Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS)

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Summary

Dies ist eine schnelle und umfassende Methode der Immunphänotypisierung Myeloide Suppressorzellen (MDSC) und bereichernde Gr-1

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Nelson, N., Szekeres, K., Cooper, D., Ghansah, T. Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS). J. Vis. Exp. (64), e3875, doi:10.3791/3875 (2012).

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Abstract

MDSC sind eine heterogene Population von unreifen Makrophagen, dendritischen Zellen und Granulozyten, die in lymphatischen Organen bei pathologischen Zuständen einschließlich parasitäre Infektionen, Entzündungen, traumatischen Stress, Graft-versus-host-Krankheit, Diabetes und Krebs 7.1 ansammeln. Bei Mäusen, MDSC ausdrückliche Mac-1 (CD11b) und Gr-1 (Ly6G und Ly6C) Oberflächenantigene 7. Es ist wichtig zu beachten, dass MDSC auch in verschiedenen Tumor-tragenden Hosts, wo sie deutlich erweitert werden untersucht und zu unterdrücken Anti-Tumor-Immunantwort gegenüber naiven Kollegen 7-10. In Abhängigkeit von den pathologischen Zustand, gibt es verschiedene Subpopulationen von MDSC mit unterschiedlichen Mechanismen und Ziele der Unterdrückung 11,12. Daher sind wirksame Mittel zur lebensfähigen MDSC Populationen zu isolieren, die Aufklärung ihrer verschiedenen molekularen Mechanismen der Unterdrückung in vitro und in vivo.

Vor kurzem hat die Ghansah Gruppe hat den Ausbau MDSC in einem murinen Pankreaskarzinom-Modell berichtet. Unsere tumortragenden MDSC zeigen ein Verlust der Homöostase und erhöht suppressive Funktion im Vergleich zu naiven MDSC 13. MDSC Prozentangaben sind deutlich weniger in lymphoiden Kompartimente von naiven vs Tumor-tragenden Mäusen. Dies ist eine große Einschränkung, die oft behindert genaue vergleichende Untersuchungen dieser MDSC. Deshalb bereichern Gr-1 + Leukozyten aus naiven Mäusen vor Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) erhöht Reinheit, Viabilität und reduziert Art Zeit. Allerdings ist die Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten aus tumortragenden Mäusen optional, da diese in Hülle und Fülle für die schnelle FACS-Sortierung sind. Daher wird in diesem Protokoll beschreiben wir eine hocheffiziente Methode der Immunphänotypisierung MDSC und bereichernde Gr-1 + Leukozyten aus Milzen von naiven Mäusen für die Sortierung MDSC in einer fristgerechten Weise. Immunkompetenten C57BL / 6 Mäusen mit murinem Panc02 ce inokuliertlls subkutan während naive Mäuse erhalten 1XPBS. Etwa 30 Tage nach der Inokulation, Milzen entnommen und in den Single-Zellsuspensionen mit einem Zellabtrennungssiebes verarbeitet. Milzzellen werden dann Rote Blutkörperchen (RBC) lysiert und ein Aliquot dieser Leukozyten angefärbt mit Fluorochrom-konjugierten Antikörper gegen Mac-1 und Gr-1 zu Immunphänotyp MDSC Prozentsätze mittels Durchflusszytometrie. In einem parallelen Experiment, werden ganze Leukozyten aus naiven Mäusen mit fluoreszierenden konjugierten Gr-1-Antikörper, mit PE-Microbeads inkubiert und positiv selektiert mit Hilfe eines automatisierten Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator gefärbt. Als nächstes wird ein Aliquot der Gr-1 + Leukozyten mit Mac-1-Antikörper gefärbt, um die Erhöhung der MDSC Prozentwert mit Durchflusszytometrie zu identifizieren. Nun sind diese Gr1 + angereicherten Leukozyten bereit für FACS-Sortierung von MDSC in vergleichenden Analysen verwendet werden (naiv vs tumortragenden) in in vivo und in vitro

Protocol

Vor dem Start, bereiten Sie die folgenden Lösungen:

3% Färbung Media (SM):

-3% Fötalem Rinderserum (FBS) in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)

MACS-Puffer (MB):

- 0,5% Albumin aus Rinderserum (BSA) in 1XPBS

1. Ernte Milz von Mäusen

  1. Subkutan injizieren 6-8 Wochen im Alter von C57BL / 6 Mäuse (Harlan) mit 1,5 x 10 5 Panc02 murinen Zellen in 100 ul 1x PBS suspendiert (tumortragenden; TB). Kontrollmäusen (Naive) erhalten 100 ul 1XPBS.
  2. Etwa 4 Wochen nach der Injektion, einschläfern Mäusen durch Kohlendioxid erstickend wirken.
  3. Ernte Milz von Mäusen durch stumpfe Dissektion mit einer Pinzette und Schere dann wiegen mit einer Waage. Ort Milz in separaten, etikettiert 50 ml konischen Röhrchen mit 1 x PBS.

2. Generieren Sie ein Einzel-Zell-Federgabeln von Leukozyten aus Milz

Alle Verfahren sollten in einer sterilen Umgebung unter einem Biologische Sicherheit Hood und Zellen und Antikörper auf Eis gehalten durchgeführt werden.

  1. Montieren Zellabtrennungssiebes durch Einsetzen des Mesh-Sieb in die Öffnung des Bechers nach unten. Dann legen Sie den Sicherungsring in das Gewinde mit der geschlitzten Seite nach oben und mit dem Ring-Taste, um den Haltering ziehen und hält so den Bildschirm an Ort und Stelle. Setzen Sie den montierten Sieb in eine Petrischale mit 10 ml 1 x PBS.
  2. Pool Milz und Formate Glas Pistill zu Milz gegen die Mesh-Sieb des Zellabtrennungssiebes und in die Petrischale zu schleifen. Wiederholen für jede Behandlung von Mäusen.
  3. Filter Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen mit einer 70 um Zellsieb und eine 5 ml serologische Pipette. Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min.
  4. Überstand abnehmen und Pellet in 5 ml 1 x RBC Lysispuffer pro Milz. Jeweils oben und unten kräftig. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Die Reaktion durch Zugabe von 20 ml 1 x PBS. Jeweils oben und unten kräftig. Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min.
  5. Überstand abnehmen und Pellet in 20 ml sterilem 1 x PBS. Jeweils oben und unten kräftig.
  6. Zählen von Zellen unter Verwendung von Trypanblau und eines Hämozytometers und resuspendieren in gewünschten Konzentration in 3%, so dass SM 50 ul entspricht 5x10 5-1x10 6 Zellen (1x10 7 Zellen / ml - 2x10 7 Zellen / ml).

3. Zelloberflächen-Bemalen / Immunphänotypisierung von MDSC mittels Durchflusszytometrie

  1. Beschriften Sie die Vertiefungen einer 96-Well-V Bodenplatte für die Steuerung und experimentellen Proben und einzelne Flecken auf Ersatz Kontrollen (keine Flecken, NS, Mac-1-FITC; Gr-1-APC und DAPI).
  2. In 5x10 5-1x10 6 Zellen in Höhe von 50 ul / Vertiefung von Splenozyten ihren jeweiligen Vertiefungen in der 96-Well-V-Bodenplatte. ZentrifugierenPlatte bei 12.000 rpm (250-300 × g) für 5 min.
  3. Bereiten Sie "Master Mix" (MM) der Maus BD FC-Baustein (Ratte anti-Maus-CD16/32 monoklonaler Antikörper) in 3% SM verdünnt, in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Als Ausgangspunkt verwenden 1 pg FC-Baustein in 3% SM für ein Endvolumen von 50 ul, pro Vertiefung.
  4. Entfernen Sie vorsichtig Überstand aus jeder Vertiefung der 96-Loch-V-Bodenplatte durch schnelles Umdrehen der Platte über und zurück, über einen Abfallbehälter oder ein Waschbecken ohne Störung der Zell-Pellets.
  5. Vortex, kurz zentrifugieren FC-Baustein MM für 5 Sekunden und 50 ul zu allen Pellets im 96-Well-V-Bodenplatte. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren, so dass Proben in ihre Brunnen. Inkubieren Platte für 15 min im Dunkeln auf Eis. Zentrifugenplatte bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min.
  6. Bereiten Sie "Master Mix" (MM) von Fluorochrom-konjugierte Antikörper in 3% SM in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis verdünnt, während Proben mit FC-Baustein inkubieren. Antikörper sollten titriert werdenum optimale Verdünnung für Färbeverfahren zu bestimmen. Als Ausgangspunkt, kombinieren eine Verdünnung von 1.25 Mac-1-FITC und 1:20 Verdünnung von Gr-1-APC in 3% SM für ein Endvolumen von 50 ul, pro Probe gut.
  7. Vorsichtig Überstand zu entfernen aus jeder Vertiefung der 96-Well-V-Boden, wie zuvor beschrieben.
  8. Vortex, kurz zentrifugieren MM von fluoreszierenden-konjugierte Antikörper-Färbung für 5 Sekunden und 50 ul, die Kontrolle und experimentelle Pellets. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Für Single-Fleck Kompensationen, fügen Sie eine Verdünnung von 1.25 Mac-1-FITC, 1:20 Verdünnung von Gr-1-APC und 75 ng / ml DAPI, in 3% SM für ein Endvolumen von 50 ul pro Well an ihre jeweiligen Brunnen. Dann werden 50 ul 3% auf gut SM ungefärbt (keine Flecken). Gut mischen und inkubieren Zellen in 96-Well-V-Bodenplatte für 30 min im Dunkeln auf Eis.
  9. Label-FACS-Röhrchen (5 ml, 12 mm x 75 mm Polystyrol Rundbodengefäße) zu jeder Vertiefung in der 96-Well-V-Bodenplatte entsprechen. Geben Sie 200 ul 3% SM zu jedem FACSRohr.
  10. Zentrifugenplatte bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min und Überstände entfernen. Waschen Sie Pellets durch Zugabe von 100 ul 3% SM zu jedem Pellet und mischen Sie gut durch leichtes Auf-und Abpipettieren. Zentrifugenplatte bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min. Wiederholen Sie Schritt noch einmal zu waschen.
  11. Vorsichtig Überstand zu entfernen aus jeder Vertiefung der 96-Well-V-Boden, wie zuvor beschrieben. Resuspendieren jedes Pellet in 100 ul 3% SM und gut mischen.
  12. Übertragen Sie 100 ul resuspendierten Pellets aus jedem Well der 96-Loch-V-Bodenplatte, um ihre jeweils beschriftet FACS-Röhrchen.
  13. Vor-Zytometrie-Analyse fließen, fügen 75 ng / ml DAPI zu steuern und zu experimentellen Proben und DAPI einzigen Fleck-Kompensation.
  14. Führen Sie die durchflusszytometrische Erfassung von MDSC Prozentsätze. Führen Ausgleich mit dem negativen (keine Flecken Kontrolle) und die einzige positive Kontrollen. Richten Sie eine Dot-Plot, der die nach vorn (FSC) gegen seitliche Streulicht (SSC) in Log-Skala zeigt, so dass Leukozyten-Populationen vonInteresse identifiziert werden kann. Zeichnen Sie ein großes Tor auf allen Leukozyten, ohne Schmutz und Klümpchen mit niedrigsten Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht. Von diesem übergeordneten Tor, erstellen Sie einen neuen Dot-Plot, der SSC gegen DAPI und Tor zeigt auf DAPI-(Live-) Zellen. Wählen Sie diese neu gated Bevölkerung und schaffen eine Dot-Plot, der Mac-1 gegen Gr-1 und Tor zeigt auf Ihrem doppelt positiven (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC.

4. Magnetischen Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten

  1. Aliquotieren 1x10 7 verbleibenden ungefärbten Leukozyten in entsprechend beschriftete FACS-Röhrchen und zentrifugieren bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min.
  2. Planen MM von Gr-1-PE-Antikörper in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für bis zu 10 7 Zellen, verwenden Sie eine 1:10 Verdünnung von Gr-1-PE-Antikörper in 50 l MB, pro Probe. Für größere Zellzahlen, bis Volumina entsprechend zu skalieren. Kurz für 5 Sekunden zentrifugiert, in den Leukozyten in FACS-Röhrchen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln. 2 ml MB auf FACS-Röhrchen, Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min und Überstand verwerfen.
  3. Bereiten MM von Anti-PE MicroBeads in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für bis zu 10 7 Zellen, verwenden Sie ein 1:4-Verdünnung des Anti-PE MicroBeads in 200 ul MB, pro Probe. Für größere Zellzahlen, bis Volumina entsprechend zu skalieren. Kurz für 5 Sekunden zentrifugiert, in den Leukozyten in FACS-Röhrchen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln.
  4. 2 ml MB auf FACS-Röhrchen, Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min und Überstand verwerfen. Pellet in 3 ml SB. Anschließend wird durch ein 70 um Sieb in eine neue, markierte 50 ml konischen Röhrchen.
  5. Vorbereiten und grundieren Auto MACS Separator Pro. Refill alle Flaschen mit den entsprechenden Lösungen und leeren die Abfallbehälter, falls erforderlich. Gerät einschalten und prüfen Status der Flüssigkeitsbehälter und Spalte (n) nach der Initialisierung. Alle Symbole sollte grün leuchten. Auf dem Menü wählen Sie "Trennung" von der oberenMenüleiste gefolgt von "Jetzt waschen" aus der unteren Menüleiste. Wählen Sie "Spülen" aus dem Pop-up-Option von "Run", um die Grundierung zu starten gefolgt. Sobald die Grundierung Prozess erfolgreich abgeschlossen ist, wird das Instrument zeigt dann, dass es "Ready for Separation" unter dem Status-Menü.
  6. Wählen Sie die passende gekühlt Tube-Rack für Rohrdurchmesser und Platz 50 ml konischen Röhrchen mit magnetisch markierte Zellen in Reihe A, 50 ml konischen Röhrchen für die negative Fraktion Sammlung in Zeile B und 15 ml konischen Röhrchen für die positive Fraktion Sammlung in der Reihe C
  7. Wählen Sie "POSSEL_S" Zellseparation Programm für die positive Selektion von markierten Zielzellen in sensiblen Modus von Proben. Die magnetisch markierte Zielzellen auf der Säule zurückgehalten Automaten; unmarkierten Zellen in der negativen Fraktion Sammelrohr in der Zeile B. über automatisierte Zurückziehen des Magneten losgelassen wird, die markierten Zielzellen, in die positive Sammelrohr in Reihe C des Rohrs freigegeben Rack.

+ Enriched Leukozyten

  1. Recount Gr-1 + und Gr-1 - Fraktionen unter Verwendung von Trypanblau und eine Hämazytometer. Die Zellen in der gewünschten Konzentration in 3% Färbung Medium, so daß 50 ul entspricht 5x10 5-1x10 6 Zellen (1x10 7 Zellen / ml - 2x10 7 Zellen / ml) zugefügt und 50 ul entsprechend markierten FACS-Röhrchen.
  2. Vorbereiten einer MM von Mac-1 nur bei 1:25 Verdünnung in 3% SM auf ein Endvolumen von 50 ul pro Probe. Stain Zellen und bereiten einzigen Fleck Kompensationen von Gr-PE, Mac-1 FITC und DAPI für die Durchflusszytometrie-Analyse. Geben Sie 200 ul 3% SM und DAPI Lebensfähigkeit Farbstoff wie zuvor beschrieben.
  3. Führen durchflusszytometrische Datenerfassung bis Gr-1 + und Gr-1 zu bestimmen - und Prozentsätze zu vergleiche auch MDSC Prozentsätze Pre-und Post-autoMACS Bereicherung.

6. Repräsentative Ergebnisse

Hier zeigen wir r epräsentativer Ergebnisse für autoMACS Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten aus gepoolten, naiv Milz für die anschließende FACS-Sortierung von MDSC (Abbildung 1). 1x10 6 naiv Leukozyten wurden mit Mac-1-FITC und Gr-1-APC-Antikörpern gefärbt, um MDSC Prozentsätze mit einem BD LSRII Instrument zu identifizieren, vor autoMACS Sortierung. 1x10 7 naiven Leukozyten wurden dann mit Anti-Gr-1-PE und PE-Antikörper MicroBeads zur Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten unter Verwendung eines autoMACS Pro Separator gefärbt. Post-autoMACS Bereicherung, Gr-1 Prozentsätze in Gr-1 + und Gr-1 - gesammelten Fraktionen wurden mittels Durchflusszytometrie. 1x10 6 Gr-1 + Leukozyten wurden entfernt und mit Mac-1-FITC-Antikörper zu analysieren und zu vergleichen, MDSC Prozentsätze von angereichertem, vereinigt naiven Leukozyten an nicht-angereicherten, Tumor-tragenden vereinigt Leukozyten mittels Durchflußzytometrie gefärbt.

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Abbildung 1. AutoMACS Anreicherung von Naive Gr-1 + Leukozyten für MDSC FACS-Sorting. Die Milz wurde von Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen und naiv geerntet und verarbeitet in den Single-Zellsuspensionen. Durchflusszytometrie-Analyse von naiven Leukozyten Oberfläche mit Mac-1 und Gr-1 Fluoreszenz-konjugierte Antikörper gefärbt, vor autoMACS Bereicherung (A). Durchflusszytometrie-Analyse von Gr-1 + (B) und Gr-1 - (C) Fraktionen post-autoMACS Anreicherung von Gr-1 + Zellen aus gepoolten naiv leuckocytes mit Gr-1-PE-Antikörper und anti-PE MicroBeads gefärbt. Durchflusszytometrie-Analyse der MDSC und Gr-1 + Prozentsätze nach autoMACS Anreicherung von Gr-1 +-Zellen aus naiven vereinigt Leukozyten (D) im Vergleich zu nicht-angereicherte vereinigt Leukozyten aus Tumor-tragenden Mäusen (E) (naive Mäuse, n = 5 , Tumor-tragenden Mäusen, n = 3). MDSC und Gr-1 Prozentsätze sind gated in den repräsentativen Konturdiagramme und Histogramme.

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Discussion

Dies ist eine detaillierte Verfahren zum Verarbeiten und immunophentyping MDSC Populationen, die für verschiedenen lymphoiden Geweben von verschiedenen Tiermodellen ist. Insbesondere kann autoMACS Anreicherung für die Isolierung von verschiedenen Leukozytenpopulationen einschließlich Gr-1 Depletion von Splenozyten 4, Reinigung von myeloiden Teilmengen aus Milzzellen und Lymphknoten 5, Isolierung von Knochenmark Neutrophilen 14 und Reinigung von CD8 + T-Zellen aus der Milz verwendet werden und 15 Lymphknoten. Unabhängig von der Zellpopulation von Interesse, generiert Einzel-Zell-Suspensionen von Leukozyten aus den gewünschten lymphatischen Gewebe für eine optimale Oberfläche Färbung, Durchflusszytometrie-Analyse, Anreicherung und autoMACS FACS-Sortierung erforderlich. In diesem Protokoll haben wir mechanische Trennung, um eine einzelne Zellsuspension von Leukozyten zu schaffen. Die Verwendung Enzymverdau wie Collagenase D ist auch eine adäquate Alternative zu diesem Protokoll zu erhöhendie Ausbeute von Leukozyten aus der Milz oder anderen lymphatischen Organen 5.

Die Durchflusszytometrie ist eine wichtige Technik für Immunphänotypisierung Leukozyten. Daher angemessene Vorbereitung für die Durchflusszytometrie und Anreicherung erfordert auch den Einsatz von geeigneten Puffer für Zell-Suspension und der Verdünnung der Antikörper-Reagenzien. Viele Protokolle wechseln zwischen FBS und BSA für die Vorbereitung und Färbung Medien MACS-Puffer. Allerdings sind diese Reagenzien auch im Handel erhältlich von Firmen wie eBioscience, BD Pharmingen und Miltenyi Biotec. Wie von Miltenyi Biotec und eBioscience erläutert, zu verhindern, sind BSA und FBS nicht-spezifische Bindung, wenn Färbung Leukozyten mit Fluorochrom-konjugierten Antikörper. Noch wichtiger ist, sorgt für einen niedrigen Prozentsätze dieser Tier Serumproteine ​​Lebensfähigkeit und verhindern das Verklumpen von Leukozyten 16. Aber aus unserer Erfahrung, arbeitet BSA besser für eine optimale Färbung und eine bessere Auflösung als Bereicherung für autoMACS FBS und Empfehlungen istDED in der beschriebenen Protokoll.

In diesem Protokoll, dadurch gekennzeichnet wir murinen MDSC mit CD11b-FITC und Gr-1-APC Fluoreszenz-konjugierte Antikörper und Durchflusszytometrie. Es ist zwingend notwendig, um diese Antikörper vor titrieren zu nutzen, um hohe Hintergrundfluoreszenz Färbung zu reduzieren, um nicht-optimale Ergebnisse zu verhindern. Darüber hinaus ist bei der Wahl Antikörper für den Mehrfarbendruck Durchflusszytometrie-Analyse, können spektrale Überlappung der Fluorochrome auch ein weiterer kritischer Faktor, der berücksichtigt werden 17,18. Daher steuert eine Entschädigung in Form von einzelnen Farbflecken für jeden fluorochome-konjugierte Antikörper von Zinsen oder Entschädigung Perlen, können für Fragen der spektrale Überlappung 18 zu korrigieren. Ein weiterer wichtiger Aspekt für die genaue Durchflusszytometrie Ergebnisse ist die Verwendung der Rentabilität Farbstoffe. Die lysierten Zellen werden nicht spezifisch an Antikörper binden, wodurch falsch-positiven Ergebnissen 19. In diesem Protokoll, verwenden wir die Nukleinsäure Fleck, DAPI als Farbstoff zur Lebensfähigkeitauszuschließen toten Zellen aus unseren Analysen ergänzt, wie es am besten das Panel von Fluorochrom-konjugierte Antikörper mit minimaler spektrale Überlappung verwendet. Jedoch können andere Farbstoffe, wie Lebensfähigkeit 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) und Propidiumiodid (PI) mit den beschriebenen Färbeverfahren in Abhängigkeit von der Gruppe von Antikörpern verwendet werden. Derzeit gibt es auch eine Reihe von Flecken fixierbar tote Zelle zur Verfügung, die gefärbten Zellen fixiert und ohne die Fähigkeit der Rentabilität (Invitrogen) zu unterscheiden permeabilisiert werden können. Insgesamt sind die anderen Färbetechniken auch für eine genaue Analyse der Durchflusszytometrie wichtig. Zum Beispiel wird in diesem Protokoll ermöglicht die Verwendung von 96-Well-Platten mit V-Boden für kleine, konzentrierte Mengen von Zellen und Reagenzien für die Analyse der MDSC und Leukozytenprozentzahlen mittels Durchflusszytometrie verwendet werden. Die Verwendung des PCR Master Mix (MM) Ansatz ist auch eine signifikante Technik für gleiche Immunfluoreszenz Markierung von Leukozyten in kleinen Volumina entweder 96-Well-V-Boden plAtes oder FACS-Tubes. Diese Techniken reduzieren das Risiko einer Kreuzkontamination von Proben, steril zu halten und Antikörper reduzieren die Menge an Reagenzien und Antikörpern verwendet.

Die autoMACS Pro Separator ermöglicht eine effiziente und automatisierten Isolierung von Zellpopulationen von mehreren Proben in jeder Spezies. In diesem Protokoll wird indirekten magnetischen Markierung von Leukozyten mit Gr-1-PE-Antikörper und magnetischen PE MicroBeads für autoMACS Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten verwendet. Dieses Verfahren kann für autoMACS Trennung unter Verwendung MicroBeads zu anderen Fluorochrom-konjugierten, biotinylierten und unkonjugierten primären Antikörper für die Anreicherung von verschiedenen Zellpopulationen 20 geändert werden. Allerdings ist in diesem Verfahren, empfehlen wir dringend, die PE-konjugierte Antikörper und anti-PE-Mikrokügelchen als FITC zum Beispiel im Gegensatz, wie das PE-Molekül wird gesagt, mehrere Bindungsstellen aufweisen, was zu einer stärkeren und besseren magnetischen Markierung (Miltenyi Biotec ). Ein weiterer pzugenäht Änderung dieses Protokolls ist die Verwendung von direkten magnetischen Kennzeichnung, da es eine Vielzahl von MACS MicroBeads zur Isolierung von Mensch, Maus und Ratte Leukozyten (Miltenyi Biotec) sind. Jedoch eine indirekte magnetische Markierung mit einem Fluorochrom-konjugierten primären Antikörper für die Durchflusszytometrie Bewertung der angereicherten oder abgereicherten Leukozytenfraktionen ohne zusätzliche Färbung. Es gibt auch eine Vielzahl von MACS Separatoren verfügbar, aber die autoMACS Pro Separator System ist vorteilhaft, da sie für hohe Geschwindigkeit und automatische Sortierung von bis zu sechs Proben für die sanfte Auswahl von hochvitalen Leukozyten, im Vergleich zum manuellen MACS Separatoren können. Allerdings sind manuelle MACS-Separatoren geeignete Alternativen zur autoMACS Pro Separator, falls verfügbar. Zur weiteren Bereicherung naiv Gr-1 + Leukozyten, ein potenzieller Änderungen an diesem Protokoll wäre es, erneut ausführen positiv gesammelten Fraktion mit einer neuen Spalte auf der autoMACS autoMACS Pro Separator. Bereicherungvon Gr-1 + tumortragenden Leukozyten mit dem autoMACS Pro Separator wird in diesem Protokoll, da dies zu signifikanten Reduktion der Erholung der Gr-1-Fraktionen zu empfehlen, da diese Zellen zu den Säulen während der Anreicherung im Vergleich zu nicht vorbehandelten Leukozyten kleben neigen . Daher wird in diesem Protokoll empfiehlt dringend, die Bündelung tumortragenden Leukozyten für die anschließende FACS-Sortierung von lebensfähigen MDSC.

Pre-angereicherten, nicht vorbehandelten Leukozyten vereinigt und vereinigt Tumor-tragenden Leukozyten für zukünftige Anwendungen wie Low-Speed-FACS-Sortierung für die Isolierung von Populationen MDSC kann. Dieses Protokoll wurde speziell entwickelt, um langwierige und rechtzeitige FACS-Sortierung von MDSC aus naiven Mäusen, die aufgrund der deutlich geringeren Prozentsätze von MDSC ist zu umgehen. AutoMACS Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten aus naiven Mäusen ermöglicht dann für eine schnelle, bequeme und effiziente FACS-Sortierung von zukunftsfähigen und praktikablen MDSC für ihre Verwendung in In-vivo-undIn-vitro-Experimenten. Direkte Sortierung von niedrig exprimierter Zellpopulationen wie naiv MDSC ist ein sehr ineffizienter Prozess mit langwierigen Art, hohe Kosten und geringere Erholung der Zellen und Lebensfähigkeit. Vorbereitung und autoMACS Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten aus naiven Mäusen dauert ungefähr 45 Minuten und erhöht die MDSC Prozentzahlen größer als 4-fach (Abbildung 1). Diese Anreicherung verkürzt die FACS-Sortierung von etwa 12 Stunden für nicht-angereicherten Leukozyten auf etwa 20-30 Minuten für die Isolierung von mindestens 1x10 6 lebensfähigen, angereicherten MDSC aus gepoolten naiven Leukozyten. Jedoch vereinigt FACS-Sortierung von lebensfähigen MDSC aus nicht-angereicherte, Leukozyten aus Tumor-tragenden Mäusen erfordert weniger Zeit aufgrund einer erhöhten Häufigkeit der MDSC Prozentsätze in Reaktion auf die Tumorlast. Es ist wichtig zu beachten, dass sortiert MDSC und andere Leukozyten können dann in beiden funktionellen Assays wie gemischte Leukozyten (MLR) verwendet werden in vivo Experimenten adoptiven Transfer 21 sowie in nicht-funktionale Tests, einschließlich qRT-PCR 22, 23 und Western Blot Zytospin / Mikroskopie analysiert 14. Insgesamt kann dieses Protokoll für die Immunphänotypisierung und die Anreicherung von Immunsuppressiva und anderen Leukozyten aus Lymphgewebe oder dem peripheren Blut von Mäusen, Ratten und Menschen in einer Vielzahl von in vivo und in vitro-Assays verwendet werden, modifiziert werden.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Wir erkennen die USF Durchflusszytometrie Core Facility. Wir möchten Dr. Denise Cooper für den Austausch von Ressourcen zu danken. Wir möchten auch Maya Cohen, Laura Pendleton und Diana Latour für ihre Unterstützung danken, bei der Einrichtung und der Dreharbeiten zu diesem Film. NN von der NSF FG-LSAMP Brücke zur Promotion Fellowship HRD # 0929435 unterstützt. Diese Arbeit wurde von der American Cancer Society Institutional Research Grant # 93-032-13/Moffitt Cancer Center ausgezeichnet zu TG finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1X Phosphate Buffered Saline Thermo Scientific Hyclone SH30028.02 Ca2+/Mg2+/Phenol Red-free
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7906 Let BSA dissolve undisturbed in PBS; Sterile Environment
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Scientific Hyclone SV3001403HI Heat Inactivated; Sterile Environment
Rat anti-mouse CD16/32 monoclonal antibody (Fc Block) BD Biosciences 553142 Sterile Environment
Anti-mouse CD11b (Mac-1) FITC eBioscience 11-0112 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) APC eBioscience 17-5931 Sterile Environment
Anti-mouse Ly6G (Gr-1) PE eBioscience 12-5931 Sterile Environment
DAPI Invitrogen D1306 Serial Dilution Sterile Environment
Cell Dissociation Sieve Sigma-Aldrich CD1-1KT Autoclave before use
70-μm strainer BD Biosciences 352350 Sterile Environment
1X RBC Lysis Buffer eBioscience 00-4333-57 Warm to room temperature before use; Sterile Environment
Petri dishes Fisher Scientific 08-757-12 Sterile Environment
50ml conical tubes Thermo Fisher Scientific, Inc. 339652 Sterile Environment
5ml 12X75mm polystyrene round bottom tubes BD Biosciences 352054 Known as FACS tubes; Sterile Environment
96-well V-bottom plates Corning 3897 Sterile Environment
Trypan Blue Cellgro 25-900-CI Sterile Environment
PE MicroBeads Miltenyi Biotec 130-048-801 Sterile Environment
AutoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545
AutoMACS Columns Miltenyi Biotec 130-021-101
AutoMACS Running Buffer Miltenyi Biotec 130-091-221

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References

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Comments

2 Comments

  1. very good

    Reply
    Posted by: jin f.
    July 1, 2012 - 10:01 AM
  2. excellent

    Reply
    Posted by: Somayeh A.
    January 24, 2014 - 10:22 AM

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