On-chip Isotachophoresis til adskillelse af ioner og oprensning af nukleinsyrer

Bioengineering
 

Summary

Isotachophoresis (ITP) er en robust elektrokinetiske separation og preconcentration teknik med ansøgninger fra toksin afsløring til prøveforberedelse. Vi gennemgår de fysiske principper for ITP, og den metode at anvende denne teknik til to specifikke eksempel programmer: adskillelse og detektion af små molekyler og oprensning af nukleinsyrer fra cellekultur lysat.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Garcia-Schwarz, G., Rogacs, A., Bahga, S. S., Santiago, J. G. On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (61), e3890, doi:10.3791/3890 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Elektrokinetiske teknikker er et dagligt syn i mikroskala applikationer på grund af deres unikke evne til at udføre en bred vifte af fluidisk og elektroforetiske processer i enkle, kompakte systemer med ingen bevægelige dele. Isotachophoresis (ITP) er en enkel og robust elektrokinetisk teknik, kan opnå million-fold preconcentration 1,2 og effektiv separation og ekstraktion baseret på ionisk mobilitet. 3 For eksempel har vi vist, at anvendelsen af ITP til separation og følsom detektion af umærket ioniske molekyler (f.eks toksiner, DNA, rRNA, miRNA) med ringe eller ingen prøveforberedelse 4-8 og til ekstraktion og oprensning af nukleinsyrer fra komplekse matricer, herunder cellekulturer, urin og blod. 9-12

ITP opnår fokusering og separation under anvendelse af en påført elektrisk felt og to buffere i en strømningsteknisk kanalsystem. For anioniske analytter er ledende elektrolyt (LE) puffer valgt sn sådan at dens anioner har højere effektiv elektroforetisk mobilitet end anioner af den bageste elektrolyt (TE)-buffer (Effektiv mobilitet beskriver observerbare drift hastighed af en ion-og tager hensyn til ionisering tilstand ion, som beskrevet i detaljer af Persat et al 13). Efter oprettelse af en grænseflade mellem TE og LE er et elektrisk felt anvendes sådan, at LE ioner bevæge sig væk fra området besat af TE ioner. Eksempler på ioner af mellemliggende effektiv mobilitet løb foran TE ioner, men kan ikke overhale LE ioner, og så de fokuserer på LE-TE interface (herefter kaldet "ITP grænseflade"). Endvidere TE og Le danner regioner henholdsvis lav og høj ledningsevne, der etablerer en stejl elektrisk felt gradient ved ITP grænsefladen. Dette felt gradient preconcentrates prøve arter, som de fokuserer. Korrekt valg af TE og LE resultater i fokus og rensning af målarter fra andre ikke-fokuserede arter og i sidste ende, separation end adskillelse af prøve arter.

Vi her gennemgå de fysiske principper bag ITP og diskutere to standard driftsformer: "peak" og "plateauet" tilstande. Den maksimale indstilling, fortyndes relativt prøveioner koncentreres sammen i overlappende snævre toppe ved ITP grænsefladen. I plateau-tilstand, når mere rigelige prøveioner en steady state-koncentration og adskiller sig i tilstødende plateau-lignende zoner, ordnet efter deres effektiv mobilitet. Peak og plateau tilstande udspringer af de samme underliggende fysik, men repræsenterer forskellige regimer differentieret på grundlag af den indledende analytkoncentration og / eller den tid der er afsat til prøven akkumulering.

Vi først beskrive i detaljer en model top tilstand eksperiment og derefter viser en top tilstand assay til ekstraktion af nukleinsyrer fra E. coli cellekultur. Vi konkluderer ved at præsentere et plateau tilstand analyse, hvor vi bruger en ikke-fokus sporstof (NFT) arter til at visualisere den separation og prdannelse kvantificering af aminosyrer.

Protocol

1. Fysik af ITP

ITP danner en skarp bevægelig grænse mellem ioner af samme ladning. Teknikken kan udføres med anioniske eller kationiske prøver, men vi skræddersyr denne introduktion til anioniske ITP og notere de samme principper gælder for kationiske ITP. Vi vælger LE og TE buffere, sådan at LE ioner har højere størrelsesorden effektiv elektroforetiske mobilitet. Den effektive elektroforetiske mobilitet, μ = U / E, er proportionalitet konstant mellem anvendt elektrisk felt, E, og ion drift hastighed, U. 13 Vi etablerer en diffus grænseflade mellem LE og TE og anvende et elektrisk felt rettet fra høj- ledningsevne LE zone til lav ledningsevne TE zone. Systemet hurtigt etablerer en stærk gradient i elektriske felt ved ITP grænsefladen på grund af uensartet konduktivitetsprofilen. Pr. sit navn (fra græsk, "ISO'er" betyder "lige", "takhos" betyder "speed"), TE og LE ioner rejse på samme, ensartede vehe, som et resultat af den ikke-ensartet elektrisk felt og bevarelse af strøm (dette er den såkaldte "ITP tilstand", se figur 1).

ITP grænsefladen selvskærpende: LE ioner, der diffunderer ind i TE zone oplever et stærkt genoprette flux og vende tilbage til den forreste zone (og vice versa for TE-ioner i LE zone). Prøveioner koncentreres ved denne grænseflade, hvis deres effektive mobilitet i TE zone er større end af TE co-ioner, og hvis deres effektive mobilitet i LE zone er mindre end de LE co-ioner (se figur 1). Den selvslibende og fokusering egenskaber ITP bidrage til robustheden af ​​denne teknik og gøre ITP relativt ufølsom over for forstyrrelser af brugerfladen (fx på grund af tryk-drevet flow eller ændringer i geometri, såsom sammentrækninger og udvidelser, og vender sig).

I peak-tilstand ITP (se figur 2a og videoer 1-2), er eksempler ionkoncentrationerpå alle tidspunkter signifikant lavere end LE, og TE ionkoncentrationer og bidrager derfor forsvindende til lokal ledningsevne. Fordelingen af prøveioner bestemmes af selvskærpende grænseflade mellem tilstødende zoner (her TE og LE) og værdien af prøven effektiv mobilitet i forhold til disse zoner. 14 Multiple prøveioner koncentreres under samme smalle ITP grænsefladeregionen som hovedsagelig overlappende toppe. Grænsefladen og den maksimale bredde, såvel som det tilhørende preconcentration faktor, omfattende omvendt med den tilførte strøm (se forsøg i figur 2b). 14

For tilstrækkeligt høje indledende prøvernes koncentrationer og tilstrækkelig ophobning tid, nå prøveioner en tærskel koncentration værdi. For fuldt ioniserede arter, er denne værdi bestemmes af Kohlrausch regulerende funktion (KRF). 15 for svage elektrolytter, er det bestemt af Alberty og Jovin funktioner. 16,17 I plateautilstand, som vist i figur 3 og video 3, prøveioner separere og oprense i zoner med lokalt ensartet og konstant koncentration i en rækkefølge bestemt af deres effektive mobilitet. Meget fortyndede ioner stadig kan fokusere på peak-tilstand mellem plateau zoner. I ITP, kan prøveioner indføres i en begrænset injektion mellem TE og LE (se figur 3) eller alternativt blandes sammen med TE og / eller LE (se figur 2). Vi henviser til blanding i TE zone som "semi-uendelige" injektion, som kan anvendes til at akkumulere analyt-ioner kontinuerligt. Kontinuerlig sampleakkumuleringsbufferen forøger følsomheden i både top-og plateau mode assays. Men endelige injektioner er mere almindelige i plateau-tilstand. Dette er sandsynligvis, fordi høje indledende analytkoncentrationer i semi-uendelig injektion væsentligt kan øge TE ledningsevne og lavere med fokus satser. Også fuldstændig oprensning er ikke muligt i semi-uendelig injektion (idet der Remains en endelig koncentration i TE).

2. Device rengøring og forberedelse

For de analyser, der præsenteres i denne protokol vi bruger isotropisk våd-ætset (groft D-formet tværsnit) glas mikrofluid chips med en tværgående kanal design (se figur 1). Følgende rensning og fremstilling protokol er optimeret til borsilicat og smeltet silica kanaler, men kan også anvendes med glas / PDMS chips. Udfør denne rensning procedure forud for eksperimenter for at sikre, at køre-to-run repeterbarhed og succesfuld anvendelse af dynamiske belægninger er nødvendige for at undertrykke elektroosmotisk flow (EOF). Udeladelse af denne protokol kan resultere i kraftig spredning af ITP interface. 14

  1. At rense kanalen, fylde Nord, Øst og Syd reservoirer med 10-20 pi 10% blegemiddel og anvende vakuum ved den vestlige reservoir for 2 min. Hvis du bruger en standard Caliper chip caddie, kan vakuum anvendes effektivt ved simpelthen attaching den brede ende af en 200 ul (ufiltreret) pipettespidsen chippen reservoiret og forbinder vakuumledningen til en 2 mm indvendig rørdiameter.
  2. Tømme reservoirer og skylles kanalen (som i trin 1) med 1 M natriumhydroxid i 2 min. Dette forsigtigt ætser kanalvæggene, hvilket giver en ren borsilikat overflade medvirke til at skabe ensartede overfladeegenskaber.
  3. Tomme reservoirerne og rene med afioniseret vand (DI), skylles kanalen med LE til ~ 2 min. I denne periode overfladeegenskaber og dynamiske belægninger ækvilibrere i kanalen.

3. Fluoroforen fokus i peak-tilstand ITP

  1. Fremstille 1 ml LE bestående af 100 mM HCI, 200 mM tris og 1% PVP.
  2. Fremstille 1 ml TE bestående af 100 mM HEPES og 200 mM tris. Kombiner 90 ul TE med 10 ul 1 uM Alexa Fluor 488 (AF488).
  3. Efter skylning med LE som beskrevet i del 2, tomme Vesten reservoiret og rengør et par gange med DI i ellerder til at fortynde en LE tilbage i reservoiret. Fyld dette reservoir med 20 pi TE indeholdende AF488.
  4. Placer den positive elektrode i øst reservoiret og jorden (negative) elektrode i Vesten reservoiret og anvende 2 uA (konstant strøm). Prøven top vil migrere ved en konstant hastighed fra vesten reservoiret mod øst reservoiret (se figur 1) og spændingen mellem disse reservoirer, vil stige i takt med lavere ledningsevne TE fylder kanalen.

4. Ekstraktion og oprensning af nukleinsyrer fra dyrkede E. coli

Evnen til selektivt at koncentrere iontyper gør ITP en ideel metode til biologisk prøveforberedelse. Vi oprense nukleinsyrer fra ubehandlet cellelysat ved at vælge en efterfølgende anion med en effektiv mobilitet størrelsesorden lavere end den eftersøgte nukleinsyre, men højere end co-ioniske PCR-inhibitorer (f.eks anioniske detergenter, proteiner og organiske opløsningsmidler, selv hvis de forekommer i high koncentration). Kationisk PCR-hæmmere (f.eks alkalimetaller og kationiske proteiner og vaskemidler) vandrer i den modsatte retning og er derfor også efterladt. ITP ekstrakter og fokuserer målnukleinsyrer fra prøvereservoiret, mens langsommere PCR-inhiberende arter bag (se figur 4).

  1. Få en prøve af eller kultur E. coli-celler til en densitet større end 10 8 CFU / mL.
  2. Overfør 1 ml cellekultur i en sikker lås mikrocentrifugerør og pellet ved centrifugering ved 4000 g i 6 min.
  3. Genopslæmmes pelleten i 80 uL RNase-frit vand, og der tilsættes 10 pi lyserende middel bestående af 10 mM tricin, 10 mM bis-tris, 2 mM EDTA, 0,1% Triton-X, og 5 mg / ml lysozym. Bland forsigtigt og inkuber i 5 minutter. ved stuetemperatur (lysering protokol tilpasset fra Bercovici et al. 11).
  4. Tilsættes 10 pi 1 M natriumhydroxid til at hæve lysatet pH til ~ 12,5. Forsigtigt aktivere pipetten op og ned, indtilopløsningen bliver klar, hvorefter lyserende er fuldstændig.
  5. Kombiner 10 pi lysat med 90 ul 50 mM tricin og 100 mM Bis-Tris. Denne løsning kan nu anvendes som TE.
  6. Fremstille 1 ml LE bestående af 500 mM bis-tris, 250 mM HCl, 1% PVP og 1X SYBR Green II. Fyld mikrofluid chip med LE som beskrevet i del 3.
  7. For at ekstrahere det oprensede nukleinsyre til off-chip-analyse efter ITP erstatte indholdet i øst reservoiret med en PCR-kompatibel LE indeholdende 50 mM bis-tris, 25 mM HCl og 0,1% PVP. Anvend 1000 V mellem øst og vest brønde for at påbegynde eksperimentet. Strømmen mellem disse reservoirer vil falde.
  8. Ved slutningen af ​​eksperimentet prøven eluerer i LE reservoiret. Sammenfaldende med denne eluering det aktuelle versus tid for dette system typisk et plateau-værdi (idet modstanden nu er domineret af TE-ioner ensartet fordelt i kanalen). Ryst forsigtigt reservoiretIndholdet af gentagen pipettering og udtrække en 5 ul volumen til analyse ved kvantitativ RT-PCR.

5. Adskillelse af aminosyrer med kationisk plateau tilstand ITP og ikke-fokusering sporstof (NFT) til visualisering

ITP kan anvendes til at adskille og koncentreres små ioner i tilstødende og detekterbar plateauer mellem TE og LE. Dette tillader påvisning og identifikation baseret på fysisk-kemiske egenskaber, såsom lokal ledningsevne, UV absorbans, temperaturføling eller brydningsindeks. Her viser en ikke-fokusering sporstof (NFT) assay, hvor en fluorescerende, co-ionisk art sættes til LE. Dette fluorescerende arter fokuserer ikke, men koncentrationen tilpasses til en lokal elektrisk felt og derved muliggør visualisering af oprensede plateau zoner (se figur 5).

  1. Fremstille 1 ml LE bestående af 100 mM ethanolamin, 200 mM tricin, og 1% PVP og 100 uM af den kationiske fluoroforen Rhodamin 6G.
  2. <li> fremstilling af 1 ml TE bestående af 20 mM tris, 40 mM tricin. Forberede prøven ved at blande 90 pl TE med 10 ul hver af 50 mM arginin og 50 mM lysin.
  3. Dispensér 20 uL LE i vest og nord reservoirer og prøve i Østen reservoiret. Påfør vakuum ved Syd reservoir for 1 min.
  4. Skyl øst godt med DI og erstat med TE (TE uden prøve).
  5. Anvend 500 V mellem Øst og Vest reservoirer.

6. Repræsentative resultater

Vi viser isotachopherograms af peak tilstand eksperimenter i figur 2b og ekstraktion af nukleinsyrer eksperimenter i figur 4. I peak tilstand eksperimenter med en fluorescerende reporter (fx AF488, SYBR Green II), kan den samlede fluorescensintensitet integreres og sammenlignes med en kalibreringskurve for at opnå kvantitative koncentration information. 12 Derudover, i ekstraktion af nukleinsyrer forsøg er prøven lov til at eluere i tHan LE reservoir og ekstraheret med en pipette til analyse ved kvantitativ RT-PCR. 10,12 Vi viser plateau tilstand isotachopherograms for aminosyre separation i figur 5. Fluorescensintensitet (i forhold til LE eller TE zone intensitet) kan anvendes til zone identifikation, mens zone bredder muliggøre kvantificering.

Figur 1.
Figur 1. Isotachophoresis (ITP) er en elektrokinetisk teknik, der anvendes i mikrofluide ansøgninger om følsom påvisning og adskillelse af ioner. ITP tilbyder separation, selektive fokusering, og preconcentration kapaciteter. Desuden er det meget robust og ufølsom overfor fysiske forstyrrelser på grund af sin selvskærpende natur. Prøveioner selektivt koncentreret mellem en forreste (LE) og bageste elektrolyt (TE) og bevæger sig gennem mikrokanalen med en konstant hastighed bestemt af hastigheden af ​​de ledende ioner i LE zone. Prøveionerfokus, hvis deres effektive elektroforetiske mobilitet er omsluttet af effektiv mobilitet i LE og TE ioner. Den skematiske viser en model ITP eksperiment, hvor prøven fokuserer kontinuerligt mellem LE og TE zoner.

Figur 2.
Figur 2. Fortynd prøve ioner fokus i "peak mode" ITP. a) to forskellige fortyndet (c prøve << c LE) arter fokus i peak-tilstand på grænsefladen dannet mellem LE og TE zoner. Udelukkende LE og TE bestemme det elektriske felt, som prøve arter ikke i væsentlig grad bidrager til strøm. Prøveioner blandes med TE (i en semi-uendelig injektion) og koncentreres sammen i en stort set gaussisk top ved ITP grænsefladen. Fokus kriterium (vist som uligheder) gælder for stærkt ioniserede arter. b) Eksperimenter viser Alexa Fluor 488 (AF488) fokuserede i peak-tilstand for en række anvendte strømme (se også VIDEO 1). Prøven topbredde er omvendt proportional med strøm (for ubetydelig advective dispersion grund elektroosmotisk strømning). 14. selvskærpende grænseflade er modstandsdygtig over for dispersionen som følge af tryk-styret strømning (se Video 2).

Figur 3.
Figur 3. Prøveioner ved en tilstrækkelig høj koncentration fokus på "plateau mode" og styrer den lokale ledningsevne. Vi typisk introducere prøveioner i en begrænset injektion mellem TE og LE. I denne modalitet. Prøveioner separat og orden i overensstemmelse med deres effektive elektroforetiske mobilitet (se video 3) For stærkt ioniserede arter er TE og plateau zone koncentrationer bestemmes ved Kohlrausch regulerende funktion (KRF, en invariant sæt først ved LE zone). Fortynd ioner fortsætte med at fokusere på peak-tilstand mellem plateau zoner bracketing effektiv mobilitet. Fokusering criterion (vist som uligheder) gælder for stærkt ioniserede arter.

Figur 4.
Figur 4. Lysat præparatet og nucleinsyre ekstraktion med peak-mode ITP. Nukleinsyre ekstraheres fra E. coli cellekultur under anvendelse af lysozym-assisteret alkalisk lysering og oprenset ved selektiv elektroforetisk fokusere via ITP. TE blandet med lysat (brun) indeholder målnukleinsyre (grøn), proteiner, og potentielle PCR-inhiberende kemier. Passende udvælgelse af slør og fører ioner muliggør selektiv målretning af målnukleinsyre mens PCR-inhibitorer bagefter. Totale nukleinsyre ITP top ofte tager på en ikke-ideel form, som vist her i indsættelsen billedet. Som en demonstration af dette assay, ekstraheret vi totale nukleinsyre fra gram-negative bakterier, Escherichia coli (lyseret med natriumhydroxidopløsning alene), renset NA fra lysatet med ITP, opsamlesDen ekstraherede genetiske materiale, og udføres QRT-PCR-analyser for at kontrollere vellykket oprensning af 16S rRNA (rød) og 16S rDNA (grøn) fra bakteriekultur. Negativ kontrol tærskel cyklusser for 16S rRNA (blå) og 16S rDNA (gul) blev hver over 30 cykler. Vi har udført QRT-PCR ved hjælp af Power SYBR Green RNA-to-C T 1-Step Kit fra Applied Biosystems med 150 nM fremad (5'-CGGATTGGAGTCTGCAACTCG) og omvendt (5'-CACAAAGTGGTAAG CGCCCTC) grundere, ved de anbefalede termiske cyklisternes forhold.

Figur 5.
Figur 5. Ikke-fokusering sporstof (NFT) assay for separation og påvisning af umærkede aminosyrer. a) Skematisk af NFT assayet. En endelig injektion af prøveioner indføres i øst kanalen. Vi blande LE med en tracer kationisk fluorofor med effektiv mobilitet lavere end TE ioner (μ sporstofTE). Fluoroforensiges at virke som en "underspeeding tracer". Da fluoroforen electromigrates fra LE i zoner nu besat af prøve plateauer og TE, det oplever en højere elektrisk felt og dermed dets koncentration stiger. Denne ændring i koncentration skaber trin i isotachopherogram. b) Adskillelse af to aminosyrer, arginin og lysin, under anvendelse af NFT assay med rhodamin 6G som underspeeding fluorescerende sporstof. Den lille top mellem TE og arginin er almindelig i ITP, er ikke godt forstået, og her ikke interfererer med detektion eller kvantificering af plateauer.

Supplerende Movie 1. Klik her for at se supplerende filmen .

Supplerende Movie 2. Klik her for at se supplerende filmen .

Supplerende Movie 3. Klik her for at se supplerende filmen .

Discussion

ITP metoder, der præsenteres her sikre en hurtig, følsom, og robust detektion og håndtering af ioniske molekyler. Den største udfordring i at bruge ITP er korrekt valg af LE og TE buffere. I anioniske ITP, typisk vælger vi chlorid som den ledende anionen, fordi det er en stærk syre med meget høj absolut mobilitet og således har meget forudsigelige egenskaber. Derfor er buffer valg i anioniske ITP typisk reduceret til at vælge en ordentlig TE og modionen. For selektive fokus eksperimenter, er TE valg afgørende for udelukkelse af forurenende ioner. I applikationer, hvor forurenende stoffer ikke er til stede, medfører lavere TE effektiv mobilitet til hurtigere at fokusere. Vi anbefaler at bruge følgende, relativt velopdragne anioniske TE ioner: MES, MOPS, HEPES, tricin. Valg af modionen påvirker både system pH og TE effektiv mobilitet. Almindelige modioner er tris (pKa 8,1) og bis-tris (pKa 6,4). For analyser, der kræver lavere eller højere pH, anbefaler vi pyridin (pKa 5,25) ogethanolamin (pKa 9,5), hhv. I tabel 1 og 2, for anioniske og kationiske ITP henholdsvis opsumme adskillige nyttige buffer eksempler. Vi tager HCI som den anioniske LE ion og natrium som den kationiske LE ion, og vi antager 100 mM ionstyrke LE buffer.

Læseren vil bemærke, at bufferen ionstyrke i vore protokoller (og i tabel 1-2) altid er større end eller lig med 10 mM. Mens der i teorien fysik ITP anvendelse ved ionisk styrke lavere end 10 mM, naturlige kontaminanter (f.eks carbonsyre fra reaktion mellem vand og atmosfærisk carbondioxid) nær 1 mM plan ofte begrænse den praktiske anvendelse af lav ionstyrke buffere.

Vi bemærker, at signaltransduktion mekanisme ikke er begrænset til de assays, der præsenteres i denne protokol. Som kort beskrevet i del 5, i plateau-tilstand renset zoner kan påvises via ændringer i den lokale ledningsevne, UV-absorbance, temperatur eller brydningsindeks. I vores egen gruppe, har vi udviklet en metode, der benytter fluorescerende carrier ampholytter til følsom påvisning og identifikation af ukendte analytter. 5 i top mode eksperimenter, kan specifikke prober bruges til at mærke fokuserede analytter. I et eksempel, anvender vi Molecular Beacons - oligonukleotidprober, som fluorescerer ved hybridisering til deres målsekvens - til påvisning af mål-DNA-eller RNA-molekyler med høj specificitet 11,18.

Mens ITP er relativt robust til dispersionen som følge af tryk-drevet flow og EOF, kan overdreven EOF føre til stagnation af ITP grænsefladen, hvor den gennemsnitlige EOF hastighed bliver lig med ITP hastighed. 14. Disse stærke EOF forekommer især under forhold med høj pH-værdi og lav ionstyrke. Af denne grund anbefaler vi anvendelse af puffere med pH 8 eller derunder og med ionstyrke af størrelsesordenen 100 mm, hvis passende. Det er vores erfaring, er PVP denmest effektive belægning EOF suppression i borsilicat chips. Men på grund af dets passage gennem en sigte egenskaber kan PVP ikke være egnet til visse anvendelser, såsom fokusering genomisk DNA. I forsøg, observere vi, at tilsætning af PVP kan reducere genomisk DNA absolut mobilitet (til det punkt, hvor det ikke fokusere). I disse tilfælde en silanol belægning, såsom Sigmacote, sammenholdt med et overfladeaktivt middel (fx Triton-X 100) kan også være effektive til at reducere EOF. 10

TE anion (pKa -1)
Pufrende modion (pKa +1) MES (6.10) MOPS (7,20) HEPES (7,50) tricin (8,15)
ethanolamin (9,50) 21,41 20,40 17,38 22,85
tris (8,08) 21,00 19,23 </ Td> 15,84 17,56
bis-tris (6,40) 18,22 10,41 7,30 5,23
pyridin (5,18) 1,01 3,72 2,42 1,48

Tabel 1. Effektiv mobilitet størrelsesorden (x 10 -9 m2 / V / s) af justerede ren analyt zone anioniske ITP hvor LE er 100 mM HCl og 200 mM buffering modion.

