Abstract
白血球は、様々なケモカインおよび増殖因子1,2によって腫瘍に補充されることにより腫瘍が固有の免疫微小環境（腫瘍微小環境、TME）を作成します。しかし、一度TMEで、これらの細胞は、抗腫瘍免疫を促進し、腫瘍の成長をサポートすると3-4抗腫瘍免疫応答をダウンレギュレートを開始する能力を失う。腫瘍関連白血球に関する研究は主に、原発腫瘍から十分な細胞数と純度を得ることの困難さに起因する腫瘍所属リンパ節または脾臓から単離された細胞に焦点を当てている。担癌マウスのリンパ系を介して細胞の活性化と人身売買のメカニズムを識別することが重要であると、癌に対する免疫応答の動態に洞察力を与えるかもしれないが、我々の経験では、樹状細胞（DC）を含む多くの白血球は、腫瘍排水リンパ節腫瘍5,6を浸透させるものとは異なる表現型を有する。さらに、我々は以前から単離したT細胞を養子転送さことが示されている腫瘍所属リンパ節がtolerizedとtolerizedと増殖やサイトカインが不可能であるTMEから単離したT細胞とは異なり、in vitroでの二次刺激に応答することができますされていません生産7,8。興味深いことに、我々はこのような養子免疫伝達を介してCD4 +ヘルパーT細胞を提供するものとして、腫瘍の微小環境を変更することが示されている、CD8を促進する+プロ炎症性エフェクター機能5を維持するためにT細胞を。前述の研究のそれぞれの結果から、周辺に残っている細胞とは対照的に、TME浸潤免疫細胞から細胞応答を測定することの重要性を示しています。ミルテニーバイオ分離システム9を使用して腫瘍に浸潤する免疫細胞の機能を研究するために、我々は非常に電子メールを取得するには、この抗体ベースの分離手順を変更し、最適化した抗原提示細胞と腫瘍抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球のnriched集団。プロトコルは、自発的前立腺腫瘍モデル（トランスジェニックマウスの腺癌前立腺TRAMP）10および皮下黒色腫（B16）は、様々な白血球集団のその後の精製に続いて腫瘍モデルからマウス前立腺組織の詳細な解剖が含まれています。
Protocol
1。 TRAMP前立腺腫瘍から骨髄細胞の単離
- すべての手順は、動物の審査委員会の指導の下で行われた。 TRAMPマウスが自発的にプロバシンプロモーター10によって制御遺伝子（SV40）の結果として、土着の前立腺腫瘍を開発しています。 任意の雄マウスは、この手順を使用することができます 。 TRAMP腫瘍はどの年齢でも収穫することができますが、それはマウスがより大きい20週の年齢に達するまで、TRAMP前立腺腫瘍は、一般的に小さいままであることに留意すべきである。 CO 2窒息によりマウスを安楽死させる。腹腔を開いて切断し、脂肪組織をバックに引いて、尿生殖路（UGT）を取り外します。脂肪組織は泡沫、輝く探して組織である。
- 膀胱を見つけ、それは二つの大きな白い精嚢との間で直接位置しています。ピンセットで膀胱に保持します。はさみを閉じておく、脂肪組織を離れて滑らかにし、尿道を探します。 uに減らす可能な限り骨盤帯の近くにrethraと輸精管を切断する。ダウンカットしながら、同時に膀胱にプルアップされています。これは、現在前立腺のローブの各々を得るために、マイクロ切開することができます全体のUGTを解放します。
- 室温でPBSのUGTを配置します。 UGTを可視化し、余分な脂肪組織を一掃するために解剖顕微鏡を使用しています。鉗子を用いて、尿道に保持し、前立腺の、腹側および前方のローブを収集します。あなたはローブの残りの部分を収集しながらPBSの組織を配置します。
- 精嚢を削除し、破棄します。
- 残りの組織を180°回します。乳頭腺および背側前立腺ローブを収集します。
- 鉗子を使用して、前立腺組織を離れていじめると消化（解離）バッファに入れます。
- 1ミリリットル解離緩衝液（100 U / mlのコラゲナーゼIV型とRPMI + 10％FBS、100μg/ mlのDNase処理）の場所の腫瘍組織。各腫瘍月のrequ怒りユニークな解離状態は、TRAMP前立腺腫瘍のために、1ミリリットルを使用して、B16腫瘍のために、（下記参照）5ミリリットルを使用しています。注：コラゲナーゼ（I-IV）のグレードは、分離されたように細胞集団に依存します。リンパ球収率はI型を使用して高くなるのに対し、骨髄細胞の分離は、IV型で最高です。
- 37の場所チューブ℃で30分間インキュベーター。
- 簡単に流れる単一細胞懸濁液を得るために1ミリリットルピペットで上下にピペッティング。
- フィルタ70ミクロンのフィルターを通して懸濁液および骨髄細胞の単離のために10％FBSを添加したMAC分離緩衝液で3倍の洗浄。
- 10分間、400 xgで細胞懸濁液を遠心します。その後、10ミリリットルのMACバッファーでペレットを洗浄し、同じ設定で、再び遠心します。
- 100μlのMACのバッファ内に細胞ペレットを再懸濁します。次に、10 8細胞（200μl2.4.G2ハイブリドーマ培養上清）ごとに1μgのanti-CD16/32抗体（Ab）を追加し、室温で10分間インキュベートします。メモ：t彼は、追加するFCR-γブロッキング抗体（Ab）の量は、組織内の周波数/数FCR-γ+細胞と細胞懸濁液の体積に応じて異なる場合がありますので、このステップは、最適化が必要な場合があります。
- "パン-DC"または目的の細胞集団に応じて、10合計8個の細胞あたり抗CD11b、抗CD11c又は抗PDCA-1 MicroBeadsは、10μlの100μlを追加します。注：必要なマイクロビーズの量は、組織内の目的の集団の細胞の周波数/数に応じて変わる場合がありますので、このステップは、最適化が必要な場合があります。
- 優しくチューブ（ボルテックスは行なわないでください）フリックでよく混ぜ、遮光4から8°Cで15分間、インキュベートします。氷上でインキュベートしないでください。
- MACの緩衝液10mlを加えることにより細胞を洗浄します。 10分間、400 xgで遠心します。
- 完全に上清を捨て、およびMACバッファー500μlで細胞を再懸濁します。腫瘍細胞懸濁液は、LCカラムを通して、より良い流れ。 （他の選択肢：MS、LS、LD）。
- マグネットセパレータに新鮮な列を適用します。選択した列のためのMACバッファの適切な量ですすぎ素数列：LCとMSの列の場合は500μlを使用しています。 LSまたはLDの列に対して1ミリリットルを使用しています。プライミング列の後に、列の一番上に細胞懸濁液を適用します。すべての1×10 8細胞に1つの列を使用します。
- 非標識細胞（パススルー）を収集し、流体洗浄の1.5〜2.5ミリリットルの合計500μlの容量で3の最小値（最大5つまで）回カラムを洗浄する。列にMACのバッファを追加することにより、ステップ1を洗って実行、それは列が流れておくことが重要です。列は最後の一滴滴りとすぐに、より多くのバッファを追加します。流れずにカラムスタンドをみましょうか、それが乾燥し実行することはできません（これはカラムの乾燥として、軽視することはできません純度を台無しにし、細胞の生存率の有意な損失につながることができます。）洗浄ステップ2では、（デとしてコラゲナーゼ+ DNaseを含む解離バッファーミックスでカラムを洗うステップ1.7）でスクライブが、これは死んでいるか死にかけている腫瘍細胞から粘着残骸を洗い流すために "厳しい"洗浄ステップとしての役割を果たします。 MACのバッファを使用して手順3を洗う行う。流れは、洗浄ステップ3の後に完全にクリアに見えない場合は、MACのバッファ（5洗浄の合計）と2つの追加洗浄ステップのために洗浄を続けています。大きな皮下腫瘍（例えば、B16メラノーマ）の場合は、最後の洗浄ステップの間に、列の先頭に手袋をはめた指先で穏やかな圧力をかける、これは細胞集団を精製し、クリーンに余分な残骸を解放します。この手順は、前立腺などの固形組織腫瘍のために必要されるのではなく、少なくとも5〜6回の合計を洗浄し、余分な洗浄ステップを使用しています。
- 磁気分離装置から列を削除し、適切なコレクションチューブの上に置きます。カラムにバッファーのピペット2ミリリットル。しっかりと列に付属してプランジャーを適用することにより、磁気標識細胞を収集します。
- することによって、細胞数をカウントし、選択した細胞集団の純度を確認サイトメトリー分析を流れる。 DC集団の識別のために、提案したマーカーは、B220およびCD11b、CD45、CD11cは、PDCA-1が含まれています。推奨されるマクロファージのマーカーはCD45、CD11bを、F4-80、Ly6Cが含まれています。
2。皮下B16メラノーマ腫瘍からの養子転送T細胞の分離
このプロトコルは、250ミリメートル2以下（腫瘍の二等分径を測定することにより、推定される）の腫瘍で最適に動作します。
- B16腫瘍細胞はC57BLに皮下注射した/ 6マウスと腫瘍の測定は、2日毎に8を記録した。 250ミリメートル2を測定する腫瘍を有するマウスは、CO 2窒息により安楽死されています。 、70％EtOHでリンスオートクレーブ手術器具を使用して、5％FBS、コラゲナーゼI型（200 U / ml）およびDNアーゼI（100μgを補充した5ミリリットル解離溶液（RPMI培地中で小さな（<3mm）の作品やインキュベートに腫瘍を切るML /））37℃で30分間、ピペッティング（1,000μを使用するためのlのピペットチップ）とのインキュベーションの間に10分おきにボルテックス。骨髄細胞は、その後分離される場合は、FBSおよびコラゲナーゼは、それぞれ、10％FBSおよびコラゲナーゼIV型（200 U / ml）でIを入力して5％を置き換えます。
- インキュベーション後、70μmのセルストレイナーを介して細胞懸濁液を通過し、10ミリリットルのMACバッファ（メーカーの指示に従って準備し、ミルテニーバイオテク）で2回洗浄する。オプション-非常に大きな腫瘍（> 300ミリメートル2）に、炎症性細胞は、密度勾配遠心分離（パーコールまたはフィコール）を使用して、事前に充実させることができます。
- 洗浄上清を吸引除去し、1μgのanti-CD16/32 antibody/10 8細胞（クローン2.4.G2培養上清の200μl）を追加し、室温で10分間インキュベートします。
- 洗濯せずに、そっと光から遮蔽氷上で30分間、チューブとインキュベートするフリックでよく混ぜ、10 8細胞あたり1μgの抗Thy1.1 PE抗体を追加します。
- バインドされていないPRIを削除するには、細胞を洗浄5分間400 xgで10ミリリットルのMACバッファと遠心を追加することにより、メアリー抗体。
- 上清を吸引除去し、製造元の指示に従って、10合計7細胞あたり20μlの抗-PE MicroBeadsを（ミルテニーバイオテク）を追加します。
- 優しくチューブ（ボルテックスしないでください）フリックでよく混ぜ、4℃でインキュベートする遮光、15分のために（氷を使用しないでください）。注意：ボルテックスは、ビーズの整合性を減少させることができます。
- 5分間400 xgでMACのバッファと遠心機の10ミリリットルを追加することによって、細胞を洗浄します。
- 500μlのMACのバッファに上清を、再懸濁し、細胞を吸引除去する。大きなサイズ（> 300ミリメートル2）の腫瘍では、1 mlのバッファーを使用しています。
- 磁界の区切りで1つのLC（大細胞）の列を配置します。腫瘍細胞懸濁液は、これらの列を介して最高の流れ。カラムを準備するために500μlのMACはバッファーでカラムを洗浄します。ほとんどの腫瘍はまた、LSおよびLDの列を通って流れますが、さらに消化と機械的なDが必要になります単一の細胞懸濁液の適切なレベルを達成するためにisruption。カラムを準備するために1ミリリットルのMACバッファーでカラムを洗浄します。
- カラムに細胞懸濁液を適用し、（列の実行が乾燥せずに ）完全に流れることができます。次に、500μlのMACのバッファーで洗浄し、3倍の洗浄を繰り返します。列のみ貯水池が空であるときに新しいバッファを追加しますが、列は流れずに放置しないでください。これは、目詰まりと減少した純度の原因になります。
- これは、大きな皮下腫瘍の重要なステップです：最後の洗浄ステップの後、手袋をはめた指の先端で、マグネット分離装置にしながら、まだ列の先頭に穏やかな圧力を適用します。これは、より純粋に濃縮された集団のための余分な破片を解放します。次に、500μlのMACのバッファーでカラム1より多くの時間を洗ってください。
- セパレーターから列を削除し、新しい15 mlコニカルチューブに入れ、カラムに2ミリリットルのMACバッファを追加します。磁気標識されたセルを洗い流すしっかりと列にプランジャーを押すことでLS。
- 5分間400 xgで溶出画分を遠心分離します。このステップで純度は通常75から80パーセントの間です。新しいMSカラムを使用して、ステップ1.10から1.12で説明したように> 90％の純度を達成するために、磁気分離手順を繰り返します。 MSカラムには、懸濁液がカラムを通過もっとゆっくり実行されるように、より小さく、よりコンパクトであるが、より高い数字と目的の細胞の純度が得られます。
- さらなる実験のために細胞数をカウントし、フローサイトメトリー分析により純度を確認してください。このようプロトコルに記載されているような養子転送T細胞の単離のために、識別のための対立遺伝子マーカーは、CD45とThy1.1（転送された細胞）及びThy1.2（ホストT細胞）が含まれています。
3。代表的な結果
特定の細胞集団（すなわち、マクロファージ、DC、T細胞など）の収率は腫瘍の大きさと管理した治療法によって異なります腫瘍成長の間にistered。未治療の14から16週齢のマウスTRAMPから前立腺は8×5×10 6 CD11cは90〜95％の純度または1×10 6 1.5×10 6 F4/80 + / CD11bをで+ / PDCA-1 +（DC）細胞との間が得られるはず+（マクロファージ）上記の図1に示すように、アイソレーション·プロトコルに従って組織300 mgを80から90パーセントの純度で。これらの各セルの数はわずかに腫瘍抗原特異的T細胞の養子移入によって増加します。貧しい純度は（列内の腫瘍の破片の保持につながることができる）カラムは乾燥させ、通常不十分な洗浄の結果である、または不十分なFcレセプターのブロッキング。
同様に、B16腫瘍から単離した全細胞はまた、組織の収穫とT細胞の養子免疫伝達（5×10 6の転送）DCワクチン（1×10 5の転送）の有無に関わらず時の腫瘍の大きさによって異なります。非常に少数の抗原-SPE抗原パルスDCワクチンはまた、T細胞の転送後に一日を与えられない限り、cific T細胞が腫瘍に浸潤する。 DCワクチンは小さな、明白な（<50 mm 2）の腫瘍を有するマウス、80から85パーセントの純度を有する約3×10 5 Thy1.1 + T細胞の収率に投与されている場合は、 "良いとみなされる図2Aに示すように、 "収穫。大きな腫瘍が収穫されている場合は、合計収率および純度が低下します。
マクロファージ（F4/80 + / CD11bを+）は、通常、B16腫瘍内の全細胞の小さな割合である。 図2Bは 、腫瘍から、CD11bを利用していることは、250 mm 2であることを示しています90〜95％の純度で約1×10 6マクロファージが得られます。 B16腫瘍におけるDCの人口は異質であること、さらに、 図2Bに示す。のCD11c + / PDCA-1 +（形質DC）およびCD11c：前立腺腫瘍、二つの集団とは異なり、+ / PDCA-1 - （従来のDC）は、B16メラノーマ腫瘍から得ることができます。推定2×6のPDCと4×10 6 CDCは、80〜90％の純度で250 mm 2の B16腫瘍から期待されています。減少純度は、通常、列からの腫瘍細胞をクリアしていない結果です。ステップ2.12カラムのふもとに続くメラノーマ細胞の小さな塊を除去する重要なステップです。この手順に従えば、より高い純度で洗浄手順と結果の有効性を向上させます。
図1樹状細胞（CD11cは+ / PDCA-1 +）とマクロファージ（F4/80 + / CD11bを+）は、TRAMP前立腺腫瘍から単離した。ドットプロットの値は、関心プリまたはポスト精製の細胞の割合を表しています。
図2（A）AdoptivエリーThy1.1 + / CD8 + T細胞を移し、（B）のCD11c含む骨髄細胞+ / PDCA-1 +形質樹状細胞は、CD11c + / PDCA-1 -従来の樹状細胞とF4/80 + / CD11bを+マクロファージは皮下から分離されたThy1.2 +マウス由来の B16メラノーマ腫瘍。ドットプロットの値は、関心プリまたはポスト精製の細胞の割合を表しています。
Discussion
このプロトコルは、腫瘍の大きさとソース（皮下、自発的な腫瘍、または同所性腫瘍）に基づいて、変更することができます。大きな腫瘍では、それが解離バッファーの量は、MACのバッファ、および洗浄の回数を増やすことをお勧めします。単離された細胞の誠実さは、それらが豊かにされて、そこからTMEに依存することができます。例えば、我々の経験では、自発的前立腺腫瘍から単離された細胞は、皮下B16メラノーマ腫瘍から単離された細胞よりも緩やか解離する必要があります。腫瘍の解剖時には、多くの脂肪、皮膚、または効果的な酵素の解離を防ぐことができ、他の破片のように排除します。それは完全に腫瘍塊を消化し、適切な抗体のラベリングを確保し、目詰まりから列を防ぐために、単一細胞懸濁液を得ることが重要です。骨髄細胞を分離するために、MACの分離バッファで推奨されているウシ胎児血清の量は、細胞の生存を改善するために2％から10％に増加した。また、ESSEです。非特異的抗体が結合し、カラムの目詰まりを防止するためのプロトコルを通して冷たいすべてのバッファおよび細胞を維持するntial。結論としては、抗原提示細胞と腫瘍抗原特異的細胞傷害性Tリンパ球の高濃縮集団を得るために、我々は、ミルテニーバイオ技術を利用した抗体ベースの分離手順を変更し、最適化されています。このプロトコルを利用して、両方の養子転送され、内因性の白血球集団は、細胞型特異的表面マーカーに対して向けられたABS樹脂を使用して濃縮されることがあります。説明する手順の一つの利点は、腫瘍の破片の削減広範かつ厳格な洗浄後のキャリーオーバーである。これは、腫瘍細胞によるカラムの目詰まりをなくすことができ、洗浄緩衝液のコラゲナーゼの使用だけでなく、カラムに圧力を加えた時点の識別が含まれています。特に機能解析に適した純度で、組織から免疫細胞の十分な数を取得し、困難な作業になることがあります。しかし、我々の経験では、プロトコルは、本明細書で最も一貫して、最大の純度で、セルの最大数を得られます。
Disclosures
著者らは、関連する開示はありません。
Acknowledgments
著者は、原稿とビデオのレビューのために博士スコットダラムに感謝します。この作品は、NIH、NCIの学内研究プログラムにより、一部でサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase I | GIBCO, by Life Technologies | 17100-017 | Use when selecting for T cells |
| Collagenase IV | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | Use for myeloid selection |
| DNase | Calbiochem | 260913 | |
| RPMI | GIBCO, by Life Technologies | 21870 | |
| Dulbecco’s PBS | Lonza Inc. | 17-5158 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza Inc. | 14-501F | |
| MACs Buffer | 2% FBS for T cells 10% FBS for myeloid cells |
||
| Thy1.1 PE | eBioscience | 551401 | |
| Anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-294 | |
| Anti-Pan DC microbeads | Miltenyi Biotec | 120-003-183 | |
| Anti-CD11b microbeads | Miltenyi Biotec | 120-000-300 | |
| LC column | Miltenyi Biotec | 130-042-202 | |
| MS column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 |
References
- Shurin, M. R. Intratumoral cytokines/chemokines/growth factors and tumor infiltrating dendritic cells: friends or enemies. Cancer Metastasis Rev. 25, 333-356 (2006).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Res. 66, 605-612 (2006).
- Anderson, M. J., Shafer-Weaver, K., Greenberg, N. M., Hurwitz, A. A. Tolerization of tumor-specific T cells despite efficient initial priming in a primary murine model of prostate cancer. J. Immunol. 178, 1268-1276 (2007).
- Ganss, R., Hanahan, D. Tumor microenvironment can restrict the effectiveness of activated antitumor lymphocytes. Cancer Res. 58, 4673-4681 (1998).
- Shafer-Weaver, K. A. Immunity to murine prostatic tumors: continuous provision of T-cell help prevents CD8 T-cell tolerance and activates tumor-infiltrating dendritic cells. Cancer Research. 69, 6256-6264 (2009).
- Watkins, S. K., Zhu, Z., Riboldi, E., Shafer-Weaver, K. A., Stagliano, K. E. R., Sklavos, M. M., Ambs, S., Yagita, H., Hurwitz, A. A. Foxo3a programs tumor associated dendritic cells to become tolerogenic in Human and Murine Prostate Cancer. Journal of Clinical Investigation. 121, (2011).
- Shafer-Weaver, K. A., Hurwitz, A. A. Tumor-Specific CD8+ T Cells Infiltrating Prostatic Tumors are Induced to Become Suppressor Cells. , (2009).
- Singh, V., Ji, Q., Feigenbaum, L., Leighty, R. M., Hurwitz, A. A. Melanoma progression despite infiltration by in vivo-primed TRP-2-specific T cells. J. Immunother. 32, 129-139 (2009).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409 (2007).
- Hurwitz, A. A., Foster, B. A., Allison, J. P., Greenberg, N. M., Kwon, E. D. The TRAMP mouse as a model for prostate cancer. Curr. Protoc. Immunol. Chapter 20, (2001).
