, bu lökositlerin tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için mekanik bir ayrılma kullanılır. Ancak, bu tür Kollajenaz D gibi enzim kullanarak da artırmak için bu protokole uygun bir alternatiftirdalak ya da başka organ lenfoid 5 ila lökositler verimi.

Flow sitometri immünofenotipleme lökositler için önemli bir tekniktir. Bu nedenle, akış sitometresi ile çeşitlendirilmesi için yeterli bir preparasyon, hücre süspansiyonu ve antikor reaktiflerin seyreltme için uygun tamponlar kullanımını gerektirir. Boyama medya ve MACS tamponu hazırlamak için FBS ve BSA arasında alternatif Birçok protokolleri. Bununla birlikte, bu tür çözeltiler eBioscience, BD Pharmingen ve Miltenyi Biotec gibi şirketler, ticari olarak temin edilebilir. Florokrom-konjuge antikor ile lökosit boyama olduğu gibi Miltenyi Biotec ve eBioscience tarafından açıklandığı gibi, BSA ve FBS hem de non-spesifik bağlayıcı engeller. Daha da önemlisi, bu hayvan, serum proteinlerinin düşük yüzdelerde canlılığını korumak ve lökositlerin 16 Topaklanmaması. Ancak, deneyimlerimizden, BSA FBS daha autoMACS zenginleştirme için en uygun boyama ve daha iyi çözünürlük için daha iyi çalışır ve öneriler iseaçıklanan protokol ded.

Bu protokol, biz CD11b-FITC ve Gr-1-APC floresan-konjuge antikor ve akım sitometri kullanarak fare MDSC karakterizedir. Bu optimum olmayan sonuçları engellemek için yüksek arka plan floresan boyama azaltmak için kullanmadan önce bu antikorlar titre zorunludur. Buna ek olarak, çok renkli akış sitometrisi analizi için antikorlar seçilirken, florokromlar olası spektral örtüşme da 17,18 olarak kabul edilebilir bir başka önemli bir faktördür. Bu nedenle, telafi, ilgi ya da karşılık kordonlarının herbirinde fluorochome bağlı antikor için, tek renkli lekelerin formunda kontrol spektral bindirme 18 sorunları gidermek için olabilir. Doğru akış sitometrisi sonuçlar için başka bir önemli husus canlılığı boyaların kullanımıdır. Ölü hücreler non-spesifik böylece yanlış pozitif sonuçlar 19 yaratma, antikorlar bağlayabilirsiniz. Bu protokol, biz bir canlılık boya leke olarak nükleik asit, DAPI kullanınen iyi minimum spektral örtüşme ile kullanılan florokrom-konjuge antikor paneli tamamlar olarak analizler ölü hücreleri dahil değildir. Bununla birlikte, bu tür 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) ve propidyum iyodür (PG) gibi diğer yaşayabilirliği boyalar kullanılan antikorlar paneli bağlı olarak tarif boyama yöntemi ile birlikte kullanılabilir. Şu anda, boyalı hücrelerin canlılığı (Invitrogen) ayırt etmek yeteneğini kaybetmeden sabit ve permeabilize izin edinilebilir tamir edilebilir ölü hücre lekeleri bir dizi de vardır. Genel olarak, diğer boyama teknikleri doğru akım sitometri analizi için de önemlidir. Örneğin, bu protokolde, 96-kuyucuklu V-altlı levhalarının kullanılması hücreleri ve akış sitometresi kullanılarak MDSC ve lökosit yüzdeler analizi için kullanılacak reaktiflerin küçük, yoğun birimleri için olanak sağlar. Master Mix (AA) kullanımı yaklaşımı da ya 96-V-alt pl kullanarak küçük hacimlerde lökositlerin eşit immünofloresan etiketlenmesi için önemli bir tekniktirates veya FACS Tüpler. Bu teknikler, örneklerin çapraz bulaşma riskini azaltmak steril antikorlar korumak ve kullanılan reaktifler ve antikor miktarını azaltır.

