Abstract
肿瘤创造出独特的免疫微环境（TME），肿瘤微环境，使白细胞招募到肿瘤的各种趋化因子和生长因子1,2。然而，一旦在屯门东，这些细胞失去的能力，以促进抗肿瘤免疫，并开始支持肿瘤的生长和下调抗肿瘤免疫反应3-4。肿瘤相关白细胞的研究主要集中在细胞分离肿瘤引流淋巴结或脾脏由于从原发肿瘤获得足够的细胞数量和纯度的固有困难。同时确定细胞活化和贩运的机制，通过对荷瘤小鼠的淋巴系统是重要的，可能会给了解癌症的免疫反应动力学，在我们的经验，很多白细胞，包括树突状细胞，肿瘤引流淋巴结有不同的表型，肿瘤浸润5,6比。此外，我们先前已经表明，继转移分离的T细胞肿瘤淋巴结不tolerized能够应对不同的TME分离的T细胞，这是增殖或细胞因子tolerized和无能的体外二次刺激生产7,8。有趣的是，我们已经表明，改变肿瘤微环境，如提供的CD4 +辅助性T细胞通过过继转移，促进CD8 + T细胞维持促炎效应功能5。从前面提到的研究结果表明测量从TME浸润免疫细胞的细胞反应，而不是留在外围的细胞的重要性。学习使用9天旎生物隔离系统渗入肿瘤的免疫细胞的功能，我们已经修改和优化基于这种抗体的隔离程序，以获取高é抗原呈递细胞和肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞nriched人口。该协议包括从一个自发的前列腺肿瘤模型（腺癌转基因老鼠的前列腺的流浪汉）10和皮下黑色素瘤（B16细胞）肿瘤模型，通过后续的纯化各种白细胞人口小鼠前列腺组织的详细解剖。
Protocol
1。流浪汉前列腺肿瘤的骨髓细胞的分离
- 动物审查委员会的指导下，所有的程序进行。流浪汉小鼠自发发展作为由probasin启动10控制的转基因（SV40）的结果，原地前列腺肿瘤。 可用于此过程中使用任何雄性小鼠 。虽然流浪汉的肿瘤可以在任何年龄的收获，它应当指出，流浪汉前列腺肿瘤仍然很小，直到老鼠达到年龄超过20周。安乐死CO 2窒息的小鼠。删除的泌尿生殖道（UGT）的，切开腹腔的脂肪组织中拉了回来。脂肪组织是泡沫，闪闪发光的寻找组织。
- 找到膀胱;在于直接与两个大的，白色的精囊。不放膀胱用镊子。保持闭合的剪刀，抚平脂肪组织，并找到尿道。削减对Urethra尽可能接近骨盆和切断输精管。而削减，同时拉动了对膀胱的。这将释放整个UGT的，现在可以将微解剖，以获取前列腺每个叶。
- 放置在室温下PBS UGT的。使用解剖显微镜可视化转移酶和清除任何多余的脂肪组织。使用镊子，守住尿道和前列腺腹侧，外侧和前叶收集。当你收集其余叶，将在PBS组织。
- 取出精囊和丢弃。
- 关闭剩余的组织180°。收集壶腹腺和背前列腺叶。
- 使用镊子，捉弄除了前列腺组织，放入消化（分解）缓冲区。
- 发生在1毫升分离缓冲液（100 U / ml的胶原酶IV型和100微克/毫升DNA酶的RPMI + 10％FBS）的肿瘤组织。每个肿瘤五月requ愤怒独特的分离条件;流浪汉前列腺肿瘤，使用1毫升的B16肿瘤，用5毫升（见下文）。注：胶原酶（I - IV）级将取决于细胞的人口是孤立的骨髓细胞分离与IV型是最好的，而淋巴细胞产量较高，使用I型
- 地方管在37°C间孵化器30分钟。
- 吸取1毫升吸管上下容易流动的单细胞悬液。
- 70微米的过滤器和过滤悬浮液通过互助委员会分离含10％胎牛血清补充髓细胞分离缓冲用3倍。
- 细胞悬液，离心10分钟400 XG。然后用清水冲洗10毫升互助委员会缓冲区沉淀和离心再次使用相同的设置。
- 细胞沉淀重悬于100μL互助缓冲区。接下来，添加每10 8个细胞（200μL2.4.G2杂交瘤细胞培养上清）1的微克anti-CD16/32抗体（抗体），室温孵育10分钟。注：t他FCR-γ阻断抗体（AB）的数量将增加，可能会有所不同，这取决于数字频率/ FCR-γ的细胞在组织和细胞悬液的体积，因此，这一步可能需要优化。
- “泛DC”加入100μL或10μL抗CD11b，抗CD11c的或反PDCA的1微珠每10共8个细胞，根据所需的细胞群。注：需要微珠量频率/数量的人口所需的组织细胞后，可能会有所不同而有所不同，因此，这一步可能需要优化。
- 轻轻弹管（不要旋涡）和孵育15分钟，在4-8°C间，从光屏蔽，拌匀。不要在冰上孵育。
- 清洗细胞，加入10毫升互助委员会缓冲区。在400 XG离心10分钟。
- 倒掉上清完全悬浮在500μl互助委员会缓冲区的细胞。肿瘤细胞悬液流入更好的通过LC列。 （其他选择：MS，LS，LD）。
- 申请一个新列的磁选。总理互助委员会缓冲区适量冲洗选定列的列：对于LC和MS列使用500μL。对于LS或LD列使用1毫升。后吸列列的顶部，涂于细胞悬液。使用一列，每1×10 8个细胞。
- 收集未标记的细胞（直通）和洗500μL量为1.5-2.5毫升液洗柱至少三（五）次。执行洗加入互助缓冲区列第1步，重要的是要保持列流动。尽快列流下最后一滴，加入更多的缓冲区。不要让流列的立场，或允许它运行干燥（这不能被低估，列的干燥，可以毁掉纯度，并导致细胞活力的重大损失。）。洗涤步骤2，冲洗与分离缓冲组合列（含胶原酶+ DNA酶作为德scribed步骤1.7），这是作为一个“严厉”的洗涤步骤，以冲洗掉粘碎片从死亡或濒临死亡的肿瘤细胞提供。执行清洗与互委会缓冲区的第3步，如果通过流看起来并不完全清楚洗净后第3步，继续洗2额外的洗涤步骤与互委会缓冲区（共5洗涤）。对于大的皮下肿瘤（如黑色素瘤B16），在最后的洗涤步骤，申请列的顶部用戴手套的指尖温柔的压力，这为清洁释放额外的碎片，纯化的细胞群。这一步是不是需要坚实的组织，如前列腺肿瘤，而是使用额外的洗涤步骤，共洗了至少5-6倍。
- 从磁选机列，并放置在一个合适的收集管。吸取2毫升到列的缓冲区。磁标记细胞收集坚决申请列提供的柱塞。
- 计数细胞数量，并确认为选定的细胞群的纯度流式细胞仪分析。为直流种群鉴定，建议标记包括，CD45，CD11c的，PDCA循环-1，B220和CD11b。建议的巨噬细胞标记，CD45，CD11b的，F4-80，Ly6C。
2。分离皮下B16黑色素瘤的T细胞过继转移
该协议效果最好的肿瘤，是250平方毫米或更小（估计通过测量肿瘤直径平分）。
- B16肿瘤细胞皮下注射的C57BL / 6小鼠和肿瘤测量记录每2天8。小鼠肿瘤测量250毫米2安乐死二氧化碳窒息。使用70％乙醇冲洗的蒸压手术仪器，切成小（<3毫米）件肿瘤和5毫升分离溶液（5％FBS，胶原酶I型（200 U / ml的）和DNA酶I（100微克的补充培养基中孵育/毫升））为30分钟在37°C，移液（使用1000μ升吸管尖）和涡旋孵化期间每隔10分钟。如果随后将分离骨髓细胞，替代5％FBS和型胶原酶与10％FBS和胶原酶IV型（200 U / ml的），分别我。
- 孵化后，通过70微米的细胞过滤细胞悬液，用10毫升互助委员会缓冲区（每制造商的指示，美天旎生物技术准备）两次。可选- （> 300毫米），非常大的肿瘤，炎性细胞可以预先使用密度梯度离心法（Percoll密度或Ficoll分离）丰富。
- 吸洗上清增加1微克anti-CD16/32 antibody/10 8细胞克隆2.4.G2培养上清（200μL），室温孵育10分钟。
- 不用洗，加1微克抗Thy1.1系体育抗体，每10 8个细胞混合管和孵育30分钟，由轻冰屏蔽，轻轻地弹。
- 洗细胞除去未结合的PRI玛丽抗体加入10毫升互助委员会的缓冲和离心5分钟，在400 XG。
- 吸上清，每10 7细胞总数增加20μL抗PE的微珠（美天旎生物技术），根据制造商的说明。
- 拌匀，轻轻弹管（不涡）孵育4°C间（不要使用冰）为15分钟，从光屏蔽。注意：涡旋可以减少珠的完整性。
- 洗净，加入10毫升互助委员会的缓冲和离心5分钟，在400 XG细胞。
- 吸上清，重悬细胞，在500μL缓冲互助。对于肿瘤的尺寸较大（> 300毫米2），使用1毫升的缓冲区。
- 将一个LC（大格）列在磁场分离。肿瘤细胞悬液流经这些列。冲洗500缓冲液互助列总理列。大多数肿瘤也将流经LS和LD列，但需要进一步的消化和机械ðisruption达到适当水平的单细胞悬液。洗1毫升互助委员会缓冲区列总理列。
- 涂于列细胞悬液，并允许完全流经干而不让列运行 。接下来，用500缓冲液互助，重复洗涤3倍。只有添加新的缓冲区，当储列是空的，但不要让列站立不流。这将导致堵塞和减少纯度。
- 这是一个大的皮下肿瘤的关键一步：最后的洗涤步骤后，用戴着手套的指尖，应用温和的压力列的顶部，同时还对磁选机。这将释放额外的碎片更纯粹丰富的人口。接下来，用500缓冲液互助1列。
- 删除分隔列，并将其放置在一个干净的15毫升锥形管，列添加到2毫升互助委员会缓冲区。冲洗掉磁标记的CELLS用力推入列柱塞。
- 离心5分钟400 XG洗脱分数。在这一步的纯度通常是75-80％之间。要达到纯度> 90％，重复步骤1.10-1.12使用一个新的MS列磁选过程。 MS列更小，更紧凑，因此暂停将通过列运行速度比较慢，但会产生更高的数字和利息细胞纯度。
- 计数细胞数量，为进一步的实验和流式细胞仪分析检查的纯度。对于T细胞过继转移，如在本协议中所述的隔离，等位基因的识别标记包括CD45和Thy1.1系（转移细胞）和Thy1.2（宿主T细胞）。
3。代表结果
一个特定的细胞群（即巨噬细胞，直流，T细胞等）的产量会有所不同，根据肿瘤的大小和治疗方法，是管理一起注册在肿瘤的生长。前列腺从未经处理的14-16周老流浪汉鼠标之间应产生8x10的5-1×6 +（DC）的90-95％的纯度或1×10 6 1.5×10 6 F4/80的细胞素CD11c + / PDCA的1 + / CD11b的在80-90％，从300毫克的组织的纯洁性（巨噬细胞）以上的隔离协议， 如图1所示。继转移肿瘤抗原特异性T细胞后，这些细胞的数量略有增加。穷人的纯度通常是不足洗涤，让干列（这可能会导致肿瘤碎片保留在列），或不足的Fc受体阻断。
同样，从分离的B16肿瘤细胞总数也将有所不同取决于肿瘤的大小，在组织收割的时间和带或不带DC疫苗（T细胞转移5X10 6）（1×10 5转）继转移。极少数抗原-SPEcific T细胞浸润的肿瘤抗原致敏的DC疫苗，除非也给T细胞转移后有一天。如果一个DC疫苗管理，鼠标轴承小，扪及肿瘤（<50毫米2），约3X10 5 Thy1.1系+ T细胞纯度80-85％，产量，将被视为一个“好“丰收图2A所示。但是，如果肿瘤较大的收获，总收率和纯度将减少。
巨噬细胞（F4/80的+ /细胞CD11b +）通常是在B16肿瘤细胞总数的比例较小。 图2B显示，利用从肿瘤细胞CD11b，是250平方毫米 ，产生巨噬细胞约1×10 6，纯度在90％-95％ 。此外， 图2b显示，在B16肿瘤的DC人口是异构的。与前列腺肿瘤，两个亚群：素CD11c + / PDCA循环-1 +（浆直流）和CD11cB16黑色素瘤可从+ / PDCA的1 - （传统的直流）。据估计，2X10 6 PDC和4X10 6 CDC预计从250平方毫米的B16肿瘤纯度在80％-90％。降低纯度通常是从列中的肿瘤细胞不清除的结果。步骤2.12是一个关键步骤，消除黑色素细胞的小丛，在列的基础仍然存在。经过这一步，提高纯度更好的洗涤步骤和结果的有效性。
图1。DCS（CD11c的+ / PDCA循环-1）和巨噬细胞（F4/80的+ /细胞CD11b +）从流浪汉前列腺肿瘤分离。点积值表示兴趣前或净化后的细胞百分比。
（一）Adoptiv 图2。伊利转移Thy1.1系+ / CD8 +的 T细胞和（乙）包括素CD11c + / PDCA的1粒细胞+浆议会，CD11c的+ / PDCA循环1 -从传统的DCS和F4/80的+ /细胞CD11b +巨噬细胞皮下分离B16 Thy1.2 +小鼠的黑色素瘤。点积值表示兴趣前或净化后的细胞百分比。
Discussion
可以修改该协议，根据肿瘤的大小和源（皮下，自发肿瘤，或原位肿瘤）。对于肿瘤较大，因此建议增加分离缓冲区，互助的缓冲区，清洗量。的细胞heartiness的可以依靠他们正在丰富TME。例如，在我们的经验，细胞分离，从自发的前列腺肿瘤需要温和比从皮下B16黑色素瘤细胞的分离。在肿瘤的解剖，消除尽可能多的脂肪，皮肤或其他杂物，可以防止有效的酶解。至关重要的是要完全消化肿瘤的群众，并获得单细胞悬液，以确保适当的抗体标记，以防止堵塞列。髓系细胞的分离，小牛血清建议在互委会的隔离缓冲量从2％提高到10％，提高细胞活力。这也就是ESSE。107以保持所有的缓冲区和细胞整个寒冷的协议，以防止非特异性抗体结合和列堵塞。总之，获得高度富集的抗原提呈细胞和肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的人口，我们修改和优化利用天旎生物技术的抗体为基础的隔离程序。利用该协议，继转移和内源性白细胞人口可使用针对特定类型的细胞表面标志的ABS丰富。所描述的程序的一个好处是减少肿瘤的碎片进行了广泛和严格的洗涤。这包括胶原酶中使用的洗涤缓冲液，以及确定一个点，其中增加的压力，可以消除肿瘤细胞的列列木屐。获得足够数量的免疫细胞从组织，尤其是在纯度，是适用于功能分析，可以是一项艰巨的任务。然而，在我们的经验，此处的协议产生的细胞数量最多，最大的纯度，与大多数的一致性。
Disclosures
作者有没有相关的披露。
Acknowledgments
笔者想感谢审查的手稿和视频斯科特博士达勒姆。壁间的美国国立卫生研究院，国家癌症研究所的研究计划，这项工作是在部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase I | GIBCO, by Life Technologies | 17100-017 | Use when selecting for T cells |
| Collagenase IV | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | Use for myeloid selection |
| DNase | Calbiochem | 260913 | |
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | 21870 | |
| Dulbecco’s PBS | Lonza Inc. | 17-5158 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza Inc. | 14-501F | |
| MACs Buffer | 2% FBS for T cells 10% FBS for myeloid cells |
||
| Thy1.1 PE | eBioscience | 551401 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-294 | |
| Anti-Pan DC microbeads | Miltenyi Biotec | 120-003-183 | |
| Anti-CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-300 | |
| LC column | Miltenyi Biotec | 130-042-202 | |
| MS column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 |
References
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