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 JoVE Biology

Unfixed, फ्रोजन ऊतकों का उपयोग करने के लिए प्राकृतिक mucin वितरण का अध्ययन

1, 1, 2, 1

1Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California, San Diego, 2Biosecurity and Public Health, Los Alamos National Laboratory

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    Summary

    Unfixed जमे हुए ऊतक इष्टतम काटना तापमान मध्यम (अक्टूबर) में एम्बेडेड नमूनों प्राकृतिक और secreted बलगम के वितरण ग्लाइकोसिलेशन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस दृष्टिकोण ऊतक प्रसंस्करण में कम है और प्राकृतिक प्रस्तुति glycolipids mucins, और glycan-epitopes संरक्षित है. ऊतक वर्गों प्रतिदीप्ति या वर्णजनीय पता लगाने का उपयोग immunohistochemistry द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है.

    Date Published: 9/21/2012, Issue 67; doi: 10.3791/3928

    Cite this Article

    Cohen, M., Varki, N. M., Jankowski, M. D., Gagneux, P. Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution. J. Vis. Exp. (67), e3928, doi:10.3791/3928 (2012).

    Protocol

    1. अक्टूबर में ऊतक एम्बेडिंग

    1. 2 मिथाइल ब्यूटेन एक उथले स्टायरोफोम बॉक्स में सूखी बर्फ जोड़कर एक ठंड स्नान तैयार.
    2. ऊतक फसल, और धीरे से एक टिशू पेपर पर नम अतिरिक्त तरल सूखी है. तस्वीर जमी ऊतक (ऊतक कि तरल नाइट्रोजन में जम गया था) का उपयोग अगर, ऊतक यह एक क्रायो सूक्ष्म चैम्बर में रखने से -20 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने की अनुमति.
    3. पील-A-Way ठंड मोल्ड करने के लिए अक्टूबर की एक छोटी राशि जोड़ें, बस आचारण के नीचे को कवर करने के लिए पर्याप्त है.
    4. मोल्ड में ऊतक प्लेस, यकीन है कि ऊतक मोल्ड के तल पर वांछित अभिविन्यास में विश्राम है. एक बार जम, ऊतक ब्लॉक या तो नीचे या पक्षों से sectioned हो जाएगा.
    5. अक्तूबर साथ कवर ऊतक, और ठंड स्नान में ढालना जगह. अक्टूबर यौगिक सफेद बारी के रूप में ऊतक freezes.
    6. एक बार एक उल्लेखनीय ठंड बैग में जमे हुए ब्लॉक और जगह बंद मोल्ड छील जमे हुए.
    7. जमे हुए ब्लॉकों रखा जा सकता है-80 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें जब तक.

    2. सेक्शनिंग ऊतक

    1. प्लेस क्रायो - सूक्ष्म चैम्बर में ऊतक ब्लॉक, और उन्हें -20 डिग्री सेल्सियस (30 मिनट) तक पहुँचने के लिए अनुमति देते हैं.
    2. एक 3-5 सुक्ष्ममापी मोटी खंड कट, और एक सकारात्मक आरोप लगाया अनुभाग के शीर्ष पर गिलास स्लाइड जगह. ऊतक स्लाइड का पालन करना होगा.
    3. 30-60 मिनट के लिए एयर ऊतकों सूखी.
    4. स्लाइड इस स्तर पर इस्तेमाल किया जा सकता है, या वे -80 ° भविष्य में उपयोग के लिए सी में रखा जा सकता है.

    3. ऊतक धुंधला

    1. स्लाइड्स है कि -80 पर संग्रहीत किया गया ° C: स्लाइड्स का पिघलना और हवा कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सूखी अनुमति देते हैं.
    2. स्लाइड्स फिक्स के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 10% formalin buffered.
    3. पीबीएस या TBST बफर में तीन बार प्रत्येक धोने के लिए स्लाइड 250 मिलीलीटर बफर में 10 बार डुबकी, धो लें. PBS बफर immunofluorescence धुंधला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन फॉस्फेट conjug Alkaline वर्णजनीय पता लगाने के लिए,एंटीबॉडी पैदा, TBST पीबीएस में फॉस्फेट के बाद से इस्तेमाल किया जाना चाहिए alkaline फॉस्फेट गतिविधि को रोकता है.
    4. ऊतक वर्गों स्लाइड्स अब कलंकित किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं.

    4. बलगम का पता लगाने के लिए Alcian ब्लू और आवधिक एसिड Schiff के रूप में Histochemical दाग का उपयोग करने के लिए

    1. दाग Alcian ब्लू:
      1. पानी में स्लाइड कुल्ला, कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 3% एसिटिक एसिड में सेते हैं.
      2. Alcian ब्लू पीएच 2.5 समाधान के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए दाग.
      3. 10 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में स्लाइड्स धो, डि पानी में कुल्ला.
      4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए परमाणु फास्ट लाल रंग में Counterstain.
      5. धो डि पानी में तीन बार स्लाइड.
    2. आवधिक एसिड Schiff दाग:
      1. पानी में स्लाइड कुल्ला, हौसले से तैयार 1% 5 मिनट के लिए आवधिक एसिड में सेते हैं.
      2. डि पानी में तीन बार धोएं, miliQ पानी में एक बार डुबकी.
      3. Schiff अभिकर्मक कमरे temperatur पर 15 मिनट के लिए के साथ दागई.
      4. 10 मिनट के लिए नल का पानी चलाने में स्लाइड्स धो, डि पानी में कुल्ला.
      5. कमरे के तापमान पर 30 सेकंड के लिए Surgipath Hematoxylin में Counterstain.
      6. धो डि पानी में तीन बार स्लाइड.
      7. सेते हैं स्कॉट नल का पानी में कमरे के तापमान पर 30 सेकंड स्लाइड.
      8. डि पानी में तीन बार धोएं.
    3. निर्जलीकरण और 95% इथेनॉल में 1 मिनट, तीन 100% इथेनॉल में त्वरित परिवर्तन, और में तीन परिवर्तन Citrisolv, 2 मिनट प्रत्येक द्वारा पीछा incubating द्वारा स्लाइड्स स्पष्ट. कमरे के तापमान पर सभी.
    4. Coverslips पर राल मध्यम (60 Cytoseal) के साथ स्लाइड माउंट.

    5. Glycan epitopes लिए Histochemical तरीके से पता लगाने के lectins और एंटीबॉडी (1 टेबल) का प्रयोग

    1. प्रतिदीप्ति पता लगाने के लिए तीन glycan lectins का उपयोग कर epitopes, पीबीएस में 1% BSA के साथ कमरे के तापमान पर 10-30 मिनट के लिए स्लाइड ब्लॉक.
    2. चूंकि एक biotinylated lectin प्रयोग किया जाता है, 0.1% के साथ 15 मिनट incubating अंतर्जात बायोटिन ब्लॉकAvidin, कमरे के तापमान पर 0.01% बायोटिन के साथ 15 मिनट ऊष्मायन द्वारा पीछा किया.
    3. पीबीएस में स्लाइड हर अवरुद्ध कदम के बाद धो लें.
    4. हौसले से 1 ग्राम / मिलीलीटर rhodamine संयुग्मित succinylated गेहूं रोगाणु (sWGA) agglutinin, 1.3 / छ एमएल biotinylated Sambucus nigra agglutinin (SNA) और 5 ग्राम / मिलीग्राम / HEPES NaCl बफर में Jacalin Fluorescein संयुग्मित (10 मिमी HEPES का एक मिश्रण तैयार करते हैं, 150 मिमी NaCl 7.5 पीएच).
    5. एक सपाट सतह पर या एक धुंधला बॉक्स, और परत शीर्ष पर लेक्टिन मिश्रण में प्लेस स्लाइड. मिश्रण की मात्रा धीरे तरल पर parafilm रखने के द्वारा कम किया जा सकता है, parafilm तरल दुबला बना देती है और वाष्पीकरण से बचाता है.
    6. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 घंटा सेते हैं.
    7. धो पीबीएस के साथ तीन बार स्लाइड.
    8. 0.7 ग्राम / streptavidin संयुग्मित मिलीलीटर Cy5 (करने के लिए biotinylated SNA का पता लगाने के लिए), और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते साथ परत स्लाइड.
    9. धो पीबीएस के साथ तीन बार स्लाइड.
    10. 0.1 और मीटर के साथ नाभिक Counterstainयू, छ / मिलीलीटर DAPI.
    11. जलीय VectaMount बढ़ते मीडिया (या किसी भी जलीय मीडिया) के रूप में इस तरह के माध्यम से coverslips पर स्लाइड माउंट.

    6. Lectin धुंधला विशिष्टता के लिए नियंत्रित

    1. Lectin धुंधला हो विशिष्टता या तो लक्ष्य glycan मिलान के विशिष्ट enzymatic धुंधला पहले दरार या छोटे अणुओं के साथ प्रतिस्पर्धा के द्वारा नियंत्रित किया जाता है.
    2. Sambucus nigra agglutinin (SNA) बाध्यकारी विशिष्टता के लिए Enzymatic दरार
      1. 250/50 मिमी सोडियम एसीटेट 5.5 पीएच में म्यू मिलीलीटर Arthrobacter ureafaciens sialidase (ऑस्ट्रेलिया) पतला.
      2. एक टिप खाली बॉक्स के नीचे करने के लिए पानी जोड़ें, इस ऊष्मायन के दौरान एक नम कक्ष बनेगी.
      3. प्लेस स्लाइड टिप बॉक्स, 150-200 परत और एक coverslip साथ स्लाइड कवर पर μl AUS समाधान के शीर्ष ट्रे पर का सामना करना पड़ता है. हवा बुलबुला गठन से बचें.
      4. 2.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बॉक्स ढक्कन और सेते.
      5. धो पीबीएस में कमरे के गुस्सा से कम तीन बार स्लाइडसभी मुक्त सियालिक एसिड को दूर करने के लिए ature. इन स्लाइड SNA धुंधला के लिए नकारात्मक होना चाहिए.
    3. Jacalin और succinylated गेहूं रोगाणु agglutinin विशिष्टता (sWGA) के लिए प्रतियोगी inhibitors
      1. अशेष भाजक लेक्टिन मिश्रण के 200 μl 5.4 दो शीशियों Eppendorf चरण में तैयार.
      2. एक शीशियों और काइटिन hydrolyzate 1:10 कमजोर पड़ने पर अन्य शीशी (sWGA अवरोध करनेवाला) के लिए 200 मिमी Melibiose (Jacalin अवरोध करनेवाला) जोड़ें.
      3. ओवरले के साथ नकारात्मक नियंत्रण स्लाइड्स inhibitors युक्त कमरे के तापमान में स्लाइड के बाकी के रूप में एक ही समय में मिश्रण और सेते 1 घंटा. इन स्लाइड Jacalin या sWGA धुंधला हो के लिए नकारात्मक हो सकता है, क्रमशः चाहिए.

    7. प्रतिनिधि परिणाम

    ऊतक जमे हुए क्रायो protectant मीडिया (अक्टूबर) में एम्बेडेड ऊतकों को पैराफिन में एम्बेडेड नमूनों के बीच तुलना के संरक्षण और muci के लिए धुंधला की गुणवत्ता में हड़ताली अंतर का पता चलाn glycoproteins. ऐसे Alcian ब्लू और आवधिक एसिड Schiff, Histochemical रंजक, साथ ऊतक धुंधला हो जाना जमे हुए या आयल एम्बेडेड नमूने (1 चित्रा) से तुलनीय ऊतक वर्गों में बहुत अलग परिणाम का उत्पादन. ऐसा लगता है कि कार्बनिक विलायक (xylene या Citrisolv) है कि आयल embedding प्रक्रिया के दौरान प्रयोग किया जाता है epithelia पर secreted mucins के वितरण के रूप में नमूने (2 चित्रा) से glycolipids ज्यादा हटाने के रूप में अच्छी तरह से प्रभावित करता है. नतीजतन, बलगम परत mucosa कोशिकाओं पर ढह गई और ज्यादातर जाम कोशिकाओं में पाया जाता दिखाई देता है. ऊतकों की क्रायो protectant मीडिया में फ्लैश ठंड (अक्टूबर) नमूना जलयोजन बनाए रखा और secreted mucins परत आयाम संरक्षित. आयल embedding प्रक्रिया एक समान तरीके में बलगम अन्य संबद्ध glycans और glycolipids प्रभावित. Glycan वितरण पर पाया epitopes के खिलाफ जांच की गई थी (3 चित्रा) lectins, जो नियमित रूप से glycan पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है और एंटीबॉडी का उपयोगmucins और glycolipids (6 चित्रा). क्योंकि लेक्टिन बाध्यकारी है और अच्छी तरह से नहीं परिभाषित किया गया है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से glycan 14,15 संरचना glycans के स्थानिक वितरण से प्रभावित है, यह महत्वपूर्ण है लेक्टिन धुंधला के लिए उपयुक्त नियंत्रण लागू. Enzymatic दरार और प्रतिस्पर्धी निषेध: यहाँ हम परीक्षण ऊतकों पर लेक्टिन धुंधला हो नियंत्रित करने के लिए दो तरीके प्रदर्शित करता है. Glycan epitopes के विखंडन glycan विशिष्ट एंजाइमों के साथ ऊतक अनुभाग पचाने के द्वारा किया गया था, बैक्टीरियल sialidase उदाहरण के लिए सियालिक एसिड बाध्यकारी SNA (4 चित्रा) के लिए नियंत्रण के रूप में. मामलों में जहां विशेष एंजाइम (जैसे glycosidase) glycan मिलान को हटाने का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध नहीं है, लेक्टिन विशिष्टता काइटिन Jacalin या sWGA धुंधला के लिए hydrolyzate धुंधला हो जाना के लिए Melibiose (चित्रा 5) के रूप में एक प्रतियोगी अवरोध करनेवाला जोड़कर पुष्टि की जा सकती है.

    हम यहाँ दिखाना है कि तस्वीर जमी ऊतकों के नमूनों, जो rou हैंtinely क्लिनिक और अनुसंधान प्रयोगशालाओं में प्राप्त की है, और अक्टूबर में एम्बेड किया जा सकता है और mucin glycoproteins और उन पर मौजूद कई glycans का अध्ययन किया जाता है.

    Lectin एबी / स्रोत मेजर विशिष्टता
    LFA Limax flavus (पीला काउंटर) टर्मिनल सिया
    मां * Maackia amurensis (अमूर Maackia) / Siaα2 - 3Galβ1-R Galβ1-R पर 3-O-सल्फेट
    SNA Sambucus nigra (Elderberry) / Siaα2 6Gal Siaα2 6GalNAc
    WGA ट्रिटिकम vulgaris (गेहूं रोगाणु) GlcNAcβ1 - 4GlcNAcβ1 4GlcNAc / सिया
    sWGA Succinylated ट्रिटिकम vulgaris (गेहूं रोगाणु) GlcNAc एंड बीएटा, 1-4GlcNAcβ1 - 4GlcNAc
    PNA मूँगफली (मूंगफली का) Galβ1 3GalNAc (T-प्रतिजन unmodified)
    Jacalin Artocarpus integrifolia (Jacalin) Galβ1 3GalNAc ओ से जुड़े glycans पर पाया
    ईसीए Erythrina cristagalli (कोरल पेड़) Galβ1 - 4GlcNAc
    TKH2 प्रतिरक्षी O-जुड़े glycans पर Siaa2 6GalNAc (STN)
    CA19-9 प्रतिरक्षी Siaa2 - 3Galβ1 4 (Fuca1-3) GlcNAc (SLE एक)
    SNH3 प्रतिरक्षी Siaa2 - 3Galβ1 3 (Fuca1 4) GlcNAc (SLE एक्स)

    लघुरूप: अब, एंटीबॉडी, सिया, सियालिक एसिड, लड़की, गैलेक्टोज; GalNAc, GlcNAc, एन - एसिटाइलग्लूकोसेमाइन; fuc, Fucose, STN, Sialyl तमिलनाडु; sle एक, sialyl Lewisa; SLE x, sialyl लुईस एक्स. मां के लिए वाणिज्यिक स्रोतों माली MALII, और महिंद्रा शामिल हैं.

    तालिका 1 lectins और glycan epitopes के लिए एंटीबॉडी के एक आंशिक सूची.

    चित्रा 1
    चित्रा 1. Alcian ब्लू और स्थिर और आयल एम्बेडेड बृहदान्त्र ऊतकों की आवधिक एसिड Schiff धुंधला हो मानव, माउस, या चिकन बृहदान्त्र नमूनों के ऊतक वर्गों अक्टूबर (ऊपरी पैनल) में जमे हुए या आयल (कम पैनल) में एम्बेडेड. आवधिक एसिड Schiff (पीए) के साथ दाग थे या Alcian ब्लू (एबी). इन अभिकर्मकों गुलाबी या नीले बलगम क्रमशः दाग. ऊपरी पैनल: जमे हुए ऊतकों में, जाम कोशिकाओं में mucins अलावा, secreted बलगम भी था विज़ible (तीर). कम पैनल: ऊतकों में आयल एम्बेडेड, बलगम धुंधला हो जाम कोशिकाओं तक ही सीमित था. नाभिक (पीए) Surgipath या मेयर (एबी) Hematoxylin के साथ counterstained थे. स्केल बार 100 सुक्ष्ममापी इंगित करता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

    चित्रा 2
    चित्रा 2. ऊष्मायन परिणाम की पर्याप्त नुकसान mucins में Citrisolv जमे हुए चिकन ileum नमूनों के सीरियल वर्गों में 10% formalin buffered और हाइड्रेटेड (बाएं पैनल) रखा तय किया गया है, 20 मिनट के लिए 70% में अनुक्रमिक ऊष्मायन, 90% और 100% इथेनॉल इथेनॉल में निर्जलित (मध्यम पैनल), या इथेनॉल में निर्जलित और 1 घंटा (सही पैनल) लिए Citrisolv साथ मंजूरी दे दी है. निर्जलित नमूने वापस Hematoxylin और लाल भामसान रंग (एच एंड ई) या Alcian नीले धुंधला पहले पीबीएस rehydrated गया. इथेनॉल निर्जलीकरण और Citrisolv समाशोधन सुधार ऊतक morphology (उदाहरण के लिए, शीर्ष पंक्ति, मध्य और सही चित्र बनाम छवि बाएं). इथेनॉल निर्जलीकरण Alcian ब्लू धुंधला हो जाना (मध्य पंक्ति, छोड़ दिया और मध्यम चित्र की तुलना) पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव था. इसके विपरीत, Citrisolv ऊष्मायन Alcian नीले धुंधला कम है और यह एक पैटर्न है कि आयल एम्बेडेड ऊतकों (1 चित्रा) में देखा है कि इसी तरह जाम कोशिकाओं (मध्य पंक्ति, सही छवि) तक ही सीमित है. इन आंकड़ों का मतलब है कि आयल एम्बेडेड नमूनों में बलगम granules के मजबूत सिकुड़ते और समाशोधन कदम के दौरान जाम कोशिकाओं में बलगम की संघनक कारण धुंधला हो जाना है. बलगम की जमी अक्टूबर एम्बेडेड ऊतकों में fainter और कम घने धुंधला हो बलगम के ऊतकों में एक अधिक प्राकृतिक वितरण को दर्शाता है. बॉक्सिंग क्षेत्रों के उच्च magnifications तीर के साथ चिह्नित हैं. स्केल सलाखों 50 (शीर्ष और मध्यम पंक्तियाँ) सुक्ष्ममापी और 10 सुक्ष्ममापी (नीचे पंक्ति) से संकेत मिलता है.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. के बंधनस्थिर और आयल एम्बेडेड ऊतकों पर glycan epitopes lectins चिकन छोटी आंत नमूनों (ileum). अक्टूबर (ऊपरी पैनल) में जमे हुए या पैराफिन में एम्बेडेड (कम पैनल) (नीला) Jacalin, sWGA (हरी) और SNA जांच के साथ (लाल ). बॉक्सिंग क्षेत्रों के उच्च magnifications तीर के साथ चिह्नित हैं. जमे हुए ऊतकों में O-जुड़े glycans बाध्य Jacalin संरचनाओं है कि जाम कोशिकाओं से लुमेन (Jacalin, ऊपरी पैनल, तीर) में बह दिखाई पता चला. इसके विपरीत, आयल एम्बेडेड ऊतकों के लिए बाध्य Jacalin जाम कोशिकाओं (Jacalin, कम पैनल, तीर) और villi ब्रश बॉर्डर (बाएं नीचे छवि, तीर) के लिए ही सीमित था. आंशिक रूप से β1-4GlcNAc के sWGA धुंधला हो जाना दोनों जमे हुए ऊतकों में Jacalin लेक्टिन के बंधन (ऊपरी पैनल, तीर) के साथ सह - स्थानीय और ऊतकों (कम पैनल, तीर) आयल एम्बेडेड. इसके विपरीत, SNA α2-6 जुड़ा हुआ सियालिक एसिड के लिए बाध्य lectin intracellular है (SNA, arrowheads), और Jacalin (रंग के साथ नहीं सह स्थानीय बनानाछवि, लाल में SNA arrowhead बिंदीदार तीर के साथ चिह्नित नीले रंग में Jacalin) के साथ चिह्नित. स्केल सलाखों 100 (छोड़ दिया छवियाँ) सुक्ष्ममापी और 20 सुक्ष्ममापी (बढ़ाया बॉक्सिंग क्षेत्रों) से संकेत मिलता है.

    चित्रा 4
    चित्रा 4. Enzymatic दरार नियंत्रण SNA साथ सियालिक एसिड धुंधला के लिए चिकन छोटी आंत नमूनों. म्यू 250 / मिलीलीटर Arthrobacter ureafaciens sialidase (ऑस्ट्रेलिया) के साथ या 2.5 घंटे के लिए 50 मिमी सोडियम एसीटेट पीएच 5.5 बफर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे थे AUS उपचार biotinylated SNA साथ धुंधला, सियालिक एसिड को SNA बाध्यकारी विशिष्टता की पुष्टि abolishes. पैमाने बार 100 सुक्ष्ममापी इंगित करता है.

    चित्रा 5
    चित्रा 5. Jacalin और sWGA साथ glycan धुंधला हो जाना के लिए प्रतियोगी निषेध नियंत्रण चिकन छोटी आंत नमूनों (ileum). एक Jacalin और sWGA मिश्रण साथ विशिष्ट lec की उपस्थिति में incubated रहे थेटिन inhibitors: Melibiose (मध्यम स्तंभ), काइटिन hydrolyzate (दाएँ स्तंभ) या बिना अवरोध करनेवाला (ए और डी). ऊपरी पैनल: (बाएं) inhibitors बिना Jacalin धुंधला हो जाना. (बीच में) Jacalin धुंधला हो Melibiose से हिचकते किया गया था. (दाएं) काइटिन hydrolyzate Jacalin धुंधला हो जाना रोकना नहीं था. निचले पैनल: (बाएं) अवरोध करनेवाला बिना sWGA धुंधला हो जाना. (बीच में) Melibiose sWGA धुंधला हो जाना नहीं रोकना था. (सही) sWGA धुंधला हो जाना था काइटिन - hydrolyzate द्वारा हिचकते. इस निषेध ऊतकों साथ lectins की विशिष्ट बातचीत की पुष्टि करता है. सितारे धुंधला निषेध के निशान छवि. पैमाने बार 100 सुक्ष्ममापी इंगित करता है.

    चित्रा 6
    6 चित्रा. स्रावी mucins, glycolipids और जमे हुए मानव कोलोरेक्टल कैंसर के ऊतकों में glycan epitopes की जांच. Villous कार्सिनोमा और श्लेष्म कार्सिनोमा से कोलोरेक्टल कैंसर बायोप्सी तस्वीर तरल नाइट्रोजन में जमे हुए थे और अक्टूबर में एम्बेडेड. ऊतक वर्गों 1 घंटे के लिए incubated रहे थेsecreted mucin के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ MUC5AC, sialyl लुईस एक - glycan मिलान gangliosides (कोलोरेक्टल कैंसर मार्कर 19-9 सीए) पर पाया, और sialyl TN - mucins पर प्रचुर मात्रा में glycan मिलान (TKH2 एंटीबॉडी के साथ पता लगाया), 30 मिनट के साथ ऊष्मायन द्वारा पीछा biotinylated गधा विरोधी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी, और 30 मिनट ऊष्मायन peroxidase संयुग्मित streptavidin के साथ. अतिरिक्त ऊतकों 1 घंटा के लिए biotinylated lectins SNA और sWGA साथ incubated रहे थे, 30 मिनट ऊष्मायन द्वारा peroxidase संयुग्मित streptavidin के साथ पीछा किया. Peroxidase धुंधला हो एईसी किट का उपयोग कर विकसित किया गया था. काला पैमाने बार 200 सुक्ष्ममापी इंगित करता है.

    Discussion

    जमे हुए ऊतकों में बलगम और glycan epitopes के संरक्षण के ऊतकों कि पैराफिन में एम्बेडेड थे करने के लिए बेहतर है. हम secreted बलगम परत (1 आंकड़े और 3) और तीन glycans संरचनाओं के वितरण (3 चित्रा) आयल - एम्बेडेड ऊतकों के साथ तुलना जमे हुए ऊतकों में के संरक्षण का प्रदर्शन किया. Carnoy समाधान के रूप में विशेष fixatives, 17 (60% इथेनॉल, क्लोरोफॉर्म 30%, 10% एसिटिक एसिड) ऊतकों के नमूनों में बलगम परत का इष्टतम संरक्षण के लिए विकसित किया गया है. बेहतर, इस समाधान के ऊतकों के नमूनों है कि बलगम के अध्ययन के लिए समर्पित कर रहे हैं इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया किया जाना चाहिए और बलगम परत 16-17 की चिकनी उपस्थिति बनाए रखने के लिए दिखाया गया था. अक्टूबर में एम्बेडेड unfixed जमे हुए नमूनों में बलगम परत बीहड़ प्रकट होता है और कुछ क्षेत्रों में ऊतक से अलग हो सकता है, लेकिन समग्र परत मोटाई ऊतकों कि Carnoy समाधान और embedd के साथ तय किया गया में मनाया साथ समझौते में है16-17 आयल में एड. 16 - उदाहरण के लिए, जमे हुए मानव बृहदान्त्र ऊतक अनुभाग में बलगम परत ~ 100 (चित्रा 1) सुक्ष्ममापी, जो रिपोर्ट Carnoy's तय मानव बृहदान्त्र नमूना 55.4 ± 2.5 सुक्ष्ममापी (204.8 मीटर 7.7 रेंज) के लिए सीमा के भीतर है.

    यह दशकों के लिए ज्ञात किया गया है कि इथेनॉल ~ जैविक 18 नमूनों में से 30%, और संकोचन xylene के रूप में कार्बनिक सॉल्वैंट्स, 13 ऊतकों से प्रोटीन Citrisolv और क्लोरोफॉर्म निकालने lipids, glycolipids और कुछ हद तक, कि निर्जलीकरण का परिणाम है. (10%) formalin buffered निर्धारण, निर्जलीकरण (इथेनॉल एकाग्रता में वृद्धि), और समाशोधन (Citrisolv या xylene): पैराफिन embedding के लिए ऊतक प्रसंस्करण निम्नलिखित चरण शामिल हैं. Unfixed जमे हुए ऊतक वर्गों पर इन कदमों की नकल उतार कर, हम दिखा दिया कि जमे हुए ऊतक ऊतक morphology में जिसके परिणामस्वरूप वर्गों से Citrisolv बलगम है है कि आयल - एम्बेडेड ऊतकों की है कि करने के लिए समान है निष्कर्षों (Figurई 2, सही पैनल). इसके विपरीत, बलगम परत formalin या इथेनॉल (2 चित्रा, छोड़ दिया और केंद्र पैनल) के साथ ऊष्मायन से नहीं बदल गया था. यह पता चलता है कि मानक आयल embedding प्रक्रिया के समाशोधन कदम है, बलगम परत के पतन में परिणाम जो Citrisolv / xylene में लंबे समय तक ऊष्मायन की आवश्यकता है. Formalin निर्धारण बलगम परत और जमे हुए ऊतकों वर्गों है कि formalin के साथ तय किया गया lectins glycans glycolipids, और प्रोटीन (2 आंकड़े, 3 और 6) के खिलाफ और एंटीबॉडी के साथ आसानी से सना हुआ जा सकता है नुकसान नहीं करता है. ये प्रभाव नगण्य झिल्ली बाध्य प्रोटीन और विकृति ऊतक के अध्ययन के लिए किया जा सकता है, लेकिन हो सकता है वे secreted बलगम परत के रूप में अत्यधिक हाइड्रेटेड संरचनाओं के लिए विनाशकारी कर रहे हैं. Mucins हालांकि histological अध्ययन अभी भी आयल - एम्बेडेड नमूने, जिसमें बलगम परत संरक्षण suboptimal है के साथ कर रहे हैं ज्यादातर का आयोजन किया. से की सटीक पहचान के रूप में इस तरह के बलगम परत संरचना का गहराई से विश्लेषण मेंcreted या झिल्ली बाध्य MUC ग्लाइकोप्रोटीन संयोजन विशिष्ट एंटीबॉडी और प्रोटीन अनिवार्य जरूरतों की पहचान करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री की आवश्यकता होती है. बलगम परत का संरक्षण है, लेकिन इस तरह के अध्ययन के लिए प्रारंभिक आवश्यकता है.

    कई प्रयोगशालाओं अक्टूबर में जमे हुए ऊतक के नमूने है कि अतीत में विभिन्न परियोजनाओं के लिए एकत्र किए गए थे, इन ऊतकों आसानी से कर सकते हैं के mucins, glycolipids और glycan विशेष fixatives है कि विशिष्ट बलगम संरक्षण के लिए तैयार हैं ऊतकों में जमा करने की आवश्यकता को नष्ट करने के वितरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया. जमे हुए ऊतकों न्यूनतम प्रोसेसिंग से गुजरना और इसलिए glycans, जो प्रकृति में हाइड्रेटेड हैं प्राकृतिक वितरण संरक्षित है. यह सूक्ष्म मेजबान बातचीत के दायरे में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. प्राकृतिक और secreted mucins और कई glycan संरचनाओं इन "बाधा" अणुओं सजाने के वितरण बहुतायत के ज्ञान मेजबान रक्षा, माइक्रोबियल शोषण और pathogenes को समझने में महत्वपूर्ण हो जाएगाहै.

    Disclosures

    ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    2-methyl butane Fisher Scientific 03551-4
    AEC peroxidase substrate kit Vector Labs SK-4200
    Alcian Blue Sigma-Aldrich A3157
    Anti-CA 19-9 monoclonal antibody Calbiochem CA1003
    Anti-MUC5AC monoclonal antibody Millipore MAB2011
    Avidin-Biotin blocking kit Vector Labs SP-2001
    Biotinylated donkey anti-mouse antibody Jackson Immunoresearch 90863
    Biotinylated SNA Vector Labs B-1305
    Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A4503
    Chitin-hydrolysate Vector Labs SP-0090
    Cryostat microtome Leica Microsystems Leica CM 1800
    Hematoxylin Surgipath Medical Ind. 3801570
    Hydrogen peroxide 30% Fisher Scientific H325-100
    Jacalin-FITC Vector Labs FL-1151
    Mayer's Hematoxylin Sigma-Aldrich MHS32
    Melibiose Sigma-Aldrich M5500
    Nuclear Fast Red Vector Labs H-3403
    OCT compound VWR International 25608-930
    Peroxidase conjugated streptavidin Jackson Immunoresearch 94638
    Schiff reagent Electron microscopy sciences 26052
    sWGA-Rhodamine Vector Labs RL1022S
    TKH2 monoclonal antibody ATCC HB-9654
    VectaMount aqueous mounting media Vector Labs H-5501
    Cytoseal 60 Thermo Scientific 8310-4
    Peel-A Way molds Polysciences Inc. 18646A-1

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