AutoMACS Pro Ayırıcı herhangi bir türün birden çok örneklerinde hücre popülasyonlarının verimli ve otomatik izolasyon sağlar. Bu protokolde, Gr-1-PE antikorlar ve manyetik PE mikroküreler kullanılarak lökositlerin dolaylı manyetik etiketleme Gr-1 + lökositlerin autoMACS zenginleştirme için kullanılır. Bu prosedür çeşitli hücre popülasyonlarının 20 zenginleşmesi için diğer florokrom-konjuge, biyotin ve indirekt primer antikorlar mikro kullanarak autoMACS ayrılması için değiştirilebilir. PE molekülü çoklu bağlanma bölgeleri olduğu söyleniyor Ancak, bu prosedürde, biz son derece böylece daha güçlü ve daha iyi manyetik etiketleme (Miltenyi Biotec sonuçlanan gibi örneğin FITC karşı PE-konjuge antikor ve anti-PE-mikro kullanmanızı öneririz ). Başka bir pinsan, fare ve sıçan lökositlerin (Miltenyi Biotec) ve izolasyon için MACS mikroboncuk, çok çeşitli olduğu gibi, bu protokolüne ossible modifikasyonu doğrudan manyetik etiketleme kullanımıdır. Bununla birlikte, bir florokrom-konjuge primer antikor kullanılarak dolaylı manyetik etiketlenmesi ilave boyanması için gerek kalmadan zenginleştirilmiş ya da seyreltilmiş lökosit fraksiyonlarının akış sitometrisi değerlendirilmesi için olanak sağlar. MACS kullanılabilir Ayırıcılar ancak el MACS Ayırıcıları ile karşılaştırıldığında son derece canlı lökositlerin nazik seçimi için altı kadar numune yüksek hızlı, otomatik sıralama için izin verdiği autoMACS Pro Ayırıcı Sistem avantajlı bir dizi vardır. Varsa Ancak, manuel MACS Ayırıcılar, autoMACS Pro Ayırıcı uygun alternatiflerdir. Daha naif Gr-1 + lökositler, bu protokol için potansiyel bir değişiklik zenginleştirmek için autoMACS Pro Separator yeni bir autoMACS sütunu kullanarak olumlu toplanan fraksiyonu yeniden çalıştırmak olacaktır. ZenginleştirmeBu hücrelerin saf lökosit göre zenginleştirme sırasında sütunları için sopa eğilimindedir olarak Gr-1 autoMACS Pro Ayırıcı kullanarak + tümör taşıyan lökositlerin Gr-1 fraksiyonların kurtarma önemli azalma Bu sonuç beri bu protokolde tavsiye edilmez . Bu nedenle, bu protokol güçlü canlı MDSC sıralama sonraki FACS için tümör taşıyan lökositlerin havuzu önerir.

Ön zenginleştirilmiş, saf lökosit toplanmış ve tümör taşıyan lökositler gibi MDSC nüfus izolasyonu için sıralama düşük hızda FACS olarak gelecekteki uygulamalar için kullanılabilecek havuz. Bu protokol özellikle MDSC anlamlı derecede düşük yüzdeler nedeniyle naif fareler, gelen MDSC sıralama sıkıcı ve zamanında FACS aşmak için tasarlanmıştır. Naif farelerin Gr-1 + lökositlerin AutoMACS zenginleştirme sonra in vivo kendi kullanımı için yaşayabilir ve işlevsel MDSC sıralama, hızlı uygun ve verimli FACS sağlar vein vitro deneylerde. Böyle naif MDSC gibi asılıyor ifade eden hücre popülasyonlarının Doğrudan sıralama uzun sıralama kez, yüksek maliyetler ve azalan hücre kurtarma ve canlılığı ile çok verimsiz bir süreçtir. Naif farelerin hazırlanması ve Gr-1 + lökositlerin autoMACS zenginleştirme yaklaşık 45 dakika ve 4 kat (Şekil 1) daha MDSC yüzdeleri daha fazla artış alır. Bu zenginleşme toplanmış naif lökositlerden en az 1x10 6 yaşayabilir, zenginleştirilmiş MDSC izolasyonu için yaklaşık 20-30 dakika olmayan zenginleştirilmiş lökositler için yaklaşık 12 saat sıralama FACS süresini azaltır. Tümör taşıyan farelerin Ancak, sigara zenginleştirilmiş gelen canlı MDSC sıralama FACS, toplanmış lökosit tümör yükü karşısında MDSC yüzdeleri artan bir bolluk nedeniyle daha az zaman gerektirir. Bu sıralanır MDSC ve diğer lökositler gibi sonra karışım lökosit reaksiyonları (MLR) gibi her iki fonksiyonlu deneylerde kullanılan dikkat etmek önemlidir in vivo evlatlık transferi deneylerinde 21 gibi QRT-PCR 22, Western Blot 23 ve Sitospin / mikroskopi analizleri 14 dahil non-fonksiyonel testler gibi. Genel olarak, bu protokolü immunfenotipleme ve in vivo ve in vitro deneylerde bir bolluk kullanılmak üzere, fare, sıçan ve insan gelen lenf dokuları veya periferal kandan immunosupresif ve diğer lökositlerin zenginleştirmek için değiştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Biz USF Akım Sitometri Çekirdek Tesisi kabul ediyorsunuz. Biz kaynaklarının paylaşımı için Dr Denise Cooper teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca kurma ve bu video filme kendi yardım için Maya Cohen, Laura Pendleton ve Diana Latour teşekkür etmek istiyorum. NN Doktora Bursu HRD # 0929435 NSF FG-LSAMP Köprüsü tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma TG verilen Amerikan Kanser Derneği Kurumsal Araştırma Bursu # 93-032-13/Moffitt Kanser Merkezi tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
  2. Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
  3. Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
  4. Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
  5. Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
  6. Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
  7. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
  8. Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
  9. Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
  10. Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
  11. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  12. Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
  13. Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
  14. Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
  15. Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
  16. Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
  17. Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
  18. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
  19. Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
  20. Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
  21. Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
  22. Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
  23. Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994 (2009).

Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics