Utarbeidelse av myeloide Bearbeidede suppressor celler (MDSC) fra naiv og bukspyttkjertelen Tumor-bærende mus med flowcytometrisystemer og Automated Magnetic Aktivert Cell Sorting (AutoMACS)

Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dette er en rask og omfattende metode for immunfenotyping myelogen Avledede suppressor celler (MDSC) og berikende Gr-1

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

MDSC er en heterogen befolkning umodne makrofager, dendrittiske celler og granulocytter som akkumuleres i lymfoide organer i patologiske tilstander, inkludert parasittisk infeksjon, betennelse, traumatisk stress, graft-versus-vert sykdom, diabetes og kreft 1-7. Hos mus, MDSC ekspress Mac-en (CD11b) og Gr-1 (Ly6G og Ly6C) overflateantigener 7. Det er viktig å merke seg at MDSC er godt studert i ulike tumor-bærende vertene hvor de er betydelig utvidet og undertrykke anti-tumor immunresponser sammenlignet med naive kolleger 7-10. Men avhengig av patologisk tilstand, er det forskjellige subpopulasjoner av MDSC med forskjellige mekanismer og delmål for undertrykkelse 11,12. Derfor, effektive metoder for å isolere levedyktige MDSC bestander er viktig i å forklare deres ulike molekylære mekanismer for undertrykkelse in vitro og in vivo.

Nylig, Ghansah gruppe har rapportert utvidelsen av MDSC i en murine bukspyttkjertelkreft modell. Vår tumor-bærende MDSC viser et tap av homeostase og økte undertrykkende funksjon i forhold til naive MDSC 13. MDSC prosenter er betydelig mindre i lymfoide avdelinger av naive vs tumor-bærende mus. Dette er en stor forbeholdet, som ofte hindrer nøyaktige komparative analyser av disse MDSC. Derfor berikende Gr-1 + leukocytter fra naive mus før Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) forbedrer renhet, levedyktighet og reduserer sortere tid. Imidlertid er anrikning av Gr-1 + leukocytter fra tumor-bærende mus valgfri da disse er i overflod for raske FACS sortering. Derfor, i denne protokollen, beskriver vi en svært effektiv metode for immunfenotyping MDSC og berikende Gr-1 + leukocytter fra spleens av naive mus for sortering MDSC på en riktig måte. Immunkompetente C57BL / 6 mus er inokulert med murine Panc02 ceLLS subkutant mens naive mus motta 1XPBS. Ca 30 dager etter inokulasjon; spleens høstes og bearbeides til encellede suspensjoner ved hjelp av en celle dissosiasjon sil. Splenocytes blir så røde blodceller (RBC) lysert og en delmengde av disse leukocytter er farget med fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer mot Mac-en og Gr-1 til immunophenotype MDSC prosenter ved hjelp av flowcytometri. I en parallell eksperiment, blir hele leukocytter fra naive mus farget med fluorescerende-konjugerte Gr-1 antistoffer, ruges med PE-MicroBeads og positivt valgt ved hjelp av en automatisert Magnetic Aktivert Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator. Deretter blir en delmengde av GR-1 + leukocytter farget med Mac-1 antistoffer for å identifisere økningen i MDSC prosenter ved hjelp av flowcytometri. Nå, disse GR1 + beriket leukocytter er klare for FACS sortering av MDSC skal brukes i komparative analyser (naivt vs tumor-bærende) i in vivo og in vitro

Protocol

Før du starter, forberede følgende løsninger:

3% Farging Media (SM):

-3% Fetal bovin serum (FBS) i 1X fosfatbuffer saltvann (PBS)

MACS Buffer (MB):

- 0,5% Albumin fra Bovine Serum (BSA) i 1XPBS

1. Harvests spleens fra Mus

  1. Subkutant injisere 6-8 uker av alder C57BL / 6 mus (Harlan) med 1,5 x 10 5 murine Panc02 celler suspendert i 100 mL 1x PBS (tumor-peiling, TB). Kontroll mus (naive) mottar 100 mL 1XPBS.
  2. Ca 4 uker etter injeksjon, avlive mus ved karbondioksid kvelning.
  3. Harvests spleens fra mus ved stump disseksjon bruke pinsett og saks da veie ved hjelp av en balanse. Plasser spleens i eget, merket 50 ml koniske rør som inneholder 1 x PBS.

2. Generer en encellet Suspension av leukocytter fra spleens

Alle prosedyrer skal utføres i et sterilt miljø under et biologisk sikkerhet Hood og celler og antistoffer holdt på is.

  1. Monter cellen dissosiasjon sil ved å sette maskene skjermen inn i åpningen av koppen mot bunnen. Deretter setter låseringen inn i gjenget området med slotted side opp og bruke ringen for å stramme låseringen, og dermed holde skjermen på plass. Plasser samlet silen i en petriskål som inneholder 10 ml 1 x PBS.
  2. Pool spleens og bruk glass stampe å male spleens mot mesh skjermen av cellen dissosiasjon sil og inn i petriskål. Gjenta for hver behandling gruppe mus.
  3. Filter cellesuspensjon til en 50 ml konisk rør ved hjelp av en 70 mikrometer celle sil og en 5 ml serologisk pipette. Sentrifuger ved 12 000 rpm (250-300 xg) i 5 min.
  4. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 5 ml 1 x RBC buffer per milt. Pipet opp og ned kraftig. Inkuber ved romtemperatur i 5 min. Stopp reaksjonen ved å tilsette 20 ml 1 x PBS. Pipet opp og ned kraftig. Sentrifuger ved 12 000 rpm (250-300 xg) i 5 min.
  5. Fjern supernatanten og resuspender pellet i 20 ml sterilt 1 x PBS. Pipet opp og ned kraftig.
  6. Telle celler ved hjelp trypan blå og en hemacytometer og resuspender på ønsket konsentrasjon i 3% SM, slik at 50 mL tilsvarer 5x10 5-1x10 6 celler (1x10 7 celler / ml - 2x10 7 celler / ml).

3. Cell-overflate Farging / immunfenotyping av MDSC bruke flowcytometrisystemer

  1. Merk brønnene til en 96-brønns V bunnplaten for kontroll og eksperimentelle prøver og enkle beis for erstatning kontroller (ingen Stain, NS, Mac-1-FITC, Gr-1-APC og DAPI).
  2. Legg 5x10 5-1x10 6 celler som tilsvarer 50 mL / brønn splenocytes til sine respektive brønner i 96-brønnen V-bunn plate. Sentrifugerplate ved 12.000 rpm (250-300 xg) for 5 min.
  3. Forbered "Master Mix" (MM) av Mouse BD Fc Block (Rat anti-mus CD16/32 monoklonalt antistoff) fortynnet i 3% SM, i en 1,5 ml mikrosentrifuge rør på is. Som et utgangspunkt, bruker en mikrogram Fc Block i 3% SM for en endelig volum på 50 mL, per brønn.
  4. Fjern forsiktig supernatanten fra hver brønn på 96-brønnen V-bunn plate ved raskt å snu platen igjen og tilbake, over en avfallsbeholder eller en vask, uten avbrudd av cellen pellets.
  5. Vortex, kort sentrifuger Fc Block MM i 5 sekunder og tilsett 50 mL til alle pellets i 96-brønnen V-bunn plate. Bland godt med forsiktig pipettering opp og ned, forlater prøvene i sine brønner. Inkuber plate for 15 min i mørket på is. Sentrifuger plate på 12 000 rpm (250-300 xg) i 5 min.
  6. Forbered "Master Mix" (MM) av fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer utvannet i 3% SM i en 1.5ml mikrosentrifuge tube på is, mens prøver inkuber med Fc Block. Antistoffer bør titrereså bestemme optimale fortynninger for flekker prosedyrer. Som et utgangspunkt, kombinerer en 1:25 fortynning av Mac-en-FITC og 01:20 fortynning av Gr-1-APC i 3% SM for en endelig volum på 50 mL, per prøvebrønnen.
  7. Fjern forsiktig supernatanten fra hver brønn på 96-brønnen V-bunn som tidligere beskrevet.
  8. Vortex, kort sentrifuger MM av fluorescerende-konjugert flekker antistoffer i 5 sekunder og tilsett 50 mL til kontroll og eksperimentelle pellets. Bland godt med forsiktig pipettering opp og ned. For single-flekker kompensasjoner, legge til en 1:25 fortynning av Mac-en-FITC, 1:20 fortynning av Gr-1-APC og 75 ng / ml DAPI, i 3% SM for en endelig volum på 50 mL per brønn til sine respektive brønner. Tilsett 50 mL 3% SM til unstained godt (No Stain). Bland godt og inkuber celler i 96-brønnen V-bunn plate i 30 min i mørket på is.
  9. Etiketten FACS rør (5 ml, 12 mm x 75 mm polystyren rund bunn rør) for å tilsvare hver brønn i 96-brønnen V-bunn plate. Tilsett 200 mL 3% SM til hver FACStube.
  10. Sentrifuger plate på 12 000 rpm (250-300 xg) i 5 min og fjerne supernatants. Vask pellets ved å tilsette 100 mL 3% SM til hver pellet og bland godt med forsiktig pipettering opp og ned. Sentrifuger plate på 12 000 rpm (250-300 xg) i 5 min. Gjenta vasketrinn gang.
  11. Fjern forsiktig supernatanten fra hver brønn på 96-brønnen V-bunn som tidligere beskrevet. Resuspender hver pellet i 100 mL 3% SM og bland godt.
  12. Overfør 100 mL resuspendert pellet fra hver brønn på 96-brønnen V-bunn plate til sin henholdsvis merket FACS tube.
  13. Før Flowcytometri analyse, legger 75 ng / ml DAPI å kontrollere og eksperimentelle prøver og DAPI enkelt flekk kompensasjon kontroll.
  14. Utfør flowcytometrisk datainnsamling av MDSC prosenter. Utfør kompensasjon ved hjelp av negative (ingen skam kontroll) og de enkelte positive kontroller. Sett opp en prikk plott som viser fram (FSC) versus side scatter (SSC) i logskalaen slik at leukocytter bestander avrenter kan identifiseres. Tegn en stor gate på alle leukocytter, unntatt rusk og klumper med lavest fremover og side scatter. Fra denne forelderen gate, opprette en ny prikk plott som viser SSC versus DAPI og gate på DAPI-(live) celler. Velg dette nylig gated befolkningen og skape en prikk plott som viser Mac-en versus GR-1 og gate på dobbel positiv (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC.

4. Magnetic Anrikning av GR-1 + Leukocytter

  1. Delmengde 1x10 7 resterende unstained leukocytter i riktig merket FACS rør og sentrifuger ved 12.000 rpm (250-300 xg) i 5 min.
  2. Forbered MM av Gr-1-PE antistoff i en 1,5 ml mikrosentrifuge tube. For opp til 10 7 celler, bruk en 1:10 fortynning av Gr-1-PE antistoff i 50 mL MB, per prøve. For større celle tall, skalere opp volumer tilsvarende. Kort sentrifuger i 5 sekunder, legge til leukocytter i FACS rør og inkuber i 15 min ved 4 ° C i mørket. Tilsett 2 ml av MB til FACS rør, sentrifuger ved 12000 rpm (250-300 xg) for 5 min og kast supernatanten.
  3. Forbered MM av Anti-PE MicroBeads i en 1,5 ml mikrosentrifuge tube. For opp til 10 7 celler, bruk en 1:04 fortynning av anti-PE MicroBeads i 200 mL MB, per prøve. For større celle tall, skalere opp volumer tilsvarende. Kort sentrifuger i 5 sekunder, legge til leukocytter i FACS rør og inkuber i 15 min ved 4 ° C i mørket.
  4. Tilsett 2 ml av MB til FACS rør, sentrifuger ved 12000 rpm (250-300 xg) for 5 min og kast supernatanten. Resuspender pellet i 3 ml SB. Filtrer gjennom en 70 mikrometer sil inn i en ny, merket 50 ml konisk rør.
  5. Utarbeide og prime Auto MACS Pro Separator. Refill alle flasker med de riktige løsninger og tømme avfall flaske, om nødvendig. Slå instrumentet på og undersøke status for flytende containere og kolonne (r) etter initialisering. Alle symboler skal være grønn. På menyen, velg "Løsrivelse" fra øvremenylinjen etterfulgt av "Vask Now" fra nedre menylinjen. Velg "Skyll" fra pop-up alternativet etterfulgt av "Run" for å starte grunning prosessen. Når grunning prosessen er fullført, vil instrumentet så vise at det er "Klar for Separation" under Status-menyen.
  6. Velg passende kjølt tube stativ for rørdimensjoner og sted 50 ml konisk rør med magnetisk merket celler i rad A, 50 ml konisk rør for negativ brøkdel samling i rad B og 15 ml konisk rør for positiv brøkdel samling i rad C.
  7. Velg "POSSEL_S" celle separasjon program for positiv utvelgelse av merket målceller i sensitive modus fra prøvene. Magnetisk merket målcellene beholdes på automater kolonnen, umerkede celler blir sluppet ut i negativ brøkdel samling rør i rad B. På automatisert tilbaketrekking av magneten, vil de merkede målcellene slippes ut i positiv samling rør på rad C av tuben rack.

+ beriket Leukocytter

  1. Recount Gr-1 + og Gr-1 - fraksjoner med trypan blå og en hemacytometer. Resuspender celler på ønsket konsentrasjon i 3% farging medium slik at 50 mL tilsvarer 5x10 5-1x10 6 celler (1x10 7 celler / ml - 2x10 7 celler / ml) og overføre 50 mL til tilsvarende merket FACS rør.
  2. Forbered en MM av Mac-en bare på en 1:25 fortynning i 3% SM for en endelig volum på 50 mL per prøve. Flekk celler og forberede enkelt flekken kompensasjoner av Gr-PE, Mac-en FITC og DAPI for flowcytometri analyse. Tilsett 200 mL 3% SM og DAPI levedyktighet dye som tidligere beskrevet.
  3. Utfør flowcytometrisk datainnsamling for å avgjøre Gr-1 + og Gr-1 - prosenter og til også sammenligne MDSC prosenter pre-og post-autoMACS berikelse.

6. Representative Resultater

Her viser vi r epresentative resultater for autoMACS anrikning av Gr-1 + leukocytter fra samles, naive spleens for etterfølgende FACS sortering av MDSC (figur 1). 1x10 6 naive leukocytter ble farget med Mac-en-FITC og Gr-1-APC antistoffer for å identifisere MDSC prosenter ved hjelp av en BD LSRII instrument, før autoMACS sortering. 1x10 7 naive leukocytter ble deretter farget med anti-Gr-1-PE antistoffer og PE-MicroBeads for anriking av Gr-1 + leukocytter ved hjelp av en autoMACS Pro Separator. Post-autoMACS berikelse, Gr-1 prosenter i Gr-1 + og Gr-1 - samlet fraksjoner ble evaluert ved hjelp av flowcytometri. 1x10 6 Gr-1 + leukocytter ble fjernet og farget med Mac-en-FITC antistoff for å analysere og sammenligne MDSC prosenter av beriket, sammenslåtte naive leukocytter til ikke-anriket, samlet tumor-bærende leukocytter ved flowcytometri.

fig1.jpg "/>
Figur 1. AutoMACS anrikning av Naiv Gr-1 + leukocytter for MDSC FACS sortering. Spleens ble høstet fra pankreas tumor-bærende og naiv mus og bearbeides til encellede suspensjoner. Flowcytometri analyse av naive leukocytter overflate farget med Mac-en og GR-1 fluorescerende-konjugerte antistoffer, før autoMACS anrikning (A). Flowcytometri analyse av Gr-1 + (B) og Gr-1 - (C) fraksjoner etter autoMACS anrikning av Gr-1 + celler fra sammenslåtte naive leuckocytes farget med Gr-1-PE-antistoffer og anti-PE MicroBeads. Flowcytometri analyse av MDSC og Gr-1 + prosenter post-autoMACS anrikning av Gr-1 + celler fra sammenslåtte naive leukocytter (D) sammenlignet med ikke-beriket samlet leukocytter fra tumor-bærende mus (E) (naive mus, n = 5 ; tumor-bærende mus, n = 3). MDSC og GR-1 prosenter er inngjerdet i de representative konturlinjer plott og histogrammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette er en detaljert metode for å behandle og immunophentyping MDSC populasjoner som gjelder for ulike lymfevev fra ulike dyremodeller. Spesielt kan autoMACS berikelse brukes til isolering av ulike leukocytter populasjoner inkludert Gr-1 uttømming av splenocytes 4, rensing av myeloide undergrupper fra splenocytes og lymfeknuter 5, isolering av benmarg nøytrofile 14 og rensing av CD8 + T celler fra milt og lymfeknuter 15. Uavhengig av cellen befolkning av interesse, er å generere encellede suspensjoner av leukocytter fra de ønskede lymfevev som kreves for optimal overflate farging, flowcytometri analyse, autoMACS berikelse og FACS sortering. I denne protokollen, brukte vi mekanisk dissosiasjon å skape en enkelt celle suspensjon av leukocytter. Men ved å bruke enzym fordøyelsen som collagenase D er også en tilstrekkelig alternativ til denne protokollen for å økeutbyttet av leukocytter fra spleens eller andre lymfoide organer 5.

Flowcytometri er en viktig teknikk for immunfenotyping leukocytter. Derfor krever tilstrekkelig forberedelse for flowcytometri og berikelse også bruk av hensiktsmessige buffere for cellesuspensjon og fortynning av antistoffreagenser. Mange protokoller veksler mellom FBS og BSA for å forberede Fargeløsninger medier og MACS buffer. Men disse reagensene er også kommersielt tilgjengelig fra selskaper som eBioscience, BD Pharmingen og Miltenyi Biotec. Som forklart av Miltenyi Biotec og eBioscience, både BSA og FBS hindre ikke-spesifikk binding når flekker leukocytter med fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer. Enda viktigere, lave prosenter av disse animalske proteiner opprettholde levedyktighet og forebygge klumper av leukocytter 16. Men fra vår erfaring, fungerer BSA bedre for optimal farging og bedre oppløsning for autoMACS berikelse enn FBS og er anbefalingded i den beskrevne protokollen.

I denne protokollen, karakterisert vi murine MDSC bruker CD11b-FITC og Gr-1-APC fluorescerende-konjugerte antistoffer og flowcytometri. Det er viktig å titrere disse antistoffene før bruk for å redusere høyt bakgrunnsfluorescens flekker å hindre ikke-optimale resultater. I tillegg, når du velger antistoffer for flerfarget flowcytometri analyse, er mulige spektrale overlapp av de fluorokromer også en annen kritisk faktor for å bli vurdert 17,18. Derfor styrer kompensasjon i form av én farge flekker for hver fluorochome antistoffet av renter eller kompensasjon perler, kan korrigere for saker av spektral overlapp 18. Et annet viktig hensyn for nøyaktige flowcytometri resultater er bruken av levedyktighet fargestoffer. Døde celler kan ikke-spesifikt binder til antistoffer, og dermed skape falske positive resultater 19. I denne protokollen, bruker vi nukleinsyre flekken, DAPI som en levedyktighet fargestoff tilekskludere døde celler fra våre analyser som det best utfyller panel av fluorokromkonjugerte konjugerte antistoffer som brukes med minimale spektral overlapp. Imidlertid kan andre levedyktighet fargestoffer som 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) og propidium jodid (PI) brukes sammen med de beskrevne farging metoder, avhengig av panel av antistoffer som brukes. For tiden er det også en rekke låses død celle flekker tilgjengelig som lar fargede celler å være fast og permeabilized uten å miste evnen til å diskriminere levedyktighet (Invitrogen). Samlet andre flekker teknikker er også viktig for nøyaktig flowcytometri analyse. For eksempel, i denne protokollen, tillater bruk av 96-og V-bunnplater for små, konsentrerte mengder celler og reagenser som skal benyttes til analyse av MDSC og leukocyttprosenter med flowcytometri. Bruken av Master Mix (MM) tilnærming er også en betydelig teknikk for likt immunfluorescens merking av leukocytter i små mengder ved hjelp av enten 96-godt V-bunn plates eller FACS Tubes. Disse teknikkene redusere risikoen for krysskontaminering av prøvene, opprettholde sterile antistoffer og redusere mengden av reagenser og antistoffer som brukes.

Den autoMACS Pro Separator gir effektiv og automatisert isolering av celle populasjoner fra flere prøver, i noen arter. I denne protokollen, er indirekte magnetisk merking av leukocytter ved hjelp av Gr-1-PE antistoffer og magnetiske PE MicroBeads brukes til autoMACS anrikning av Gr-1 + leukocytter. Denne prosedyren kan endres for autoMACS separasjon bruke MicroBeads til andre fluorokromkonjugerte konjugert, biotinylated og ukonjugert primære antistoffer for anriking av ulike celle populasjoner 20. Men i denne prosedyren, anbefaler vi sterkt å bruke PE-konjugerte antistoffer og anti-PE-microbeads motsetning til FITC for eksempel, som PE molekylet sies å ha flere bindingsseter, noe som resulterer i sterkere og bedre magnetisk merking (Miltenyi Biotec ). En annen possible modifikasjon til denne protokollen er bruken av direkte magnetisk merking som det finnes et bredt utvalg av MACS MicroBeads for isolering av mennesker, mus og rotter leukocytter (Miltenyi Biotec). Imidlertid gir indirekte magnetisk merking ved hjelp av en fluorokromkonjugerte konjugert primær antistoff for flowcytometri evaluering av anriket eller utarmet leukocytter fraksjoner uten behov for ytterligere farging. Det finnes også en rekke MACS Separators tilgjengelig, men den autoMACS Pro Separator System er en fordel fordi det gir for høy hastighet, automatisk sortering av opptil seks prøver for skånsom utvalg av svært levedyktige leukocytter, i forhold til manuelle MACS Separators. Men manuelle MACS separatorer er hensiktsmessige alternativer til autoMACS Pro Separator, hvis tilgjengelig. For ytterligere å berike naive Gr-1 + leukocytter, en potensiell modifikasjon til denne protokollen vil være å å kjøre positivt samlet brøkdel bruk et nytt autoMACS kolonne på autoMACS Pro Separator. Berikelseav Gr-1 + tumor-bærende leukocytter ved hjelp av autoMACS Pro Separator ikke anbefales i denne protokollen siden dette fører til betydelig reduksjon i utvinning av GR-1 fraksjoner som disse cellene har en tendens til å holde seg til kolonnene under berikelse i forhold til naive leukocytter . Derfor anbefaler dette protokollen sterkt pooling tumor-bærende leukocytter for påfølgende FACS sortering av levedyktig MDSC.

Pre-beriket, samles naive leukocytter og samlet tumor-bærende leukocytter kan brukes for fremtidige anvendelser som lav hastighet FACS sortering for isolering av MDSC populasjoner. Denne protokollen er spesielt designet for å omgå kjedelige og rettidig FACS sortering av MDSC fra naive mus, noe som skyldes betydelig lavere prosenter av MDSC. AutoMACS anrikning av Gr-1 + leukocytter fra naive mus kan da for rask, praktisk og effektiv FACS sortering av levedyktig og funksjonell MDSC for sin bruk i in vivo ogin vitro eksperimenter. Direkte sortering av lowly uttrykt celle populasjoner som naiv MDSC er en svært ineffektiv prosess med lange slags tider, høye kostnader og redusert celle utvinning og levedyktighet. Forberedelse og autoMACS anriking av Gr-1 + leukocytter fra naive mus tar ca 45 minutter og øker MDSC prosenter større enn fire ganger (Figur 1). Dette berikelse reduserer tiden for FACS sortering fra ca 12 timer for ikke-beriket leukocytter til ca 20-30 minutter for isolering av minst 1x10 6 levedyktig, beriket MDSC fra poolede naive leukocytter. Men FACS sortering av levedyktig MDSC fra ikke-beriket, samlet leukocytter fra tumor-bærende mus vil kreve mindre tid på grunn av en økt overflod av MDSC prosenter i respons til tumor byrde. Det er viktig å merke seg at sortert MDSC og andre leukocytter kan deretter brukes i både funksjonelle analyser som blandede leukocytter reaksjoner (MLR) in vivo adoptivforeldre overføring eksperimenter 21 så vel som i ikke-funksjonelle tester, inkludert 22 Qrt-PCR, Western Blot 23 og Cytospin / mikroskopi analyser 14. Samlet kan dette protokollen endres for immunfenotyping og berikelse av immunosuppressive og andre leukocytter fra lymfevev eller perifert blod fra mus, rotte og mennesker som skal brukes i en overflod av in vivo og in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgements

Vi erkjenner USF flowcytometrisystemer Kjerne Facility. Vi ønsker å takke Dr. Denise Cooper for å dele ressurser. Vi ønsker også å takke Maya Cohen, Laura Pendleton og Diana Latour for deres hjelp i å sette opp og filmingen av denne videoen. NN støttet av NSF FG-LSAMP Bridge til doktorgrad Fellowship HRD # 0929435. Dette arbeidet ble finansiert av American Cancer Society Institutional Research Grant # 93-032-13/Moffitt Cancer Center tildelt TG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
  2. Zhu, B. CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).
  3. Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress. J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).
  4. Ghansah, T. Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses. J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).
  5. Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease. J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).
  6. Yin, B. Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models. J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).
  7. Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system. Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).
  8. Gallina, G. Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells. J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).
  9. Zhao, F. Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma. Immunology. 128, 141-149 (2009).
  10. Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. Myeloid derived suppressor cells in human diseases. Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).
  11. Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).
  12. Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells. Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).
  13. Pilon-Thomas, S. Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function. PLoS One. 6, (2011).
  14. Panopoulos, A. D. STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils. Blood. 108, 3682-3690 (2006).
  15. Preynat-Seauve, O. Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process. Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).
  16. Davies, D. Cell separations by flow cytometry. Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).
  17. Maecker, H., Trotter, J. Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry. Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).
  18. Bagwell, C. B., Adams, E. G. Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters. Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).
  19. Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
  20. Safarik, I., Safarikova, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).
  21. Collazo, M. M. SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment. Blood. 113, 2934-2944 (2009).
  22. Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures. Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).
  23. Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS One. 4, e5994 (2009).

Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics