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연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경

Neuroscience

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Summary

우리는 세포 내 무료 칼슘 농도와 신경 효능의 변화가 동시에의 신경절 준비에 모니터링 할 수있는 방법을 보여줍니다

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Ludwar, B. C., Evans, C. G., Cropper, E. C. Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia. J. Vis. Exp. (65), e3907, doi:10.3791/3907 (2012).

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Abstract

그것은 세포 내 칼슘의 변화는 시냅스 소성 (예를 들어, homosynaptic 촉진) 1의 중요한 형태의 수의 유도를 중재하는 것이 좋습니다되었습니다. 이 가설이 동시에 세포 내 칼슘의 변화와 신경 효능에 변경을 모니터링하여 테스트 할 수 있습니다. 우리가이 세포 내 기록 기술을 칼슘 이미징를 조합하여 수행 할 수있는 방법을 보여줍니다. 우리 실험은 연체 동물 Aplysia californica의 구강 신경절로 진행됩니다. 이 준비가 실험적으로 유리한 특징을 가지고 : 신경절 쉽게 Aplysia에서 제거 실험 일반 시냅스 연결을 확인하고 정상 이온 채널 유통이 성인 뉴런을 사용 할 수 있습니다. Aplysia에 대한 자연 동물의 낮은 신진 대사 속도와 상대적으로 낮은 온도 (14-16 ° C)로 인해 준비는 오랜 기간 동안 안정적입니다.

이 긴 파장 형광 염료는 칼슘에 바인딩 할 때 우리가 쉽게 iontophoresis를 통해 신경 세포로 '로드'이다 칼슘 오렌지 2의 셀 impermeant 버전을 사용합니다 세포 무료로 칼슘의 변화를. 감지 할 다닐 ">, 형광 강도가 증가. 칼슘 오렌지가 빠른 운동 특성 3는 ratiometric 염료와는 달리 (예를 들어, Fura 2), 영상에 대한 필터 휠을 필요하지 않습니다. 그것은 안정적이고 다른 염료 (예를 들어, fluo-3) 2,4 이하 phototoxic 상당히 사진입니다. 모든 비 ratiometric처럼 이 로딩 및 확산으로 인한 염료 농도의 변화에​​ 대한 계정 수 없기 때문에 염료는 칼슘 오렌지, 칼슘 농도의 상대적인 변화를 나타냅니다. 그러나, 그것은 절대 칼슘 농도를 제공하기 위해 보정 할 수 없습니다.

수직, 고정 무대, 복합 현미경은 초당 30 프레임 주위에 녹화 할 수있는 CCD 카메라로 이미지 뉴런에 사용되었습니다. Aplysia이 시간적 해상도에서세포 내 칼슘 농도에서도 하나의 스파이크 유도 변경을 감지하기에 충분한 이상이다. 샤프 전극을 동시에 식별 사전 및 postsynaptic 뉴런에서 신경 전달을 유도하고 기록하는 데 사용됩니다. 각 시험의 결론에서, 사용자 정의 스크립트가 전기 생리학 및 이미징 데이터를 결합합니다. 적절한 동기화를 보장하기 위해 우리는 현미경의 카메라 포트에 장착 LED에서 빛 펄스를 사용합니다. presynaptic 칼슘 레벨 (세포 EGTA 주입을 통해 예를 들어)의 조작은 우리가 소성의 다양한 형태의 중재에 세포 내 칼슘의 역할에 관한 구체적인 가설을 테스트 할 수 있습니다.

Protocol

1. 준비하기

  1. 75-100 ML 등장 염화 마그네슘 용액을 주입하여 동물을 마취. 우리는 이미지에 사용 Aplysia은 일반적으로 150-200그램하고 Marinus 과학에서 얻을 수 있습니다.
  2. 왁스 대상 접시에 anesthetized 동물을 핀. 주사기 바늘은이 목적을 위해 잘 작동, 멸균 기술은 필요하지 않습니다. 총 포셉 및 표준 가위를 사용하면 동물의 발에 절개를하고 구강 질량을 쉽게받을 수 있습니다. 구강 신경을 찾습니다. 모든 구강 신경을 절단하여 신경을주의 깊게 무료, 스프링 가위와 고급 포셉을 사용합니다.
  3. 신경을 제거하고 인공 해수를 포함하는 Sylgard 코팅 접시에 배치합니다. 신경을 안정 구강 신경을 통해 몇 곤충 핀을 배치합니다. Desheath 세포 녹화 뉴런을 노출 초 미립 포셉, 봄의 가위, 수 있도록 사용하여 구강 신경절. 그런 다음 15 고급 벌레를 (사용하여 신경을 다시 핀 분utien) 핀. 모든 운동은 영상 중에 문제가 될 것 같은 신경이 곳에서 단단히 개최해야합니다.

2. 전극을 준비

  1. 필라멘트와 유리 모세관 튜브를 사용하여 전극 (예 : WPI TW100F-4)와 풀러를 당겨. 설정은 개별적으로 필요한 저항의 전극을 만드는 데 결정해야합니다. 전극 beveled 할, 또는 5 MOhms에 대해 beveling 단계가 생략 된 경우 경우 3 M KAC로 가득 할 때 (칼륨 아세테이트)의 전극 저항은 10 MOhms에 대한 일반적입니다.
  2. 주사기와 바늘 microfil를 사용하여 3 M KAc/30 밀리미터 KCl을 포함하는 솔루션 전극의 한 세트를 입력합니다. 이 전극은 전기 생리학을 위해 사용됩니다.
  3. , 염색의 전극의 뒷면 끝을 찍어하여 칼슘 표시기 염료와 전극의 두 번째 세트를 작성 이전에 약으로 재구성. 500μg 염료 40 μl 증류수. 전극의 끝이 가득했을 때, 다시 4분의 1에 대한 인치 작성좋은 전기적 접촉을 위해 KCl 200 MM와 전극의 끝.
  4. 이 염료 주입을 용이하게하고 여러 막 침투 의해 수행 피해를 줄여으로는, 베벨 전극을에 유용합니다. 우리는 소금 물 / 알루미나 분말 정지의 스트림을 생성하는 사용자 정의 beveler을 사용합니다. 전극은 홀더에 장착하고 팁은 45 ° 각도에서 스트림을 입력합니다. 저항이 KAC 가득 전극 약 5 MOhm에 도달하면 전극 저항은 지속적으로 모니터링하고 beveling가 종료됩니다. 염료 가득 전극은 시간의 동일한 금액을 beveled 일반적으로 15-20 MOhm의 저항이 있습니다.

3. 칼슘 표시기 염료로드

  1. 전기 생리학의 장비에 대한 준비를 놓고 시각적으로 관심 presynaptic 신경 세포를 찾습니다. 우리 실험의 대부분은 먹이, B21 5, 6시 활용 식별 감각 뉴런으로 이루어집니다. 상대적으로 고정 positioN, 크기 (~ 100 μm)와 B21의 소마의 길쭉한 모양을 찾아 쉽게합니다.
  2. 칼슘 표시기 염료를 포함하는 전극과 관심의 신경을 찌르. B21의 신원은 이후 시냅스 뉴런 B8를 impaling에 의해 확인 할 수 있습니다. ~ 8 NA 전류와 B21의 탈분극은 스파이크와 B8 7 PSP와을 촉진하는 결과가 게재됩니다.
  3. 약 30 분 hyperpolarizing 펄스 (일반적으로 -15 없음, 1 Hz에서, 75 % 듀티 사이클)를 전달하여 관심 presynaptic 뉴런에 염료를 주입. 염료 로딩이 성공하면, 신경 세포의 소마는 희미한 핑크 색을 취득합니다. 천천히 뉴런에서 철수하여 염료 함유 전극을 제거합니다.
  4. 염료가 관심의 뉴런과 시냅스 접촉을 미세 프로세스에 확산 할 수 있도록 약 30 분 동안 준비를 둡니다.

4. 칼슘 이미징 및 Electrophysiological 기록

  1. 이미지 microsc에 준비를 배치ope. 준비 요리는 점토와는 달리, 때 서부 유럽 표준시 끈적 남아 Permagum 씰링 코드 조각과 냉각 플랫폼에 개최됩니다. 고정 무대 현미경은 목표를 이동하여 초점을 맞추고 있습니다. 단계는 자석 마운트 manipulators을 장착 할 수있는 고정 남아 있습니다. 높은 배율이 진동 (특히 측면 운동) 문제를 만들면서, 전체 이미지 설정은 진동 절연 플랫폼에 배치해야합니다.
  2. 일반 전해질 솔루션을 포함하는 전극과 presynaptic과 postsynaptic 뉴런을 찌르.
  3. 이미지 칼슘 오렌지에 적합한 필터 블록 (여기 549 나노 미터, 방사 576 nm의) 8을 선택하고 카메라를 조정합니다. 대부분의 과학 CCD 카메라 탐정 아웃 읽는 CCD 셀의 하위 집합을 선택 할 수 있습니다. 또한, 전지 (binned) 결합 될 수있다. 동안 binning 증가 감도, 작은 하위 집합 증가 속도를 선택합니다. 이 두 설정은 함께 노출 시간 결정프레임 속도는 초당 취득 할 수있는 방법을 많은 이미지 즉. 적합 설정됩니다 이미지를 500 X 300 픽셀 (10 배 렌즈와 0.5x 카메라 어댑터를 사용)를 580 X 350 μm 2 영역입니다. 노출 시간 <25 밀리와 올바른 노출을 제공하는 최소한의 금액 조명 강도를 조정 빛 경로에 중립적 인 밀도 필터를 추가합니다. 이러한 설정은 30 Hz의 프레임 속도가 될 - Aplysia에 칼슘 변경을 evoked 이미지 하나의 스파이크에 충분히 빨리이다. 마지막으로, 만 이미징 영역이 밝아 있도록 필드 조리개를 닫습니다.
  4. 이미징 소프트웨어에서 측정하고자하는 신경 세포의 영역을 표시합니다. 요소 AR 소프트웨어는 이것이 관심 영역 (ROIs)를 배치하여 "시간 측정"절에서 수행됩니다. B21는 양극성 뉴런이며, 이전의 작품은 관심 아홉의의 측면 프로세스 연락처 postsynaptic 신경 증명했다. 우리 일반적으로 이미지 초등, 중등 및 고등 브라뉴런의 각 부분을 통해 투자 수익 (ROI)을 배치하여 측면 과정 nches. 염료 가득 뉴런 옆에 추가 투자 수익 (ROI)은 나중에 다른 모든 데이터 포인트에서 차감되는 배경 값을 제공하는 측정됩니다.
  5. 카메라의 "프레임 표시 장치"신호가 제공하는 트리거 신호를 기다리 전기 생리학 획득을 (이 실험 스파이크 II)를 지시합니다. 이미지 수집 (요소 AR)을 시작하고, 카메라가 첫 번째 프레임을 데리고 스파이크 II가 자동으로 녹음을 시작합니다. 당신은 또한 간단히 현미경의 카메라 포트에 장착 LED를 켜 1401 전원의 TTL 출력을 사용할 수 있습니다. 이 이후 이미징 및 electrophysiological 데이터를 동기화 할 수있는 신호를 제공합니다.
  6. 원하는 주파수에서 짧은 depolarizing 현재 펄스의 일련의 주입하여 presynaptic 뉴런을 자극한다. 이 작업 가능성이 successf 여부를 결정하기 위해 (자극 실행 오실로스코프와 함께 예) 각 펄스를 모니터하는 것이 중요합니다ully 생성됩니다. 칼슘 오렌지가 다른 염료에 비해 매우 사진 안정적이지만 발생을 표백 염색 얼마나 확인하는 자극없이 제어 재판을 기록하는 것이 좋습니다.
  7. 세포 내 칼슘 농도가 조작되는 실험에서, EGTA와 같은 약물은 presynaptic 신경 세포에 도입하고 위에서 설명한 자극 및 데이터 수집 단계는 반복된다.

5. 대표 데이터 분석

  1. 텍스트 파일로 작성하여 이미지 데이터를 (각 투자 수익 (ROI)에 대한 측정 농도 값의 목록) 보냅니다. 스파이크 II의 사용자 정의 스크립트는 텍스트 파일을 가져올 수 있습니다. 이 스크립트는 또한 개별 프로브의 공간이 값을 normalizes 및 배경 프로브의 가치를 차감됩니다. 데이터 포인트는 다음 "가상 RealWave"채널로 전기 생리학 데이터가 함께 꾸몄다 있습니다. 스파이크 II의 "채널 프로세스 / 시간 이동 기능은"정확하게 이미지 데이터 관심 장소를 정렬하는 데 사용됩니다참고로 LED 신호를 사용하여 국세청.
  2. 퍼센트 변경 등의 값을 구하려면 DF으로 형광의 상대적 변화를 계산하여 영상 데이터를 분석 / F O = (FF O) / F O. F O는 자극시 자극과 F 형광 전에 형광 수준을 나타냅니다.

6. 대표 결과

그림 1
그림 1. 실험의 전체 구조. 실험은 Aplysia의 신경절 준비로 진행됩니다. 세포 내 칼슘의 변화는 iontophoretically presynaptic 신경 세포에 도입되는 형광 염료와 이미징 있습니다. 그 시냅스 전송을 유도하고 모니터링 할 수 있도록 사전 및 postsynaptic 뉴런 그런 다음 날카로운 전극으로 찔려 죽은 수 있습니다.

그림 2
Aplysia의 구강 신경절에서 확인 뉴런의 세포 내 기록. 신경 B21의 이미징 측면 지점의 (A) 사진입니다. 상자가 관심의 측정 영역을 나타냅니다. B21의 (B1) 세포 자극은 또한 행동 잠재력을 해고 원인 postsynaptic 관심 뉴런 B8 (중간 추적)에서 활동 전위 (하단 추적)과 촉진 postsynaptic 잠재력 (PSP와)를 세상의 시작과 끝. presynaptic 칼슘 형광의 증가는 상단 추적에 표시됩니다. homosynaptic 촉진에 presynaptic EGTA의 (B2) 효과. EGTA는 intracellularly ~ 15분 세포 자극하기 전에 B21에 주입했다. 그것은 EGTA 낮은 농도에서 신경 전달을 억제 할 수있을만큼 빠른 게 느린 행동 칼슘 chelator,라고 생각됩니다. 널리 칼슘 신호와 PSP 진폭의 해당 감소의 감소를 확인합니다. (C) PSP 진폭은 presynaptic calciu 상관 관계m 신호. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

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Discussion

우리는 동시에 세포 내 칼슘 농도를 모니터링하고 신경 전달의 효능을 평가하는 데 사용할 수있는 기술을 보여줍니다. 이 기술은 단기 소성의 다양한 형태가 중재하는 방법을 결정하는 데 유용합니다.

영상은 형광 현미경과 CCD 카메라로 수행됩니다. 대부분의 기능 이미징 세트 업에 비해이 장비 요구 사항은 상대적으로 겸손입니다. 기술은 간단하고 배우기 쉽다. CCD 카메라와 영상 좋은 시간적 해상도를 가진 넓은 지역의 시각화를 허용하지만, 공간 해상도가 제한됩니다. 따라서 세포 내 칼슘의 상대적으로 광범위한 또는 '배경'증가의 역할에 관한 테스트 가설에 유용한 기술입니다. 쪽의 공간 해상도와 학습 칼슘 역학을 개선하기 위해, 레이저 스캐닝 공 촛점 현미경, 또는 두 광자 현미경과 칼슘 표시기 칼슘 그린을 그냥 할 수프로토콜 10 만 약간의 수정과 함께 사용할 수.

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Disclosures

우리는 공개 할 아무 것도 없습니다.

Acknowledgements

PHS 기금 (MH51393)는이 일을 지원합니다. 우리가 사용하는 Aplysia의 일부는 연구 자료, NIH의 국립 센터에서 부여 RR10294 아래의 마이애미 대학의 Aplysia을위한 국가 자원에 의해 제공됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium Orange Invitrogen C-3013
EGTA Sigma E-4378
Calcium calibration buffer kit Invitrogen C-3008MP Useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal

Table 1. Reagents used.

FN-1 upright fluorescence microscope Nikon Instruments with Narishige ITS-FN1 stage
NMN-21 manipulators Narishige mounted on stage with magnets
CoolSNAP HQ2 CCD camera Photometrics
NIS elements AR Nikon Instruments we used version 3.22
10X/0.3w Plan Fluor objective Nikon Instruments this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm
X-Cite 120 PC metal halide lamp EXFO used for fluorescence imaging
LS-DWL halogen lamp Sumica
ET-CY3 filter set Chroma Technology
Power 1401 A/D converter Cambridge Electronic Design sampling was done at 3 kHz
Spike II Software Cambridge Electronic Design we used version 7.07
SEC-10 LX amplifier NPI electronics used with a 10X headstage
Model 410 amplifier Brownlee precision used to amplify and filter the signal
WS-4 minus k Technology vibration isolation for imaging
cooling platform custom made brass plate through which ice water is pumped at a variable rate

Table 2. Equipment used.

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References

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