固定化酶和稳定的疏水盐改性的Nafion

Bioengineering

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Summary

本文将介绍合成一种疏水改性Nafion膜固定化酶膜和固定在膜蛋白和/或酶和测试他们的具体活动的过程。

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Meredith, S., Xu, S., Meredith, M. T., Minteer, S. D. Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization. J. Vis. Exp. (65), e3949, doi:10.3791/3949 (2012).

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Abstract

在过去的十年中,已经有丰富的应用,固定和稳定的酶,包括生物催化,生物传感器和生物燃料电池的应用在大多数的生物电化学1-3,被固定到电极表面的酶或细胞器,与使用某种类型的聚合物基体中。这种聚合物支架应保持稳定的酶,并允许浅显的扩散和矩阵的分子和离子。多胺或多元醇的大部分用于这种类型的固定的聚合物 - 聚合物模拟酶的自然环境,封装和稳定通过氢键或离子键的酶。稳定酶的另一种方法涉及使用胶束,其中包含可以封装和稳定酶的疏水区域,尤其是4,5,敏提尔组制定了胶束聚合物市售的Nafion 6,7的Nafion本身就是一个胶束聚合物允许质子和其他小阳离子通道辅助扩散,但胶束和渠道是极其微小的聚合物是非常酸性的磺酸侧链,这是不利于酶的固定化。然而,当Nafion膜超过疏水烷基季铵盐如四丁基溴化铵(TBAB)混合,季铵盐阳离子取代质子磺酸基聚合物侧链( 图1),并成为反离子。这将导致更大的胶束和聚合物内的通道,让烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的酶的功能,如必要的大型基板和离子的扩散。这个修改的Nafion聚合物已被用于许多不同的类型以及线粒体酶固定在生物传感器和生物燃料电池的使用。8-12本文介绍了一种新颖的程序,使这个麦克风ellar聚合物固定化酶膜,可以稳定酶。合成胶束酶的固定化膜,固定在膜的酶的过程,研究酶固定化酶的具体活动的检测详述如下。

Protocol

1。季铵盐改性的Nafion

  1. 摇动一瓶5%W / V的Nafion暂停约大力。被暂停30秒,确保Nafion膜均匀的解决方案。
  2. 吸取了2毫升的Nafion膜,现在又重新悬浮到一个玻璃小瓶(瓶量可能包含从2.5毫升到10毫升)。
  3. 测量了3倍摩尔过量盐( 见表1)适当群众的烷基三甲基溴化铵(相对的Nafion聚合物磺酸基),并加入到小瓶含2毫升的Nafion。
  4. 涡小瓶10-15分钟1500转。
  5. 粘性溶液倒入塑料称重托盘约措施。 3×3英寸,并使用吸管传送任何残留的解决方案,从小瓶称重托盘。
  6. 允许溶剂蒸发出的权衡船,离开称重托盘的底部( 连接黄色/棕色,透明薄膜古雷2)。溶剂的挥发速度,应该是这样的,它需要所有溶剂蒸发超过6小时。如果溶剂蒸发过快,将形成一个白色的,硬皮材料,而不是一个透明的薄膜,表明聚合物胶束的结构已被破坏,你必须重新启动程序。如果溶剂蒸发速度太慢,一个去加湿器可能是必要的,因为过于缓慢蒸发通常会导致俗气,橙色的凝胶,您必须重新启动程序。典型的溶剂蒸发温度范围是20 - 37°C干燥的实际情况是在房间的相对湿度和温度的功能,但重要的是,干燥缓慢保持胶束结构,但不能太慢,使凝胶形成。
  7. 填补了权衡与18MΩcm去离子水的水(10-20毫升),盖船,并允许浸泡12-24小时,以消除过剩烷基三甲基溴化铵盐和HBr。
  8. 聚合物允许的称重托盘坐下发现,直到聚合物在这一点上是完全干燥,应该是明确的,有点脆的塑料薄膜。再次,如果空气很潮湿,一个去加湿器可能有必要及时完成蒸发。
  9. 使用铲,小心地取出称重托盘干片,它转移到一个干净的玻璃瓶。
  10. 加入2毫升乙醇和3混合陶瓷珠,4小时旋涡或直到完全重新悬浮聚合物薄膜。

2。到TBAB的改性Nafion膜活性测定酶的固定化

  1. 干酶,掂量出1-10毫克到1.​​5 mL离心管中的酶,并添加1毫升100毫米的pH 7磷酸盐缓冲创建一个1-10毫克/毫升酶液。火炭ŕ1酶的溶液中,用二喹啉酸(BCA)检测13,以确定蛋白质的数量,并添加适量带来100毫米的磷酸盐缓冲蛋白浓度1-10毫克/毫升。 1-10毫克/毫升,通常会对应到1-50纳摩尔/毫升。
  2. 120μL的1毫克/毫升酶液,添加10秒60μL的烷基铵改性的Nafion溶液,和旋涡。 (这种混合物可以扩展为大量的重复。酶聚合物溶液比例保持在2:1。)
  3. 吸取60μL的酶/聚合物溶液成3个独立的1厘米2试管底部,允许干通宵。

3。固定的NAD依赖型脱氢酶酶的含量测定

  1. 到试管中,加入NAD(新鲜配制)的15毫米50毫米焦磷酸钠(pH值8.8)1.3毫升,1.5毫升,0.1毫升的水。
  2. 将试管中的紫外/可见分光光度计(即ThermoScientific Evolut离子260生物和热Spectronic Genesys的20)设置为340纳米的波长。
  3. 零光谱仪,然后加入0.1 mL乙醇。混合试剂,轻轻吹打溶液和5倍。为一片空白,使用更多的水,而不是0.1毫升0.1毫升的乙醇。
  4. 试剂后,添加到试管和20分钟后,记录在5分钟,在340 nm的吸光度。画出两个数据点,得到一个可以用来计算活动的斜坡。

4。固定吡咯喹啉醌依赖性脱氢酶的含量测定

  1. 到试管中,加入1.5毫升的磷酸钠(pH值7.3)和600微米的PMS 200μL。
  2. 试管放置在设定波长600纳米的紫外/可见分光光度计,然后零谱仪。
  3. 加入100μL,700μLDCIP和200μL利益基板(乙醇,乙醛,甘油,葡萄糖,或甘油),由轻轻吹打solut的试剂混合离子起来下降了5倍。为一片空白,用200μL的水,而不是利益的基板。
  4. 试剂后,添加到试管和20分钟后,记录在5分钟,在600 nm的吸光度。

5。固定化葡萄糖氧化酶的含量

  1. 到试管中,加入2.0毫升含有0.2 M P-羟基酸,0.02%(W / V)的叠氮化钠,128×过氧化物酶,4 -氨基安替比林0.3毫米,1 M磷酸钾,50 mM葡萄糖溶液。混合的解决方案,通过吸取和5倍。
  2. 试管放置在波长510 nm的紫外/可见分光光度计集。
  3. 记录后试剂的试管,并在20分钟后再次被添加到5分钟,在510 nm的吸光度。

6。代表结果

改性的Nafion聚合物胶束的结构可以破坏干燥原盐/聚合物共同铸造电影太FAST。 图2显示正确在一个透明,浅棕色电影已经干涸的盐/聚合物混合物。 A片,干燥过快可能会导致不透明,白色聚合物薄片由于干燥过程中,可以摧毁胶束结构的事实。

一旦已修饰的Nafion聚合物和酶混合到试管底部共同投,酶的活性检测可用于评估内酶聚合物膜的稳定性。 表2-4显示两个脱氢酶的检测结果葡萄糖氧化酶固定成各种改性的Nafion薄膜,分别。注意缓冲溶液中的酶与固定化酶活性较高,表明改性的Nafion聚合物实际上可以增强某些酶的活性(称为超活性)。其他酶有运输的限制,降低他们的具体活动时,固定在聚合物(即纤维素酶和淀粉酶,其基板是相当大的大分子)。

使用了季铵盐 3倍过量
四丙基溴化铵(T3A) 32.37毫克/毫升
四丁基溴化铵(TBAB的) 39.19毫克/毫升
TPAB(tetrapentylammonium甲基溴) 46.​​01毫克/毫升
TEHA(triethylhexylammonium甲基溴) 32.37毫克/毫升
TMHA(trimethylhexylammonium甲基溴) 27.25毫克/毫升
TMOA(trimethyloctylammonium甲基溴) 30.66毫克/毫升
TMDA(trimethyldecylammonium溴) 34.07毫克/毫升
TMDDA(trimethyldodecylammonium甲基溴) 37.48毫克/毫升
TMTDA(trimethyltetradecylammonium甲基溴)
TMHDA(trimethylhexadecylammonium甲基溴) 44.31毫克/毫升
TMODA(trimethyloctadecylammonium甲基溴) 47.71毫克/毫升

表1。四烷基季铵盐款项使用的Nafion聚合物改性。

Nafion的类型 酶的活性(U / G)
缓冲区(无聚合物) 16.63±8.11
Nafion膜(un-mod.) 9.25±2.21
TMTDA 3.23±2.92
TBAB的 3.93±3.33
TMDDA 4.19±1.04
TMOA 3.51±1.11
TMDA等 8.00±4.53
TMHA 1.68±1.39
TMHDA 4.83±0.99
TMODA 10.45±3.20

表2的NAD依赖的葡萄糖脱氢酶活性,固定在选定改性的Nafion聚合物(注:固定的活动是一种特定酶的活性初始功能)。

Nafion的类型 酶的活性(亩/ G)
缓冲区(无聚合物) 7.18±0.51
Nafion膜(un-mod.) 70.1±0.5
TMTDA 133±6
TBAB的 244±4
TMDDA 221±6
TMOA 1.78±0.63
TMDA等 206±5
TEHA 40.1±50.6
TMHDA 0
TMODA 1.45±0.06

表3固定在选定改性的Nafion聚合物(注:固定的活动是一种特定酶的活性初始功能)吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶活性

Nafion的类型 酶的活性(U / G)
缓冲区(无聚合物) 103.61±3.15
Nafion膜(un-mod.) 19.93±10.10
TMTDA 247.25±12.49
TBAB的 152.27±5.29
TMDDA 262.05±6.26
TMOA 129.18±2.31 TMDA等 141.23±1.97
TMHA 131.75±2.89
TMHDA 132.50±1.18
TMODA 136.50±0.96

表4代表葡萄糖氧化酶的具体活动固定在选定改性的Nafion聚合物(注:固定的活动是一种特定酶的活性初始功能)。

图1
图1。TBAB的成立将酶固定化的Nafion聚合物和后续使用示意图。

图2
图2。初步合作演员的Nafion薄膜和TBAB的光学照片。延缓干燥产生一个透明,浅棕色的薄膜覆盖的博称重托盘ttom的。

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Discussion

在描述过程中,四烷基季铵盐用于修改商业的Nafion创建胶束聚合物,可用于固定和稳定的酶。实验中所述的程序表演,该聚合物可用于多种固定的酶具有高活性保留。如果感兴趣的酶具有非常低的活动,或者是不纯的,高浓度可能会被要求,不应影响固定化过程中,除非固定酶浓度大于10毫克/毫升。简单的程序区别于其他酶固定化技术没有合成步骤是必需的(如合成聚合物或交联)。此外,这些合成步骤经常变性蛋白质或大大减少他们的活动。蛋白浓度为1mg/ml仅仅是一个建议酶量高浓度。总是可以雇用较低的酶浓度,但将导致在减少体积的催化活性。从理论上讲,酶浓度较高,可用于只要酶溶解。

由于聚合物是水溶性低脂肪醇如甲醇,乙醇,丙醇,高比例的酒精混合酶聚合物悬浮液时,必须存在。在许多情况下,这是不是问题,只要乙醇及时蒸发,一次投酶封装膜。然而,这种固定的限制,可以发生,如果一种酶并不是在所有的酒精宽容和变性或沉淀后,除了修改后的Nafion膜悬浮。在极少数情况下,酶会沉淀或变性混合改性的Nafion暂停时,通常表明已成为酶变性,将无法正常工作。它有可能减少在暂停重新悬浮在乙醇/水混合物的聚合物的酒精含量较低,但脂肪醇在显着浓度的悬浮液(> 25%)的要求,所以这种固定化技术不工作无法容忍酒精浓度的酶/酶解决方案。

三种酶聚合物的酶检测表明,在相对具体活动的趋势相比,溶液中的酶是一种酶系统的功能。这是意料之中的,因为每个酶是不同规模,不同PI,最适pH值不同,以及事实吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶是一种膜相关蛋白,因此需要一个非常不同的化学微环境,细胞内蛋白质。因此,胶束疏水改性的Nafion给出了一个更稳定的积极吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖比缓冲区脱氢酶膜样的环境,并显示超活性,这是罕见的固定化酶。一诺特尔要考虑的问题是,降低运输大分子聚合物膜和葡萄糖(此处所示的所有三项测试基板)虽然小,辅酶NAD需要在扩散膜的NAD依赖脱氢酶,这降低了观察酶的活性。总的来说,这是很重要的注意,每种酶所需的确切的聚合物,因为大小,电荷,最适pH值,和运输基板/每个酶系统的辅助因子的差异,要优化。

其他比固定化酶的检测,已与这种酶固定化方法的探索主要应用是酶的生物传感器和生物燃料电池的制造。当投在电极表面上修饰的Nafion聚合物封装氧化酶,生物催化过程可以发生在适当的底物和辅助因子的存在,产生的电流RESPonse。改性Nafion膜制备的bioanodes已在利用生物燃料电池,乙醇,甲醇,丙酮和甘油,在引进使用。

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Disclosures

没有利益冲突的声明。

Acknowledgments

作者们承认,海军研究办公室,美国大豆委员会,国家科学基金会资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nafion Sigma-Aldrich 70160
Tetra alkylammonium bromide salts Sigma-Aldrich n/a
Alcohol dehydrogenase Sigma-Aldrich A3263
Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) Simga-Aldrich N7004
Sodium pyrophosphate Sigma-Aldrich P8010
Phenazine methosulfate (PMS) Sigma-Aldrich P9625
2,6-Dichloroindophenol (DCIP) Sigma-Aldrich D1878
Glucose oxidase Sigma-Aldrich G7141
4-Hydroxybenzoic acid Sigma-Aldrich 240141
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032
Peroxidase Sigma-Aldrich P8375
4-aminoantipyrine Sigma-Aldrich 06800
UV/Vis Spectrophotometer Thermo Evolution 260 Bio or Spectronic Genesys 20
Vortex Genie
Analytical balance

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References

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Comments

1 Comment

  1. Hi, Xu.
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    I promise that the video will only be used by myself, and no share on Internet.
    Thank you very much.

    Reply
    Posted by: Hudan C.
    June 3, 2013 - 4:16 AM

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