TE kation (pKa +1)
Pufrende modion (pKa -1) ethanolamin (9,50) tris (8,08) bis-tris (6,40) pyridin (5,18)
MES (6.10) 35,57 21,96 16,39 10,45
MOPS (7.20) 35,47 20,92 9,76 3,93
HEPES (7,50) 35,35 19,97 7,77 2,88
Tricin (8,15) 34,77 16,72 4,50 1,44

Tabel 2 nedenfor. Effektiv mobilitet størrelsen (x 10 -9 m2 / V / s) af justerede ren analyt zone kationisk ITP hvor LE er 100 mM natrium og 200 mM buffering modion.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker for støtte fra DARPA sponsoreret Micro / Nano Fluidik Fundamentals Focus (MF3) Center under kontrakt nummer N66001-10-1-4003 og fra DARPA tilskud N660001-09-C-2082.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Distilled water GIBCO, by Life Technologies 10977 RNase/DNase free
Clorox Ultra Clorox 02489CT
sodium hydroxide (NaOH) Mallinckrodt Baker Inc. 7708
hydrochloric acid (HCl) EMD Millipore HX0603-4
Trizma base (tris) Sigma-Aldrich T6066
polyvinylpyrrolidone (PVP) Polysciences, Inc. 06067 MW 1,000,000
HEPES Sigma-Aldrich H-4034
Alexa Fluor 488 carboxylic acid Invitrogen A20000
tricine Sigma-Aldrich T-9784
bis-tris Sigma-Aldrich B4429
EDTA GIBCO, by Life Technologies AM9260G
Triton-X 100 Sigma-Aldrich X100
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
SYBR Green II Invitrogen S7564
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000
Rhodamine 6G Acros Organics CAS 989-38-8
L-Amino Acids Sigma-Aldrich LAA21
Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step Kit Applied Biosystems 4389986
PCR primers Integrated DNA Technologies
Borosilicate microfluidic chip Caliper Life Sciences NS12A Supplied with or without plastic caddy
Vacuum pump Gast Manufacturing, Inc. DOA-P104-AA
Sourcemeter Keithley 2410 Constant current and constant voltage operation modes
Inverted epifluorescent microscope Olympus Corporation IX70 Use mercury lamp (Olympus) or LED (Thorlabs) for illumination
Filter cube Omega Engineering, Inc. XF115-2 Excitation/emission: blue/green
Safe-lock microcentrifuge tubes Eppendorf 022363204 1.5mL capacity
Centrifuge Eppendorf 5417C
Table 3. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis. Anal. Chem. 78, (7), 2319-2319 (2006).
  2. Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis. Anal. Chem. 79, (1), 345-345 (2007).
  3. Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications. Elsevier Science & Technology. (1976).
  4. Khurana, T. K., Santiago, J. G. Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers. Anal. Chem. 80, (1), 279-279 (2008).
  5. Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water. Anal. Chem. 82, (5), 1858-1858 (2010).
  6. Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay. Anal. Chem. 82, (5), 2134-2134 (2010).
  7. Kaigala, G. V. Miniaturized system for isotachophoresis assays. Lab Chip. 10, (17), 2242-2242 (2010).
  8. Chambers, R. D., Santiago, J. G. Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers. Anal. Chem. 81, (8), 3022-3022 (2009).
  9. Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis. Lab Chip. 9, (15), 2145-2145 (2009).
  10. Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis. Anal. Chem. 81, (22), 9507-9507 (2009).
  11. Bercovici, M. Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons. Anal. Chem. 83, (11), 4110-4110 (2011).
  12. Marshall, L. A., Santiago, J. G. Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis. Anal. Chem. 83, (24), 9715-9715 (2011).
  13. Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers. Lab Chip. 9, (17), 2437-2437 (2009).
  14. Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. Sample dispersion in isotachophoresis. J. Fluid Mech. 1, (1), 1-1 (2011).
  15. Kohlrausch, F. Über concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von lÖsungen und lÖsungsgemischen. Ann. Phys. 298, (10), 209-209 (1897).
  16. Alberty, R. A. Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases. J. Am. Chem. Soc. 72, (6), 2361-2361 (1950).
  17. Jovin, T. M. Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations. Biochem. 12, (5), 871-871 (1973).
  18. Persat, A., Santiago, J. G. MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons. Anal. Chem. (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics