Préparation de dérivés myéloïdes cellules suppressives (MDSC) de Naive et pancréatique souris porteuses de tumeurs par cytométrie en flux et automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS)

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Summary

C'est une méthode rapide et complète de l'immunophénotypage myéloïdes dérivées des cellules suppressives (MDSC) et l'enrichissement de Gr-1

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Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

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Abstract

MDSC sont une population hétérogène de macrophages, les cellules dendritiques immatures et des granulocytes qui s'accumulent dans les organes lymphoïdes dans des conditions pathologiques, y compris les infections parasitaires, l'inflammation, le stress traumatique, réaction du greffon contre l'hôte, le diabète et le cancer 1-7. Chez la souris, MDSC expresse Mac-1 (CD11b) et Gr-1 (Ly6G et Ly6C) antigènes de surface 7. Il est important de noter que MDSC sont bien étudiés dans divers porteurs d'une tumeur hôtes où ils sont sensiblement élargies et réprimer les anti-tumoraux des réponses immunitaires par rapport à leurs homologues naïfs 7-10. Toutefois, en fonction de l'état pathologique, il ya différentes sous-populations de MDSC avec des mécanismes distincts et les cibles de la répression 11,12. Par conséquent, des méthodes efficaces pour isoler des populations viables MDSC sont importants dans l'élucidation de leurs différents mécanismes moléculaires de la suppression in vitro et in vivo.

Récemment, le Ghansah groupe a signalé l'expansion de la MDSC dans un modèle murin du cancer du pancréas. Notre porteur de tumeurs MDSC afficher une perte de l'homéostasie et augmentation de la fonction suppressive par rapport à naïve MDSC 13. Pourcentages MDSC sont beaucoup moins dans les compartiments lymphoïdes de souris naïves vs porteur de tumeurs. Il s'agit d'une mise en garde majeure, qui empêche souvent les analyses comparatives précises de ces MDSC. Par conséquent, l'enrichissement de Gr-1 + leucocytes chez des souris naïves avant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) améliore la pureté, la viabilité et réduit considérablement le temps de tri. Toutefois, l'enrichissement de la Gr-1 + leucocytes de souris porteuses de tumeurs est facultative car ceux-ci sont en abondance pour FACS rapides de tri. Par conséquent, dans ce protocole, nous décrivons une méthode très efficace de immunophénotypage MDSC et enrichissante Gr-1 + leucocytes de la rate de souris naïves pour le tri MDSC en temps opportun. Immunocompétents souris C57BL / 6 sont inoculés avec murin Panc02 CElls voie sous-cutanée alors que les souris naïves recevoir 1XPBS. Environ 30 jours après l'inoculation; rates sont récoltées et transformées en une seule cellule suspensions en utilisant un tamis de dissociation cellulaire. Les splénocytes sont ensuite globules rouges (RBC) lysées et une aliquote de ces leucocytes sont colorés en utilisant conjugués au fluorochrome des anticorps contre Mac-1 et Gr-1 à des pourcentages immunophénotype MDSC par cytométrie en flux. Dans une expérience parallèle, les leucocytes entiers de souris naïves sont colorées avec fluorescente conjugués GR-1, incubées avec des anticorps PE-microbilles et sélectionné de façon positive à l'aide un système automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS) Pro Separator. Ensuite, une aliquote de GR-1 + de leucocytes sont colorés avec Mac-1 anticorps pour identifier les l'augmentation des pourcentages MDSC par cytométrie en flux. Maintenant, ces Gr1 + de leucocytes enrichis sont prêts pour tri par FACS du MDSC à être utilisé dans les analyses comparatives (naïve vs porteur de tumeurs) in vivo et in vitro

Protocol

Avant de commencer, préparer les solutions suivantes:

3% de coloration des médias (SM):

-3% De sérum bovin foetal (FBS) dans 1X tampon phosphate salin (PBS)

MACS tampon (Mo):

- 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans 1XPBS

1. Les rates de récolte provenant de souris

  1. Voie sous-cutanée d'injecter 6-8 semaines d'âge C57BL / 6 souris (Harlan) avec 1,5 x 10 5 murins Panc02 cellules en suspension dans 100 ul de PBS 1x (porteur de tumeurs; TB). Les souris témoins (Naïve) de recevoir 100 1XPBS ul.
  2. Environ quatre semaines après l'injection, les souris euthanasier par asphyxie de dioxyde de carbone.
  3. Rates de récolte de la souris par dissection aide de pinces et ciseaux, puis peser à l'aide d'un équilibre. Placer les rates séparé, étiqueté tubes de 50 ml coniques contenant 1 x PBS.

2. Générer un Fourches unicellulairen des leucocytes de la rate

Toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement stérile sous une hotte de sécurité biologique et les cellules et d'anticorps conservés sur la glace.

  1. Assembler le tamis de dissociation cellulaire par l'insertion du tamis à mailles dans l'ouverture de la coupelle vers le bas. Ensuite, insérez la bague de retenue dans la zone filetée avec le côté rainuré et d'utiliser le porte-clés pour serrer la bague de retenue, tenant ainsi à l'écran en place. Placez le tamis monté dans une boîte de Pétri contenant 10 ml 1 x PBS.
  2. Rates Piscine et pilon en verre utilisation pour moudre la rate contre le grillage de la cellule de dissociation tamis et dans la boîte de Pétri. Répétez l'opération pour chaque groupe de traitement de la souris.
  3. Suspension cellulaire filtre dans un tube de 50 ml conique à l'aide d'une passoire 70 um cellulaire et d'une pipette de 5 ml sérologique. Centrifuger à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min.
  4. Enlever le surnageant et remettre en suspension le culot dans 5 ml 1 x tampon de lyse RBC par la rate. Pipet et vigoureusement vers le bas. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Arrêter la réaction en ajoutant 20 ml de 1 x PBS. Pipet et vigoureusement vers le bas. Centrifuger à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min.
  5. Enlever le surnageant et remettre en suspension le culot dans 20 ml de PBS stérile 1 x. Pipet et vigoureusement vers le bas.
  6. Compter les cellules en utilisant le bleu trypan et un hémacytomètre et resuspendre à la concentration désirée en SM 3% de telle sorte que 50 pl est équivalente à 5x10 5-1x10 6 cellules (1x10 7 cellules / ml - 2x10 7 cellules / ml).

3. Cell-surface de coloration / immunophénotypage des MDSC par cytométrie en flux

  1. Étiquetez les puits d'une plaque de 96 puits fond en V pour le contrôle et les échantillons expérimentaux et des taches simples pour les contrôles de rémunération (n ° Teinté, NS; Mac-1-FITC; Gr-1-APC et DAPI).
  2. Ajouter 5x10 5-1x10 6 cellules équivalentes à 50 pl / puits de splénocytes à leurs puits respectifs dans le 96-V-même la plaque inférieure. Centrifugerplaque à 12.000 tours par minute (250-300 xg) pendant 5 min.
  3. Préparer "Mix Master" (MM) de la souris BD Bloquer Fc (rat anti-souris CD16/32 anticorps monoclonal) dilué dans SM 3%, dans un microtube de 1,5 ml sur la glace. Comme point de départ, utilisez 1 ug Fc Bloquer dans SM 3% pour un volume final de 50 ul par puits.
  4. Retirez délicatement le surnageant de chaque puits de la 96-V-même la plaque inférieure en mettant rapidement inverser la plaque sur et à l'arrière, sur un conteneur à déchets ou dans l'évier sans interruption des culots cellulaires.
  5. Vortex, centrifuger brièvement MM Bloquer Fc pendant 5 secondes et ajouter 50 ul à tous les granulés dans le 96-V-même la plaque inférieure. Bien mélanger en douceur pipetant, laissant des échantillons dans leurs puits. Incuber la plaque pendant 15 min dans l'obscurité sur la glace. Centrifuger la plaque à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min.
  6. Préparer "Mix Master" (MM) de fluorochrome-anticorps conjugués dilués dans SM 3% dans un microtube de 1,5 ml sur la glace, tandis que les échantillons incuber avec le bloc Fc. Anticorps doit être adaptéepour déterminer les dilutions optimales pour les procédures de coloration. Comme point de départ, combiner une dilution 1:25 de Mac-1-FITC et dilution 1:20 de Gr-1-APC dans SM 3% pour un volume final de 50 ul, par échantillon.
  7. Retirez délicatement le surnageant de chaque puits de la 96-V-bottom et comme décrit précédemment.
  8. Vortex, centrifuger brièvement MM d'anticorps conjugués coloration fluorescente pendant 5 secondes et ajouter 50 ul de contrôle et de pastilles expérimentales. Bien mélanger en douceur pipetant. Pour une seule tache compensations, ajoutez une dilution 1:25 de Mac-1-FITC, dilution 1:20 de Gr-1-APC et 75 ng / ml de DAPI, dans SM 3% pour un volume final de 50 ul par puits à leurs puits respectifs. Ajouter 50 ul SM 3% à souillé bien (aucune tache). Bien mélanger et incuber les cellules dans 96 puits à fond en V plaque pendant 30 min dans l'obscurité sur la glace.
  9. FACS étiquettes des tubes (5 ml, 12 mm x 75 mm tubes en polystyrène fond rond) pour correspondre à chaque puits de la plaque de 96 puits à fond en V. Ajouter 200 ul SM 3% à chaque FACSTube.
  10. Centrifuger la plaque à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min et retirez surnageants. Laver granulés par addition de 100 ul SM 3% à chaque pastille et bien mélanger délicatement par aspiration et refoulement. Centrifuger la plaque à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min. Répétez l'étape laver une fois de plus.
  11. Retirez délicatement le surnageant de chaque puits de la 96-V-bottom et comme décrit précédemment. Remettre en suspension chaque culot dans 100 SM 3% ul et bien mélanger.
  12. Transférer 100 ul culot remis en suspension à partir de chaque puits de la 96-V-même la plaque inférieure à leur tube FACS respectivement étiquetés.
  13. Avant l'analyse des flux cytométrie, ajouter 75 ng / ml de DAPI à contrôler et échantillons expérimentaux et de contrôle unique de compensation DAPI tache.
  14. Effectuer flux d'acquisition de données par cytométrie de pourcentages MDSC. Effectuer une compensation utilisant le négatif (pas de contrôle tache) et les contrôles simples positifs. Mettre en place un dot plot qui affiche la diffusion vers l'avant (FSC) par rapport à côté (SSC) en échelle logarithmique afin que les populations de leucocytes deintérêt peut être identifié. Dessiner une grande porte sur tous les leucocytes, à l'exclusion des débris et des bouquets avec le plus bas vers l'avant et la diffusion latérale. De cette porte parent, créez un tracé nouveau point qui affiche SSC par rapport DAPI et porte sur DAPI-(live) des cellules. Sélectionnez cette population nouvellement fermé et créer un nuage de points qui affiche Mac-1 par rapport Gr-1 et la porte sur votre positif double (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC.

4. Enrichissement magnétique de GR-1 + de leucocytes

  1. Aliquotes 1x10 7 autres leucocytes non colorés dans des tubes FACS étiquetés de façon appropriée et centrifuger à 12000 rpm (250-300 xg) pendant 5 min.
  2. Préparer MM de Gr-1-PE anticorps dans un microtube de 1,5 ml. Pour un maximum de 10 7 cellules, utilisez une dilution 1:10 de Gr-1-PE anticorps dans 50 Mo ul, par échantillon. Pour les numéros de cellulaires plus, l'échelle des volumes en conséquence. Centrifuger brièvement pendant 5 secondes, ajouter aux leucocytes dans des tubes FACS et incuber pendant 15 min à 4 ° C dans l'obscurité. Ajouter 2 ml de bromure de méthyle à des tubes FACS, de centrifugeuses à 12.000 tours par minute (250-300 xg) pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  3. Préparer MM de l'Anti-PE microbilles dans un microtube de 1,5 ml. Pour un maximum de 10 7 cellules, utiliser une dilution 1:04 de l'anti-PE microbilles dans 200 MB ul, par échantillon. Pour les numéros de cellulaires plus, l'échelle des volumes en conséquence. Centrifuger brièvement pendant 5 secondes, ajouter aux leucocytes dans des tubes FACS et incuber pendant 15 min à 4 ° C dans l'obscurité.
  4. Ajouter 2 ml de bromure de méthyle à des tubes FACS, de centrifugeuses à 12.000 tours par minute (250-300 xg) pendant 5 min et éliminer le surnageant. Resuspendre le culot dans 3 ml de SB. Filtrez dans une passoire 70 um dans une nouvelle, marquée tube de 50 ml conique.
  5. Préparer et le Premier MACS Auto Pro Separator. Recharge toutes les bouteilles avec les solutions appropriées et de vider la bouteille de déchets, si nécessaire. Activer instrument sur et examiner l'état de récipients de fluide et de colonne (s) après l'initialisation. Tous les symboles doivent être de couleur verte. Dans le menu, sélectionnez "Séparation" de la partie supérieurebarre de menu puis "Lavez maintenant" de la barre de menu inférieure. Sélectionnez "Rinçage" de l'option pop-up suivi de "Run" pour démarrer le processus d'amorçage. Une fois le processus d'amorçage est terminé avec succès, l'instrument affichera alors qu'il est "prêt pour la séparation" dans le menu Status.
  6. Choisissez convient portoir réfrigéré pour les tailles de tubes et les placer tube de 50 ml conique avec des cellules marquées magnétiquement dans la ligne A, 50 ml tube conique pour la collecte de la fraction négative à la ligne B et 15 ml tube conique pour la collecte de fraction positive dans la ligne C.
  7. Choisissez "POSSEL_S" programme de séparation des cellules pour la sélection positive des cellules cibles marquées en mode sensible à partir d'échantillons. Cellules cibles marquées magnétiquement sont retenus sur la colonne automates; cellules non marquées sont libérés dans le tube de prélèvement fraction négative dans B. Sur la ligne de rétraction automatique de l'aimant, les cellules cibles marquées seront libérés dans le tube de prélèvement positif à la ligne C du tube crémaillère.

+ de leucocytes enrichies

  1. Recount Gr-1 + et Gr-1 - fractions en utilisant du bleu trypan et un hémocytomètre. Resuspendre les cellules à concentration souhaitée dans le milieu de coloration 3% alors que 50 ul est équivalent à 5x10 5-1x10 6 cellules (1x10 7 cellules / ml - 2x10 7 cellules / ml) et le transfert de 50 pi à conséquence étiquetés tubes FACS.
  2. Préparer un MM de Mac-1 seulement, à une dilution 1:25 dans SM 3% pour un volume final de 50 ul par échantillon. Colorer les cellules et de préparer simples compensations taches de Gr-PE, Mac-1 FITC et DAPI pour l'analyse par cytométrie en flux. Ajouter 200 pi 3% SM et le colorant DAPI viabilité comme décrit précédemment.
  3. Effectuer flux d'acquisition par cytométrie de données pour déterminer Gr-1 + et Gr-1 - pourcentages et aussi comparer les pourcentages MDSC enrichissement pré-et post-autoMACS.

6. Les résultats représentatifs

Ici, nous montrons r résultats eprésentant pour l'enrichissement autoMACS de Gr-1 + leucocytes à partir du mélange, la rate naïfs pour FACS ultérieures de tri du MDSC (Figure 1). 1x10 6 leucocytes naïfs ont été colorées avec Mac-1-FITC et Gr-1-APC anticorps pour identifier les pourcentages MDSC en utilisant un instrument BD LSRII, avant tri autoMACS. 1x10 7 leucocytes naïfs ont ensuite été colorées avec des anticorps anti-Gr-1-PE anticorps et PE-Microbilles pour l'enrichissement de la Gr-1 + leucocytes en utilisant un séparateur autoMACS Pro. Post-autoMACS enrichissement, GR-1 pourcentages en Gr-1 + et Gr-1 - fractions recueillies ont été évaluées en utilisant la cytométrie de flux. 1x10 6 Gr-1 + de leucocytes ont été enlevés et colorées avec Mac-1-FITC anticorps à analyser et à comparer les pourcentages de MDSC enrichi, mis en commun des leucocytes naïfs à la non-enrichi, mis en commun porteuses de tumeurs leucocytes par cytométrie de flux.

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Figure 1. L'enrichissement autoMACS de Naïve Gr-1 + leucocytes pour FACS MDSC de tri. Les rates ont été récoltées à partir de souris porteuses de tumeurs pancréatiques et naïf et transformé en mono-cellulaires suspensions. Cytométrie en flux de surface de leucocytes colorés avec naïfs Mac-1 et Gr-1 fluorescente-conjugués d'anticorps, avant l'enrichissement autoMACS (A). L'analyse par cytométrie en flux de Gr-1 + (B) et Gr-1 - (C) des fractions post-autoMACS enrichissement de Gr-1 + cellules de mise en commun leuckocytes naïfs colorées avec Gr-1-PE et des anticorps anti-PE microbilles. L'analyse par cytométrie en flux du MDSC et Gr-1 + pourcentages post-autoMACS enrichissement de Gr-1 + de cellules de mise en commun des leucocytes naïfs (D) par rapport aux non-enrichis leucocytes communs de souris porteuses de tumeurs (E) (souris naïves, n = 5 ; souris porteuses de tumeurs, n = 3). MDSC et GR-1 pourcentages sont déclenchés dans les tracés de contours représentatives et des histogrammes.

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Discussion

Il s'agit d'une méthode détaillée pour le traitement et immunophentyping populations MDSC qui est applicable à différents tissus lymphoïdes de modèles animaux différents. En particulier, l'enrichissement autoMACS peut être utilisé pour l'isolement des différents populations de leucocytes comprenant Gr-1 épuisement des splénocytes 4, la purification de sous-ensembles à partir de splénocytes myéloïdes et les ganglions lymphatiques 5, isolement de la moelle osseuse neutrophiles 14 et la purification de cellules T CD8 + de la rate ganglions lymphatiques et 15. Quelle que soit la population de cellules d'intérêt, générant une seule cellule suspensions de leucocytes dans les tissus lymphoïdes souhaités est nécessaire pour la coloration de surface optimale, analyse par cytométrie en flux, l'enrichissement et le tri autoMACS FACS. Dans ce protocole, nous avons utilisé dissociation mécanique pour créer une seule suspension cellulaire de leucocytes. Cependant, en utilisant une digestion enzymatique telles que la collagénase D est également une alternative adéquate à ce protocole pour augmenterle rendement des leucocytes de la rate ou d'autres organes lymphoïdes 5.

La cytométrie en flux est une technique importante pour les leucocytes immunophénotypage. Par conséquent, une préparation adéquate pour la cytométrie en flux et l'enrichissement nécessite également l'utilisation de tampons appropriés pour suspension cellulaire et de la dilution des réactifs d'anticorps. De nombreux protocoles alternent entre FBS et BSA pour la préparation des milieux de coloration et tampons MACS. Toutefois, ces réactifs sont également disponibles dans le commerce de sociétés telles que eBioscience Pharmingen, BD et Miltenyi Biotec. Comme il est expliqué par Miltenyi Biotec et eBioscience, BSA et FBS empêcher la liaison non spécifique lorsque la coloration des leucocytes avec fluorochrome-anticorps conjugués. Plus important encore, de faibles pourcentages de ces protéines animales sériques de maintenir la viabilité et empêcher l'agglutination des leucocytes 16. Cependant, à partir de notre expérience, BSA travaille mieux pour une coloration optimale et une meilleure résolution pour l'enrichissement de autoMACS FBS et recommandationsDED dans le protocole décrit.

Dans ce protocole, nous avons caractérisé MDSC murin utilisant CD11b-FITC et Gr-1-APC fluorescente des anticorps conjugués et cytométrie de flux. Il est impératif de doser ces anticorps avant de l'utiliser pour réduire haute coloration fluorescence de fond pour empêcher les non-résultats optimaux. En outre, lors du choix des anticorps pour l'analyse multicolore cytométrie de flux, les éventuels chevauchements spectrales des fluorochromes est également un autre facteur déterminant à prendre en considération 17,18. Par conséquent, la rémunération contrôle sous la forme de taches de couleur uniques pour chaque anticorps fluorochome conjugué de perles d'intérêt ou de compensation, peut corriger les problèmes de chevauchement spectral 18. Une autre considération importante pour la précision des résultats de cytométrie en flux est l'utilisation de colorants de viabilité. La mort des cellules non-lier spécifiquement aux anticorps, créant ainsi des résultats faussement positifs 19. Dans ce protocole, nous utilisons de l'acide nucléique tache, DAPI comme colorant la viabilité àexclure les cellules mortes de nos analyses car elle complète le meilleur panel d'anticorps conjugués au fluorochrome utilisés avec un minimum de chevauchement spectral. Toutefois, les colorants de viabilité d'autres tels que 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) et l'iodure de propidium (PI) peut être utilisé avec les méthodes de coloration décrites en fonction sur le panneau d'anticorps utilisés. Actuellement, il ya aussi un certain nombre de taches corrigeables cellules mortes disponibles qui permettent aux cellules colorées à fixées et perméabilisées sans perdre la capacité à discriminer la viabilité (Invitrogen). Dans l'ensemble, les techniques de coloration d'autres sont également importants pour l'analyse par cytométrie de flux précis. Par exemple, dans ce protocole, l'utilisation de 96-V ainsi des plaques à fond permet à de petits volumes concentrés de cellules et des réactifs qui seront utilisés pour l'analyse des pourcentages MDSC et des leucocytes par cytométrie en flux. L'utilisation du Master Mix (MM) approche est également une technique importante pour l'étiquetage immunofluorescence égal de leucocytes dans de petits volumes en utilisant soit de 96 puits à fond en V plAtes ou tubes FACS. Ces techniques permettent de réduire le risque de contamination croisée des échantillons, de maintenir anticorps stériles et réduire la quantité de réactifs et des anticorps utilisés.

Le séparateur autoMACS Pro permet une isolation efficace et automatisé des populations de cellules à partir d'échantillons multiples, dans toutes les espèces. Dans ce protocole, l'étiquetage indirecte magnétique de leucocytes en utilisant Gr-1-PE anticorps et magnétique PE microbilles est utilisé pour l'enrichissement autoMACS de Gr-1 + leucocytes. Cette procédure peut être modifiée pour la séparation autoMACS l'aide de microbilles à d'autres conjugué à un fluorochrome, biotinylés et non conjuguée anticorps primaires pour l'enrichissement de différentes populations cellulaires 20. Toutefois, dans cette procédure, nous recommandons fortement d'utiliser PE-conjugués et des anticorps anti-PE-microbilles, par opposition à la FITC par exemple, que la molécule de PE est dit d'avoir de multiples sites de liaison, conduisant ainsi à l'étiquetage magnétique plus fort et meilleur (Miltenyi Biotec ). Un autre pmodification otin à ce protocole est l'utilisation de l'étiquetage magnétique directe car il existe une grande variété de microbilles MACS pour l'isolement de l'homme, la souris et de rat (leucocytes Miltenyi Biotec). Cependant, indirecte marquage magnétique en utilisant un anticorps conjugué à un fluorochrome primaire permet une évaluation cytométrie de flux de fractions enrichies ou appauvri leucocytes sans la nécessité pour la coloration supplémentaire. Il ya également une variété de séparateurs MACS disponibles, mais le système autoMACS Séparateur Pro est avantageuse car elle permet pour la grande vitesse, tri automatisé pouvant aller jusqu'à six échantillons pour la sélection douce de leucocytes très viables, en comparaison de manuels Séparateurs MACS. Toutefois, manuels Séparateurs MACS sont des solutions de rechange appropriées au séparateur autoMACS Pro, si disponible. Pour enrichir encore naïfs Gr-1 + leucocytes, une modification possible à ce protocole serait de ré-exécuter la fraction positive recueillies à l'aide d'une nouvelle colonne sur la autoMACS autoMACS Séparateur Pro. Enrichissementde Gr-1 + de porteurs de tumeurs leucocytes en utilisant le séparateur autoMACS Pro n'est pas recommandé dans ce protocole car cela conduit à une réduction significative de la récupération des fractions GR-1 que ces cellules ont tendance à coller aux colonnes lors de l'enrichissement par rapport aux leucocytes naïfs . Par conséquent, ce protocole recommande fortement la mise en commun porteuses de tumeurs leucocytes pour FACS ultérieures de tri du MDSC viable.

Pré-enrichi, mis en commun des leucocytes naïfs et mis en commun porteuses de tumeurs leucocytes peut être utilisé pour de futures applications telles que faible vitesse tri par FACS pour l'isolement des populations MDSC. Ce protocole est conçu spécifiquement pour contourner FACS fastidieuses et en temps opportun de tri du MDSC de souris naïves, qui est due à des pourcentages significativement plus faibles de MDSC. L'enrichissement autoMACS de Gr-1 + leucocytes de souris naïves permet ensuite de FACS rapides, pratique et efficace de tri des MDSC viable et fonctionnel pour leur utilisation in vivo etdans des expériences in vitro. Tri direct des humbles populations de cellules MDSC exprimées comme naïve est un processus très inefficace avec des temps de tri de longues, des coûts élevés et de récupération cellulaire réduite et la viabilité. Préparation et enrichissement autoMACS de Gr-1 + leucocytes chez des souris naïves dure environ 45 minutes et une augmentation des pourcentages MDSC de plus de 4 fois (Figure 1). Cet enrichissement permet de réduire le temps de tri par FACS d'environ 12 heures pour non-enrichis leucocytes à environ 20-30 minutes pour l'isolement d'au moins 1x10 6 viable MDSC, enrichi de mise en commun des leucocytes naïfs. Leucocytes Toutefois, tri par FACS du MDSC viable non-enrichi, rassemblées à partir souris porteuses de tumeurs, il faudra moins de temps en raison d'une augmentation de l'abondance des pourcentages MDSC en réponse à la charge tumorale. Il est important de noter que les leucocytes triés MDSC et d'autres peuvent ensuite être utilisés dans les deux tests fonctionnels tels que des réactions mixtes de leucocytes (MLR) et in vivo expériences de transfert adoptive 21 ainsi que dans non-fonctionnels, y compris des dosages qRT PCR 22, 23 et Western Blot cytospin / analyses microscopie 14. Dans l'ensemble, ce protocole peut être modifié pour l'immunophénotypage et l'enrichissement des leucocytes et d'autres immunosuppresseurs à partir de tissus lymphoïdes ou du sang périphérique de souris, le rat et l'homme à être utilisés dans une multitude de in vivo et in vitro.

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Disclosures

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Acknowledgements

Nous reconnaissons le flux USF cytométrie Core Facility. Nous tenons à remercier le Dr Denise Cooper pour le partage des ressources. Nous aimerions également remercier Maya Cohen, Laura Pendleton et Diana Latour pour leur aide dans la mise en place et le tournage de cette vidéo. NN soutenu par la NSF FG-LSAMP pont à la bourse de doctorat DRH # 0929435. Ce travail a été financé par l'American Cancer Society Research Grant # institutionnel 93-032-13/Moffitt Cancer Center attribué à TG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

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References

  1. Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
  2. Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
  3. Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
  4. Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
  5. Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
  6. Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
  7. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
  8. Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
  9. Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
  10. Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
  11. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  12. Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
  13. Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
  14. Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
  15. Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
  16. Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
  17. Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
  18. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
  19. Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
  20. Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
  21. Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
  22. Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
  23. Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994 (2009).

Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

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