Preparazione di cellule derivate mieloidi soppressore (MDSC) da Naive e Pancreatiche topi affetti da tumore in citometria a flusso e di smistamento automatico magnetico cellulare Attivato (AutoMACS)

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Summary

Questo è un metodo rapido e completo di immunofenotipizzazione cellule derivate mieloidi soppressore (MDSC) e arricchimento Gr-1

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Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

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Abstract

MDSC sono una popolazione eterogenea di macrofagi immature, cellule dendritiche e granulociti che si accumulano negli organi linfoidi in condizioni patologiche tra cui infezioni parassitarie, infiammazioni, stress traumatico, graft-versus-host disease, il diabete e il cancro 1-7. Nei topi, MDSC express Mac-1 (CD11b) e GR-1 (Ly6G e Ly6C) antigeni di superficie 7. È importante notare che MDSC sono state ampiamente studiate in vari portatori di tumore host dove vengono notevolmente aumentato e sopprimere le risposte immunitarie anti-tumorali rispetto alle controparti naive 7-10. Tuttavia, a seconda della condizione patologica, vi sono differenti sottopopolazioni di MDSC con meccanismi distinti e gli obiettivi di soppressione 11,12. Pertanto, i metodi efficaci per isolare vitali popolazioni MDSC sono importanti nel chiarire loro diversi meccanismi molecolari di soppressione in vitro e in vivo.

Recentemente, il Ghansah gruppo ha riportato l'espansione di MDSC in un modello murino cancro pancreatico. Il nostro portatore di tumore MDSC visualizzare una perdita di omeostasi e di aumento della funzione soppressiva rispetto al ingenua MDSC 13. MDSC percentuali sono significativamente meno in compartimenti linfoidi di topi naive contro tumore-cuscinetto. Si tratta di un avvertimento importante, che ostacola spesso accurate analisi comparativa di questi MDSC. Pertanto, arricchendo Gr-1 + leucociti dai topi naive prima Fluorescence activated cell sorting (FACS) esalta la purezza, la vitalità e riduce significativamente il tempo di ordinamento. Tuttavia, l'arricchimento del Gr-1 + leucociti da topi affetti da tumore è facoltativo in quanto questi sono in abbondanza per FACS veloci ordinamento. Pertanto, in questo protocollo, si descrive un metodo molto efficiente di immunofenotipizzazione MDSC e arricchire Gr-1 + leucociti da milze di topi naive per l'ordinamento MDSC in modo tempestivo. Immunocompetenti topi C57BL / 6 vengono inoculate con murino Panc02 ceLLS per via sottocutanea mentre i topi naïve ricevere 1XPBS. Circa 30 giorni dopo l'inoculazione, milza vengono raccolti e trasformati in cella singola sospensioni utilizzando una cella di dissociazione setaccio. Splenociti sono poi globuli rossi (RBC) lisati e un'aliquota di questi leucociti sono testate in base fluorocromo-coniugati anticorpi contro Mac-1 e Gr-1 a percentuali immunofenotipo MDSC citometria a flusso. In un esperimento parallelo, leucociti interi da topi naive sono macchiati coniugate con quelle fluorescenti-Gr-1 incubate con anticorpi, PE-microsfere e positivamente selezionato utilizzando un sistema automatizzato di smistamento magnetico cellulare Attivato (autoMACS) Pro Separator. Successivamente, una aliquota di GR-1 + leucociti vengono colorate con anticorpi Mac-1 per identificare l'aumento percentuale MDSC citometria a flusso. Ora, queste GR1 + leucociti arricchiti sono pronti per FACS cernita di MDSC da utilizzare in analisi comparative (naïve vs portatore di tumore) in vivo e in vitro

Protocol

Prima di iniziare, preparare le seguenti soluzioni:

3% colorazione Media (SM):

-3% Siero fetale bovino (FBS) in 1X tampone fosfato salino (PBS)

MACS Buffer (MB):

- 0,5% di albumina da siero bovino (BSA) in 1XPBS

1. Harvest milza di topi

  1. Iniettare per via sottocutanea 6-8 settimane di età C57BL / 6 topi (Harlan) con 1,5 x 10 5 cellule murine Panc02 sospesi in 100 microlitri di PBS 1x (portatore di tumore, TB). Topi di controllo (Naïve) ricevono 100 1XPBS pl.
  2. Circa 4 settimane dopo l'iniezione, i topi eutanasia per asfissia di anidride carbonica.
  3. Harvest milza di topi per via smussa con pinze e forbici, quindi pesare con una bilancia. Luogo in separata milza, etichettato provette da 50 ml coniche contenenti 1 x PBS.

2. Generare una cella singola Suspension dei leucociti da milze

Tutte le operazioni devono essere eseguite in un ambiente sterile sotto una cappa di protezione biologica e le cellule e gli anticorpi tenuti su ghiaccio.

  1. Montare la dissociazione cellulare setaccio inserendo lo schermo maglia nell'apertura del bicchiere verso il basso. Quindi, inserire l 'anello nella zona filettata con il lato scanalato e utilizzare il key ring per stringere l'anello di sostegno, tenendo così lo schermo in posizione. Posizionare il setaccio montato in una piastra Petri 10 ml contenente 1 x PBS.
  2. Milza piscina e pestello in vetro uso per macinare milza contro lo schermo maglie della cellula setaccio dissociazione e nella piastra di Petri. Ripetere l'operazione per ciascun gruppo di trattamento di topi.
  3. Sospensione cellulare filtro in una provetta da 50 ml con un colino cella 70 micron e una pipetta da 5 ml sierologica. Centrifugare a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 min.
  4. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 5 ml 1 x tampone di lisi per RBC milza. Pipettare su e giù con forza. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Arrestare la reazione aggiungendo 20 ml di 1 x PBS. Pipettare su e giù con forza. Centrifugare a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 min.
  5. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 20 ml 1 x PBS sterile. Pipettare su e giù con forza.
  6. Contare le cellule con tripan blu e un emocitometro e risospendere alla concentrazione desiderata in 3% SM in modo che 50 pl è equivalente a 5x10 5-1x10 6 cellule (1x10 7 cellule / ml - 2x10 7 cellule / ml).

3. Cell-superficie colorazione / Immunofenotipizzazione MDSC della citometria a flusso

  1. Etichettare i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti fondo a V per il controllo e campioni sperimentali e macchie singole per i controlli di compensazione (No Stain, NS, Mac-1-FITC; Gr-1-APC e DAPI).
  2. Aggiungere 5x10 5-1x10 6 cellule equivalenti a 50 pl / pozzetto di splenociti ai relativi pozzetti in 96-ben-V piastra inferiore. CentrifugaPiastra a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 min.
  3. Preparare "Mix Master" (MM) di Mouse BD Fc Block (Rat anti-topo CD16/32 anticorpo monoclonale) diluito in 3% SM, in una provetta 1,5 ml su ghiaccio. Come punto di partenza, utilizzare 1 Block ug Fc in 3% SM per un volume finale di 50 pl, per pozzetto.
  4. Rimuovere con cautela il surnatante da ogni pozzetto del 96 e V-bottom piastra invertendo rapidamente la piastra sopra e ritorno, su un contenitore per rifiuti o nel lavandino, senza interruzione dei pellet cellulari.
  5. Vortex, centrifugare brevemente MM Block Fc per 5 secondi e aggiungere 50 microlitri a tutti i pellets in ben 96 V-piastra inferiore. Mescolare bene pipettando gentilmente su e giù, lasciando i campioni nei pozzetti. Incubare la piastra per 15 minuti al buio su ghiaccio. Centrifugare piastra a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 min.
  6. Preparare "Mix Master" (MM) di anticorpi coniugati con fluorocromo diluito in 3% SM in una provetta 1,5 ml su ghiaccio, mentre i campioni incubare con blocco Fc. Gli anticorpi devono essere titolatodeterminare diluizioni ottimali per procedure di colorazione. Come punto di partenza, combinare una diluizione 1:25 di Mac-1-FITC e 1:20 diluizione di Gr-1-APC in 3% SM per un volume finale di 50 pl, per pozzetto.
  7. Rimuovere attentamente surnatante da ciascun pozzetto della ben-96 V-basso come precedentemente descritto.
  8. Vortex, centrifugare brevemente MM di fluorescenza anticorpi coniugati colorazione per 5 secondi e aggiungere 50 microlitri di controllo e pellets sperimentali. Mescolare bene pipettando gentilmente su e giù. Per singola macchia compensazioni, aggiungere una diluizione 1:25 di Mac-1-FITC, 1:20 diluizione di Gr-1-APC e 75 ng / ml di DAPI, 3% in SM per un volume finale di 50 pl per pozzetto a relativi pozzetti. Aggiungere 50 microlitri SM 3% senza macchia e (senza macchia). Mescolare bene e incubare cellule in ben 96 V-piastra inferiore per 30 minuti al buio in ghiaccio.
  9. FACS Etichettare provette (5 ml, 12 mm x 75 mm provette di polistirene a fondo tondo) per corrispondere a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti V-basso. Aggiungere 200 ul SM 3% ad ogni FACStubo.
  10. Centrifugare piastra a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 minuti e rimuovere supernatanti. Lavare pellet aggiungendo 100 microlitri SM 3% ad ogni pellet e mescolare bene pipettando gentilmente su e giù. Centrifugare piastra a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 min. Ripetere ancora una volta la fase di lavaggio.
  11. Rimuovere attentamente surnatante da ciascun pozzetto della ben-96 V-basso come precedentemente descritto. Risospendere ogni pellet in 100 SM ul 3% e mescolare bene.
  12. Trasferire 100 pl pellet risospeso da ciascun pozzetto della 96-ben-V piastra inferiore alla loro tubo rispettivamente etichettati FACS.
  13. Prima analisi del flusso di citometria, aggiungere 75 ng / ml DAPI per il controllo e campioni sperimentali e di controllo DAPI singola macchia di compensazione.
  14. Eseguire flusso di acquisizione di dati di citometria percentuali MDSC. Eseguire la compensazione utilizzando il negativo (nessun controllo macchia) e dei controlli singoli positivi. Impostare un dot plot che visualizza il forward scatter (FSC) rispetto a lato (SSC) in scala logaritmica, in modo che le popolazioni di leucocitiinteresse possono essere identificati. Disegnare un grande cancello su tutti i leucociti, ad eccezione detriti e macchie con il più basso in avanti e scatter laterale. Da questa porta principale, creare un nuovo grafico che visualizza dot SSC contro DAPI e cancello il DAPI-(live) delle cellule. Selezionare questa popolazione di recente gated e creare un dot plot che visualizza Mac-1 contro Gr-1 e porta sul doppio positive (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC.

4. Arricchimento magnetica del GR-1 + Leucociti

  1. Aliquote 1x10 7 leucociti rimanenti non colorati in tubi opportunamente etichettati FACS e centrifugare a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 min.
  2. Preparare MM di Gr-1-PE anticorpo in una provetta da 1,5 ml. Per un massimo di 10 7 celle, utilizzare una diluizione 1:10 del Gr-1-PE anticorpi in 50 MB pl, per campione. Per il numero di cellule più grandi, scalare i volumi di conseguenza. Brevemente centrifugare per 5 secondi, aggiungere a leucociti in tubi FACS e incubare per 15 min a 4 ° C al buio. Aggiungere 2 ml di MB ai tubi FACS, centrifugare a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
  3. Preparare MM di Anti-PE microsfere in una provetta 1,5 ml. Per un massimo di 10 7 celle, utilizzare una diluizione 1:04 di anti-PE microsfere in 200 MB pl, per campione. Per il numero di cellule più grandi, scalare i volumi di conseguenza. Brevemente centrifugare per 5 secondi, aggiungere a leucociti in tubi FACS e incubare per 15 min a 4 ° C al buio.
  4. Aggiungere 2 ml di MB ai tubi FACS, centrifugare a 12.000 rpm (250-300 xg) per 5 minuti ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet in 3 ml di SB. Filtrare attraverso un colino 70 micron in un nuovo, etichettato tubo da 50 ml.
  5. Preparare e prime Auto MACS Separator Pro. Refill tutte le bottiglie con le soluzioni più appropriate e svuotare la bottiglia dei rifiuti, se necessario. Accendere strumento ed esaminare lo stato dei contenitori di liquidi e di colonna (s) dopo l'inizializzazione. Tutti i simboli dovrebbero essere di colore verde. Nel menu, selezionare "separazione" dal superiorebarra dei menu seguito da "Wash Now" dalla barra dei menu inferiore. Selezionare "Risciacquare" dal pop-up opzione seguito da "Run" per avviare il processo di adescamento. Una volta che il processo di adescamento è completata con successo, lo strumento visualizzerà quindi che si tratta di "Ready for Separation" sotto il menu Stato.
  6. Scegli adatto a cremagliera refrigerate tubo per dimensioni dei tubi e il luogo tubo da 50 ml con le cellule marcate magneticamente nella riga A, tubo da 50 ml conica per la raccolta frazione negativa nella riga B e 15 ml tubo conico per la raccolta delle frazioni positive in fila C.
  7. Scegliere il programma di separazione "POSSEL_S" cellula per la selezione positiva delle cellule bersaglio etichettati in modo sensibile dai campioni. Cellule bersaglio marcate magneticamente sono trattenuti sulla colonna tavole; cellule non marcate vengono rilasciati nel tubo di raccolta delle frazioni negativo in fila B. In retrazione automatica del magnete, le cellule bersaglio marcate verrà rilasciato nel tubo di raccolta positiva in fila C del tubo rack.

+ Leucociti arricchite

  1. Recount Gr-1 + e Gr-1 - frazioni utilizzando trypan blu e un emocitometro. Risospendere le cellule a concentrazione desiderata nel mezzo colorazione 3% in modo che 50 pl è equivalente a 5x10 5-1x10 6 cellule (1x10 7 cellule / ml - 2x10 7 cellule / ml) e 50 pl per trasferire corrispondentemente etichettati tubi FACS.
  2. Preparare una MM di Mac-1 solo, a una diluizione 1:25 a 3% SM per un volume finale di 50 pl per campione. Colorare le cellule e preparare singole compensazioni macchia di Gr-PE, Mac-1 FITC e DAPI per l'analisi di citometria a flusso. Aggiungere 200 pl SM 3% e colorante vitalità DAPI come precedentemente descritto.
  3. Eseguire la citometria a flusso di acquisizione dati per determinare Gr-1 + e Gr-1 - percentuali e di confrontare anche le percentuali di arricchimento MDSC pre-e post-autoMACS.

6. Risultati rappresentativi

Qui vi mostriamo r Risultati epresentative per l'arricchimento autoMACS di Gr-1 + leucociti dal pool, milza naïve per FACS successive di smistamento di MDSC (Figura 1). 1x10 6 leucociti naive sono state colorate con Mac-1-FITC e Gr-1-APC anticorpi per identificare percentuali MDSC con uno strumento BD LSRII, prima di smistamento autoMACS. 1x10 7 leucociti naive sono state poi colorate con anticorpi anti-Gr-1-PE PE-anticorpi e microsfere per l'arricchimento del Gr-1 + leucociti utilizzando un separatore autoMACS Pro. Post-autoMACS arricchimento, Gr-1 percentuali in Gr-1 + e Gr-1 - frazioni raccolte sono state valutate mediante citometria a flusso. 1x10 6 Gr-1 + leucociti sono stati rimossi e colorati con Mac-1-FITC anticorpi per analizzare e confrontare le percentuali di MDSC arricchito, naive agli aggregati leucociti non arricchito, pool portatori di tumore leucociti mediante citometria a flusso.

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Figura 1. Arricchimento AutoMACS di ingenuo Gr-1 + leucociti per FACS MDSC Ordinamento. Milze sono state raccolte dai topi portatori di tumore del pancreas e ingenuo e trasformati in unicellulari sospensioni. L'analisi di citometria a flusso superficiale ingenuo leucociti colorati con Mac-1 e GR-1 fluorescente anticorpi coniugati, prima di arricchimento autoMACS (A). Analisi di citometria a flusso di Gr-1 + (B) e GR-1 - (C) frazioni post-autoMACS arricchimento di Gr-1 + cellule provenienti da un pool leuckocytes naïve colorati con Gr-1-PE e anticorpi anti-PE microsfere. Analisi di citometria a flusso di MDSC e Gr-1 + percentuali di post-autoMACS arricchimento di Gr-1 + cellule provenienti da un pool leucociti naïve (D) rispetto ai non-arricchiti leucociti raccolti da topi affetti da tumore (E) (topi naïve, n = 5 ; topi portatori di tumore, n = 3). MDSC e GR-1 percentuali sono gated nei grafici di contorno rappresentative e istogrammi.

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Discussion

Questo è un metodo dettagliato per l'elaborazione e la immunophentyping popolazioni MDSC che è applicabile a diversi tessuti linfoidi provenienti da vari modelli animali. In particolare, l'arricchimento autoMACS può essere usato per l'isolamento delle varie popolazioni di leucociti cui Gr-1 deplezione di splenociti 4, purificazione di sottoinsiemi mieloidi da splenociti e linfonodi 5, l'isolamento dei neutrofili midollo osseo 14 e la purificazione di cellule T CD8 + da milza e linfonodi 15. Indipendentemente dalla popolazione di cellule, generando sospensioni monocellulari di leucociti dai tessuti linfoidi desiderati è richiesto per la colorazione superficiale ottimale, analisi di citometria di flusso, arricchimento autoMACS e smistamento FACS. In questo protocollo, abbiamo usato meccanico dissociazione per creare una sospensione di cellule singole di leucociti. Tuttavia, utilizzando la digestione enzimatica come Collagenasi D è anche un'alternativa adeguata a questo protocollo per aumentare lala resa dei leucociti dal milza o di altri organi linfoidi 5.

Citometria a flusso è una tecnica importante per i leucociti immunofenotipizzazione. Pertanto, la preparazione adeguata per citometria di flusso e arricchimento richiede anche l'uso di tamponi appropriati per la sospensione cellulare e la diluizione dei reagenti anticorpi. Molti protocolli alternano FBS e BSA per la preparazione di supporti di colorazione e di buffer MACS. Tuttavia, questi reagenti sono anche disponibili in commercio da aziende quali eBioscience, BD Pharmingen e Miltenyi Biotec. Come spiegato da Miltenyi Biotec e eBioscience, sia BSA e FBS prevenire il legame non specifico quando colorazione leucociti con anticorpi coniugati con fluorocromi. Ancora più importante, basse percentuali di queste proteine ​​animali siero mantenere la vitalità e prevenire aggregazione dei leucociti 16. Tuttavia, dalla nostra esperienza, BSA funziona meglio per la colorazione ottimale e una migliore risoluzione per l'arricchimento autoMACS di FBS e raccomandazioniDed nel protocollo descritto.

In questo protocollo, si caratterizza MDSC murino utilizzando CD11b-FITC e Gr-1-APC fluorescente anticorpi coniugati e citometria di flusso. E 'imperativo per titolare questi anticorpi prima di utilizzare per ridurre le elevate colorazione in fluorescenza di fondo per evitare che i risultati non ottimali. Inoltre, quando si sceglie anticorpi per analisi di citometria a flusso multicolore, possibili sovrapposizione spettrale dei fluorocromi è anche un altro fattore critico da considerare 17,18. Pertanto, il risarcimento controlla sotto forma di macchie di colore per ogni singolo fluorochome anticorpo coniugato di perle d'interesse o di compensazione, può correggere i problemi di sovrapposizione spettrale 18. Un'altra considerazione importante per ottenere risultati accurati di citometria a flusso è l'uso di coloranti vitalità. Le cellule morte può non si legano specificamente anticorpi, creando così risultati falsi positivi 19. In questo protocollo, si usa l'acido nucleico macchia, DAPI come colorante di vitalitàescludere le cellule morte dalla nostra analisi in quanto integra il miglior gruppo di fluorocromo-coniugati anticorpi utilizzati con il minimo di sovrapposizione dello spettro. Tuttavia, altri coloranti vitalità come 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) e ioduro di propidio (PI) può essere utilizzata con i metodi descritti colorazione a seconda del pannello di anticorpi utilizzati. Attualmente, vi sono anche un certo numero di cellule morte fissabili macchie disponibili che permettono alle cellule colorate da fissare e permeabilizzate senza perdere la capacità di discriminare vitalità (Invitrogen). Complessivamente, altre tecniche di colorazione sono importanti per l'analisi accurata citometria a flusso. Ad esempio, in questo protocollo, l'uso di a 96 pozzetti con fondo a V piastre consente piccoli volumi concentrate di cellule e reagenti da utilizzare per l'analisi delle percentuali MDSC e leucociti mediante citometria a flusso. L'uso del Master Mix (MM) approccio è anche una tecnica importante per immunofluorescenza uguale etichettatura di leucociti in piccoli volumi utilizzando 96-well fondo a V plAtes o tubi FACS. Queste tecniche ridurre il rischio di contaminazione incrociata dei campioni, mantenere gli anticorpi sterili e ridurre la quantità di reagenti e anticorpi utilizzati.

Il separatore autoMACS Pro consente l'isolamento efficiente e automatizzato di popolazioni di cellule da campioni diversi, in tutte le specie. In questo protocollo, indiretta marcatura magnetica di leucociti mediante Gr-1-PE anticorpi e magnetico PE microsfere è utilizzata per l'arricchimento di autoMACS Gr-1 + leucociti. Questa procedura può essere modificata per la separazione autoMACS con microsfere ad altri anticorpi fluorocromo-coniugati, biotinilati e non coniugata primarie per l'arricchimento di popolazioni di cellule diverse 20. Tuttavia, in questa procedura, si consiglia di utilizzare PE-anticorpi coniugati e anti-PE-microsfere in contrasto con FITC per esempio, come la molecola PE si dice di avere più siti di legame, con conseguente forte e una migliore etichettatura magnetica (Miltenyi Biotec ). Un altro pmodifica OSSIBILI di questo protocollo è l'uso diretto di marcatura magnetica quanto vi sono una varietà di microperle MACS per l'isolamento di uomo, topo e ratto leucociti (Miltenyi Biotec). Tuttavia, indiretta marcatura magnetica utilizzando un fluorocromo-coniugato anticorpo primario permette di valutare la citometria a flusso di frazioni arricchito o impoverito leucociti senza la necessità di ulteriori colorazione. Ci sono anche una serie di separatori MACS disponibili, ma il separatore autoMACS Pro sistema è vantaggioso in quanto consente ad alta velocità, lo smistamento automatico di un massimo di sei campioni per la selezione delicata di leucociti altamente vitali, in confronto al manuale separatori MACS. Tuttavia, manuali Separatori MACS sono alternative adeguate al separatore autoMACS Pro, se disponibile. Per arricchire ulteriormente ingenui Gr-1 + leucociti, una modifica potenziale di questo protocollo sarebbe quello di eseguire nuovamente la frazione positivamente raccolti utilizzando una nuova colonna autoMACS sul separatore autoMACS Pro. Arricchimentodi Gr-1 + portatori di tumore leucociti utilizzando il separatore autoMACS Pro non è raccomandato in questo protocollo, poiché ciò si traduce in una significativa riduzione nel recupero di GR-1 frazioni come queste cellule tendono ad attaccarsi alle colonne durante arricchimento rispetto ai leucociti naïve . Pertanto, questo protocollo consiglia vivamente di mettere in comune portatori di tumore leucociti per FACS successive di smistamento di MDSC vitali.

Pre-arricchito, pool leucociti ingenue e pool portatori di tumore leucociti può utilizzato per applicazioni future, quali bassa velocità FACS ordinamento per l'isolamento delle popolazioni MDSC. Questo protocollo è stato appositamente progettato per aggirare FACS noiose e tempestivo smistamento delle MDSC da topi naive, che è causa di percentuali significativamente più bassi di MDSC. Arricchimento AutoMACS di Gr-1 + leucociti da topi naive permette poi per FACS tempestive, conveniente ed efficiente ordinamento dei MDSC praticabile e funzionale per il loro uso in vivo e inesperimenti in vitro. Selezione diretta di umili popolazioni di cellule espressi come MDSC ingenuo è un processo molto inefficiente, con tempi di ordinamento lunghi, costi elevati e il recupero delle cellule ridotta e la vitalità. Preparazione e arricchimento autoMACS di Gr-1 + leucociti da topi naive dura circa 45 minuti e gli aumenti percentuali MDSC superiore a 4 volte (Figura 1). Questo arricchimento riduce i tempi di FACS ordinamento da circa 12 ore per non arricchiti di leucociti a circa 20-30 minuti per l'isolamento di almeno 1x10 6 vitale, arricchita da un pool MDSC leucociti ingenue. Leucociti Tuttavia, FACS ordinamento dei MDSC vitali da non arricchito, raccolti da topi affetti da tumore richiede meno tempo a causa di un aumento delle percentuali di abbondanza MDSC in risposta alla massa tumorale. È importante notare che ordinati MDSC leucociti e altre può quindi essere utilizzato in entrambi i saggi funzionali quali misti reazioni leucociti (MLR) in vivo esperimenti di trasferimento adottivo 21 così come in saggi funzionali non incluse qRT-PCR 22, 23 e Western Blot cytospin / analisi di microscopia 14. In generale, questo protocollo può essere modificato per l'arricchimento e la tipizzazione di leucociti immunosoppressivi e dagli altri tessuti linfoidi o sangue periferico di topi, ratto e umani da utilizzare in una pletora di in vivo e in vitro.

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Disclosures

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Acknowledgements

Riconosciamo il Fondo flusso Cytometry USF Core. Vorremmo ringraziare il Dott. Denise Cooper per la condivisione di risorse. Vorremmo anche ringraziare Maya Cohen, Laura Pendleton e Diana Latour per la loro assistenza nella creazione e le riprese di questo video. NN supportato da NSF FG-LSAMP Ponte al Dottorato Fellowship HRD # 0929435. Questo lavoro è stato finanziato dalla American Society istituzionale Cancer Research Centre di Grant # 93-032-13/Moffitt Cancer assegnato al TG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

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References

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Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

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