La visualización de la corteza organización y dinámica de los microorganismos, con total Microscopía de fluorescencia de reflexión interna

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Bioengineering

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Summary

Reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) microscopía es un enfoque poderoso para observar las estructuras cerca de la superficie celular en alto contraste y resolución temporal. Se demuestra cómo TIRF puede ser empleado para estudiar la dinámica de proteínas en la corteza de la pared celular-cerrados células bacterianas y fúngicas.

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Spira, F., Dominguez-Escobar, J., Müller, N., Wedlich-Söldner, R. Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (63), e3982, doi:10.3791/3982 (2012).

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Abstract

Microscopía TIRF se ha convertido en una tecnología de imagen de gran alcance para estudiar dinámica espacio-temporal de las moléculas fluorescentes in vitro y en células vivas 1. El fenómeno óptico de reflexión interna total ocurre cuando la luz pasa de un medio con alto índice de refracción en un medio con bajo índice de refracción en un ángulo mayor que un ángulo característica crítica (es decir, más cerca de ser paralelo con el límite). Aunque toda la luz se refleja de nuevo bajo tales condiciones, una onda evanescente se crea que se propaga a través ya lo largo del límite, que decae exponencialmente con la distancia, y sólo penetra áreas de la muestra que son 100-200 nm cerca de la interfaz 2. Además de proporcionar resolución axial superior, la excitación reducida de fuera de fluoróforos focales crea una señal de muy alta a ruido y minimiza los efectos perjudiciales de photobleaching 2,3. Al ser una técnica de campo amplio, TIRF también permite que la imagen más rápido de corriente alternaquisition que la mayoría de exploración basados ​​en configuraciones confocal.

A primera vista, la profundidad de penetración bajo TIRF parece ser incompatible con la imagen de las células bacterianas y de hongos, que a menudo rodeadas de paredes celulares gruesas. Por el contrario, hemos encontrado que las paredes celulares de levadura y células bacterianas en realidad mejorar la facilidad de uso de TIRF y aumentar la gama de estructuras observables 4-8. Muchos procesos celulares por lo tanto, se puede acceder directamente por la TIRF en pequeños microorganismos unicelulares, que a menudo ofrecen poderosas técnicas de manipulación genética. Esto nos permite llevar a cabo en los experimentos de bioquímica in vivo, donde la cinética de las interacciones de las proteínas y las actividades se puede evaluar directamente en las células vivas.

Se describe aquí los pasos individuales necesarios para obtener imágenes de alta calidad para TIRF Saccharomyces cerevisiae o células de Bacillus subtilis. Se señala varios problemas que pueden Affect TIRF visualización de sondas fluorescentes en las células e ilustrar el procedimiento con varios ejemplos de aplicación. Por último, se demuestra cómo las imágenes TIRF se puede mejorar usando técnicas de restauración de imagen establecidos.

Protocol

1. Preparación de la muestra

  1. Preparación de la cubierta se desliza
    Los cubreobjetos se debe limpiar de partículas de polvo como TIRF es sensible a señales de fondo derivados de la cubreobjetos (Fig. 1A, Película 1).
    1. El uso de pinzas cubreobjetos lugar en un soporte de cerámica con tapa.
    2. Llenar recipiente de vidrio con NaOH 1 M (se puede reutilizarse múltiples veces).
    3. Se incuba durante 2 horas con rotación lenta continua (agitador). El exceso de incubación (> 8 h) creará desliza la cubierta opaca.
    4. Lavar dos veces con agua destilada durante 5 min bajo rotación continua lenta.
    5. Tienda en el soporte de cerámica cubierta de etanol al 100%.
  2. Preparación de células de Bacillus subtilis
    1. Diluir a un OD 600 de 0,01 a 0,05 en 5 ml de medio de cultivo adecuadas y hacer crecer a la fase exponencial (OD 600 de desde 0.3 hasta 0.7).
    2. Preparar 1,25% de agarosa en agua o medio. Utilizar los medios sintéticos para reducir la fluorescencia de fondo. Disolver en polvo en un tubo de 1,5 ml de plástico a 95 ° C y almacenar en el bloque de calentamiento a 72 ° C.
    3. Añadir una pequeña gota de agarosa al medio de una diapositiva y prensa en una almohadilla plana con una segunda corredera. Con cuidado, diapositivas separadas después de al menos 2 minutos o antes de su uso.
    4. Girar hacia abajo de 500 células en l microcentrífuga a 12.000 rpm durante 1 min.
    5. Desechar el sobrenadante y resuspender el precipitado en medio de 50 l.
    6. Añadir 2-4 células l hasta el centro de la almohadilla de agarosa.
    7. Tome una hoja de cubierta limpia del recipiente lleno de etanol, con una pinza y seco con aire a presión y se coloca cuidadosamente en la muestra.
    8. Que las células de conformarse con al menos 2 minutos antes de la microscopía.
    9. Selle los bordes de cubreobjetos con VALAP (vaselina, lanolina y parafina, mezclado en el mismo peso en caliente, se aplican con una brocha pequeña o escupidoULA) para obtener imágenes de largo plazo.
  3. Preparación de células de Saccharomyces cerevisiae
    1. Diluir antes de la cultura y crecer en el medio adecuado por lo menos durante 5 horas a la fase exponencial (OD 600 0.2-0.8).
    2. Tome un cubreobjetos del contenedor con una pinza y se secan con aire a presión.
    3. Corre 5 Concanavalina l Una solución (ConA, 2 mg / ml en agua destilada) sobre cubreobjetos con una pipeta y secar con aire a presión. ConA se une a los carbohidratos de la pared celular de la levadura y células de levadura inmoviliza.
    4. Transferir 4,5 l de suspensión de células de levadura a un lado del cubreobjetos ConA-revestido. Coloque con cuidado el cubreobjetos sobre el portaobjetos del microscopio. Comience con un borde y dejó caer lentamente para evitar la formación de burbujas de aire.
    5. Que las células de conformarse con al menos 2 minutos antes de la microscopía.
    6. Selle los bordes de cubreobjetos con VALAP (véase más arriba) para obtener imágenes a largo plazo.
  1. Microscopio de configuración
    Hemos realizado todos los experimentos en una configuración de TIRF personalizada basada en un soporte mencionada anteriormente totalmente automatizado (Till Photonics) con una Olympus 100x 1,45 objetivo de NA. 75 láseres DPSS mW a 488 nm (coherente Sapphire) y 561 nm (Cobolt Jive) fueron utilizados como fuentes de luz. Los láseres se han seleccionado a través de un AOTF y dirigida a través de una fibra de banda ancha a la mencionada anteriormente. Un galvanómetro basada en dos ejes cabeza del escáner se utiliza para ajustar los ángulos de incidencia o de recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP) posición. Un galvanómetro adicional se utiliza para alternar entre epifluorescencia, FRAP y TIRF. Las imágenes se recogieron con una Andor IXON DU-897 cámara EMCCD y una lente de aumento 2x delante de la cámara. La adquisición fue controlada por la adquisición en vivo (Till Photonics) paquete de software.
    Los siguientes puntos deben ser considerados:
    1. De control programable de la fuente de iluminación (láser de lINE) y el ángulo TIRF es esencial para obtener resultados reproducibles y especialmente para multicolor TIRF, donde los ángulos de incidencia que haya que ajustar para cada longitud de onda de excitación para asegurar la penetración igual de ondas evanescentes. En nuestra configuración del ángulo TIRF se puede ajustar de forma instantánea a través de dos galvanómetros, que son controladas directamente desde el paquete de adquisición de software en vivo.
    2. Nuestra configuración personalizada, además, permite una rápida conmutación entre epifluorescencia, TIRF y FRAP a través de un galvanómetro en tercer lugar, permitiendo que la simple medición de la cinética de la localización de los objetos trazados en TIRF.
    3. Objetivo de tipo TIRF requiere altas aperturas numéricas de NA> 1,4. Se utilizó una Olympus 100 veces NA 1.45 objetivo.
    4. EMMCD cámaras funcionan muy bien con TIRF debido a su elevada relación señal-ruido. Para permitir la formación de imágenes con una sensibilidad óptima, se utilizó un nuevo sistema de iluminación de píxeles 512x512 cámara EMCCD con un tamaño de píxel de 16 micras. Para mantener la máxima resolución que puso un magn 2xficación lente delante de la cámara.
    5. Como TIRF es una técnica de campo amplio, la intensidad de los rayos láser hacia fuera. Láseres sólidos tanto, a menudo mejorar la imagen. Se utilizó 75 mW diodo bombeado de estado sólido (DPSS) láseres a 488 nm y 561 nm.
    6. Para mantener las células en condiciones óptimas de crecimiento durante la exploración, están permitidos todos los controles ambientales. Se utilizó una cámara de costumbre hizo calentamiento (Fig. 1B) para estudiar mutantes de levadura sensibles a la temperatura. Para el intercambio de mediano durante la adquisición de que sea utilizado cámaras de flujo simples o con fondo de cristal placas de cultivo que se puede acceder fácilmente desde arriba en el microscopio invertido.
  2. Ajuste de los parámetros
    1. Identificar la posición de las células por medio de la iluminación de campo claro. LEDs rojos son especialmente buenos, ya que no inducen daño de la foto importante.
    2. Cambie a la iluminación láser y seleccione los láseres y combinaciones de filtros apropiados para excitar los fluoróforos deelección. Asegúrese de que el ángulo TIRF es subcrítico, o usted no será capaz de detectar cualquier señal de derivados de proteínas de fusión GFP. En caso de duda ajustar el ángulo TIRF a 0 º para obtener un haz de láser perpendicular. Encuentra la sección superior de la celda (lado de la célula hacia el cubreobjetos). Modificar el ángulo de incidencia del haz de láser hasta que las señales desaparecen luego, lentamente, aumentar el ángulo hasta el punto en el que vuelve a aparecer la fluorescencia en la superficie celular (Vídeo 2). Ajuste z enfocar de nuevo a la posición óptima en la superficie. Aceptables ángulos TIRF crear sin halo borrosa en el borde de la célula (Fig. 1C). Si la foto significativa de blanqueo se produce durante la instalación, guarde el ángulo TIRF y se mueven a una posición de fase de crudo antes de iniciar la adquisición.
    3. Ajuste la intensidad de láser y la ganancia de la cámara para maximizar el rango dinámico (elevada relación señal a ruido sin saturar píxeles). Normalmente las cámaras EMCCD son óptimas para detectar señales muy bajas en la señal de alto a la rata de ruidoios. Para más fuertes señales regulares cámaras CCD producen menos ruido y ofrecen un rango dinámico más amplio.
    4. Microscopía TIRF es muy sensible a pequeñas diferencias de altura del cubreobjetos, lo que resulta en células sólo unos pocos, que pueden obtener imágenes al mismo tiempo (Fig. 1D). Para las células pequeñas de la región de adquisición (región de interés, ROI) puede por lo tanto, a menudo se reduce a una subregión que contiene el objeto de elección. Esto también reduce el tiempo necesario para transferir datos desde el chip a la unidad de disco duro, a menudo el paso limitante de la velocidad a velocidades de cuadro altas.
    5. Para los experimentos de doble color TIRF asegurarse de reducir al mínimo sangrado a través de fluoróforos. Para RFP / GFP pares usar filtros separados de emisión de la RFP es débilmente excitado por la luz de 488 nm (Fig. 2A). La mayoría de los filtros no están perfectamente alineadas entre sí. Filtro de desplazamiento pueden ser corregidos mediante el uso de perlas fluorescentes mezcladas con células. Para alcanzar la profundidad de penetración comparables, ajustar los ángulos TIRF separado for cada línea láser. Un flujo de trabajo típico se ilustra en la figura. 2B.
    6. Un parámetro crítico que influye en la calidad de imagen es la alineación por láser y un objetivo limpio. Para alinear el láser, la atención por primera vez en el z-posición que se utiliza para el TIRF. A continuación, retire la muestra y limpiar el objetivo de todo el aceite (aceite residual dará lugar a la difracción de la luz láser y motas en el perfil del haz). Proyecto del láser en el techo en el modo de TIRF y calibrar la posición de 0 ° de tal manera que el láser está en una línea recta con el objetivo (uso de punto de referencia, siempre gafas de seguridad láser y evitar todas las reflexiones en la trayectoria del haz). Enfocar el punto láser a un tamaño mínimo. Nuestra instalación cuenta con una lente móvil situada entre galvos y un microscopio para facilitar la calibración rápida. Después de un ajuste óptimo, el perfil de láser debe formar una bien definida mancha con forma aproximadamente redonda. Realice la calibración antes de cada sesión para obtener una calidad de imagen óptima.

3. Los resultados representativos

  1. Distribución de homólogos de actina y enzimas de la pared celular en Bacillus subtilis. Hemos fotografiado células que expresan GFP fusiones de la MBL actina homólogo o la PbpH transpeptidasa por TIRF y epifluorescencia ordinario. La profundidad de penetración en TIRF es claramente reducida y limitada a la superficie enfrentada al cubreobjetos (Fig. 3A, B). El PbpH transpeptidasa débilmente expresado se localiza en parches corticales que son poco visibles por epifluorescencia, pero pueden distinguirse claramente por la TIRF (Fig. 3B). La penetración de la reducción se puede observar mejor la señal PbpHGFP en los tabiques, que aparecen como líneas de epifluorescencia, pero como puntos en TIRF (Fig. 3B, flecha).
  2. Dominios de proteína en la membrana plasmática de la levadura. Ejemplos de como la red patrones formados por proteínas de la membrana de plasma en la levadura ya se da en la figura. 1C y2. Además de la mejora de contraste en TIRF que permite distinguir claramente de estos patrones, como la red, las señales débiles a veces puede ser detectado exclusivamente por microscopía TIRF. Como ejemplo, hemos fotografiado una fusión GFP del Bit61 componente TORC2 complejo de Saccharomyces cerevisiae. Esta proteína se expresa débilmente y forma pequeños parches corticales con copias de proteínas sólo unos pocos por el parche 9. En epifluorescencia sólo pocos parches son visibles por encima de la sólida formación, mientras que las manchas se pueden obtener imágenes con muy buena señal a ruido en la TIRF (Fig. 3C). Por lo tanto TIRF está particularmente bien adaptado para estudiar las estructuras débilmente fluorescentes y proteínas en la superficie celular. La resolución axial de alta proporcionada por TIRF ya se reduce la fluorescencia de fondo. Mejoras adicionales de contraste de la imagen puede obtenerse a través de varios pasos de procesamiento de imágenes. Una técnica estándar de simple es la igualación de fondo local, donde se resta una imagen borrosa de laoriginal. Desenfoque puede realizarse con una variedad de filtros de paso bajo incluyendo filtros mediana o gaussiano (Fig. 3D). Local sustracción de fondo elimina el ruido y agudiza las estructuras de alta intensidad. Sin embargo, esto viene a menudo a costa de una pérdida de estructuras finas y amplificación exagerada de las regiones de alta intensidad (Fig. 3D, flecha). Un procedimiento superior es deconvolución 2D, que puede realizarse con paquetes de software libre o disponibles comercialmente, tales como ImageJ, Matlab o Huygens (Scientific Volume Imaging BV). Imágenes TIRF proporcionan una resolución axial de muy buena y por lo tanto una función de punto de difusión de cerca de dos dimensiones (PSF). Hemos determinado experimentalmente el PSF en la adquisición de imágenes de 40 nm perlas fluorescentes con los mismos parámetros que se utilizaron para la proyección de imagen real (objetiva, la cámara, la excitación y la longitud de onda de emisión) El PSF experimental se utilizó para la deconvolución con un algoritmo de máxima verosimilitud clásica en Huygens. TiempoPelículas con lapso de GFPRas2 o de Fet3GFP y Pma1RFP Películas de 3 y 4) muestran el aumento de contraste después de deconvolución. En las imágenes en color dobles es crítico para maximizar el contraste, para ser capaz de cuantificar valores colocalización (película 4).
  3. Análisis de la transformación de las proteínas en la corteza celular. TIRF y FRAP ofrecen una combinación poderosa para el estudio de la dinámica de las proteínas corticales. Sin embargo, para permitir el uso eficiente de estas técnicas, un control rápido de los ángulos de láser y las posiciones se requiere. En TIRF, una técnica de campo ancho, el láser tiene que ser centrado en el plano focal posterior y tiene que seguir un ángulo de incidencia superficial para lograr la reflexión deseada. En contraste, FRAP requiere que el láser se enfoca directamente sobre la muestra y se coloca con precisión espacial alta para permitir el blanqueo de las estructuras definidas o regiones. La configuración de hasta fotónica hemos utilizado en nuestros experimentos ofrece un control rápido e intuitivo sobre ªESE parámetros. Dos controlados galvanómetro espejos se utilizan para ajustar la posición del FRAP en x, y o para ajustar el ángulo de incidencia en TIRF. Un tercer espejo se utiliza para cambiar entre las trayectorias de rayos separados para TIRF y FRAP iluminación (el láser se amplía por las lentes adicionales en el camino TIRF). Todos los ajustes son controlados por el LA (adquisición vivo) de software y las calibraciones se puede realizar rápidamente para cada experimento para lograr las condiciones óptimas. Este software también permite la definición de las posiciones de lejía durante la adquisición de la imagen, que es esencial para los experimentos del FRAP en las estructuras móviles.
    Con esta función se puede excluir treadmilling de filamentos Mbl como fuente para la movilidad observada de MBL que contienen parches (Fig. 3E). Esta observación motivó la búsqueda de mecanismos alternativos de movilidad, y finalmente resultó en la identificación de un tipo completamente inesperado de la motilidad, donde los complejos de proteínas intracelulares (incluyendo MBL) se mueven a través de la actividadesdad de la pared celular sintetizar enzimas que residen en el exterior de la celda 4. De manera similar, hemos sido capaces de observar los reordenamientos lentas de proteínas de levadura membrana plasmática, que distribuyen en la red como dominios que cubren la superficie de célula entera (Fig. 3F).
    Estos ejemplos ilustran cómo la dinámica y patrón de las proteínas de la corteza se puede evaluar directamente mediante la combinación de TIRF y las técnicas del FRAP.

4. Los resultados representativos

Figura 1
Figura 1. Ajuste de los parámetros. A. Co Dirty vs limpiarverslip. La señal de fondo derivadas de polvo en el cubreobjetos interferir con un potencial de GFP / RFP de la señal, cubreobjetos limpio tiene menos fondo. B. personalizados hechos regulador de calefacción eléctrico que muestra la temperatura de ajuste (A), titular de la temperatura en la sonda (b) y de la muestra (c) . C. Pma1GFP proteína de levadura con imágenes de los ángulos de incidencia de la disminución (de arriba a la izquierda a la inferior derecha). Las imágenes muestran una pérdida repentina de la señal en el ángulo crítico y disminución progresiva de la información estructural y la relación señal-ruido. Campo D. desigual de vista. Una suspensión densa de perlas fluorescentes se forma la imagen, que muestra que sólo una parte del campo de visión está en el foco. Las barras de escala en A, B: 2 m, en C: 10 m.

Figura 2
Figura 2. Imágenes en color doble. A. sangrar a través de la Pil1RFP. Pil1RFP está emocionadocon 488 nm y un láser nm 561 y la fluorescencia se registró con un filtro de banda de paso doble. Señal de Pil1RFP es débilmente visible en el canal de las buenas prácticas agrarias. Barra de nivel 2 micras pasos B. típicos para evitar sangrado a través de imágenes en color doble. Después de las imágenes de las células con diferentes conjuntos de filtros, se deconvolved y alineados (con perlas fluorescentes) antes de que se están combinando para su análisis.

Figura 3
Figura 3. Resultados representativos. A. Comparación de la distribución GFPMbl en B. subtilis usando TIRF o regular microscopía de epifluorescencia (PAI). Azul: los límites de la célula de la imagen de campo claro. Imágenes representan proyecciones medias de una serie de tiempo para indicar el área cubierta por parches MreB móviles monitoreados con diferentes modos de imagen. B. Mejora de la resolución axial y el contraste de la imagen TIRFs cuenta la PbpHGFP transpeptidasa en B. subtilis Las flechas indican la tinción del tabique que aparece como un anillo de epifluorescencia y de parches en TIRF. Tiempo de exposición:. 100 ms C. Comparación entre las de epifluorescencia y la iluminación de la TIRF Bit61 componente complejo en términos de referencia S cerevisiae.. Bit61 está muy débilmente expresado 9. Tiempo de exposición: 250 ms D. Comparación de los diferentes métodos de procesamiento de imágenes.. Serie que muestra la imagen TIRF prima de Pma1GFP, la sustracción de Gauss o medianas de imágenes borrosas, así como deconvolución utilizando el algoritmo de máxima verosimilitud de la Huygens. E. TIRF-FRAP de un solo parche GFPMbl (por encima de un asterisco) que se mueve a través de una B. subtilis celulares. El quimógrafo del parche no la recuperación y el perfil de intensidad a lo largo del quimógrafo (línea punteada) a descartar treadmilling como fuente de movimiento. F. TIRF-FRAP de una célula de levadura que expresa Pma1GFP. Nótese el cierre de la difusivobrecha en el patrón de tinción cortical. Las barras de escala: 2 m. El tiempo en segundos.

Película 1. Película que muestra B. subtilis células expresando una proteína de fusión RFP en un cubreobjetos sucio. Tenga en cuenta que la señal de solicitud de propuestas apenas se distingue del ruido de fondo. El tiempo de ciclo de 100 ms. Haga clic aquí para ver la película .

Película 2. Película de Pma1GFP con distintos ángulos de incidencia. Angle se altera de subcrítico al ángulo crítico, hasta que la señal se pierde. Nota, en subcrítico señal interna ángulo es visible, causando imágenes ruidosas hasta que al ángulo crítico sólo la proteína en el PM es visible. Tiempo de ciclo de 200 ms. Barra de escala: 2 m. Haga clic aquí para ver la película .

Película 3. Película de la levadura GFPRas2, mostrando alternaIng. TIRF imágenes RAW y deconvolved. GFPRas2 es una proteína de movimiento rápido (T1 / 2 de los datos no publicados 2s), tiempos rápidos de adquisición son importantes para resolver el comportamiento dinámico. El tiempo de ciclo de 150 ms. Barra de escala: 2 m. Haga clic aquí para ver la película .

Movie 4. Película en color doble de la levadura y proteínas Fet3GFP Pma1RFP. En primer lugar 10 cuadros representan imágenes RAW y últimos fotogramas se deconvolved. Esta película muestra la importancia del procesamiento de imágenes para el análisis de colocalización. Las borrosas imágenes RAW se agudizó, por lo que un análisis sea posible. Ciclo de tiempo de 5 s. Barra de escala: 2 m. Haga clic aquí para ver la película .

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Discussion

Microscopía TIRF es la técnica de elección para las proteínas de la imagen periféricos. La profundidad de penetración baja del campo evanescente minimiza de fuera de foco de luz, lo que conduce a una señal de muy buena a ruido y permite la adquisición de datos con altas velocidades de fotogramas o imágenes de las proteínas expresadas muy débilmente. La combinación de alto contraste y alta velocidad de fotogramas hace de la microscopía TIRF una herramienta perfecta para imagen dinámica espacio-temporal de las proteínas cortical localizadas. Es interesante que la gruesa pared celular que rodea muchos microorganismos no obstaculizar la imagen de las proteínas periféricas por TIRF. De hecho, la generación real de la evanescente muy probablemente se produce en la interfase entre la pared celular y la membrana plasmática 5,10. La reflexión de la luz que sale de la célula podría incluso conducir a la propagación de luz a lo largo de la pared celular, lo que podría explicar la gran superficie que podría ser reflejado en células de levadura 8.

Para obtener una calidad óptima de la TIRF imlas edades es crucial tener un sistema de microscopía bien calibrado. El láser debe ser enfocados y alineados antes de cada sesión de imágenes. Los cubreobjetos se debe limpiar (fig. 1A) y las células tienen que ser debidamente inmovilizado. Para dobles sangrado de color de imágenes espectrales por medio tiene que ser tomado en cuenta o se elimina mediante el uso de filtros de conjuntos de filtros de rango de emisión por separado. Esto, obviamente, vendrá en el precio de los tiempos de adquisición más lentas debido al cambio de filtro mecánico. Fast ruedas de filtros o fuentes de iluminación basadas en galvanómetro puede evitar este retraso, si es necesario. Alternativamente, el fluoróforo crítico (SDP) se puede utilizar en la proteína expresada más débil en un par, minimizando el nivel de interferencia de la señal.

A pesar del alto contraste, las imágenes tomadas con un microscopio TIRF contienen ruido significativo. Para quitar este ruido y aumentar aún más las imágenes de contraste de imagen se pueden procesar con diversas medidas de filtrado. El método con los mejores resultados en nuestrala experiencia es deconvolución 2D. Esto requiere la medición experimental de la PSF para cada muestra y la condición microscopio. Sin embargo, esto puede realizarse con bastante facilidad y rapidez utilizando perlas fluorescentes mezclados en la muestra respectiva. Para los experimentos de dos colores estas perlas adicionalmente se puede utilizar para la alineación del canal.

Hemos demostrado las ventajas de utilizar microscopía TIRF para obtener imágenes de las proteínas corticales en microorganismos. La combinación de TIRF y procesamiento de imágenes permite la adquisición de imágenes con velocidades de fotogramas alta (<50 ms) y el contraste, y también permite la visualización de las proteínas débilmente expresado como Bit61. Una ventaja adicional de la realización de imágenes en TIRF microorganismo es que la presión de turgencia en estas células conduce a membranas plasmáticas planas, y minimiza los efectos topológicos a señales TIRF.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por la Sociedad Max Planck.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Orbital Shaker UniEquip UNITWIST 3-D ROCKER SHAKER
TIRF microscope Customized setup
Glass container Vitlab 340-232880353
Ceramic staining rack Thomas Scientific 8542E40
Concanavalin A Sigma-Aldrich L7647
Coverslips #1(18 x 18 mm) Menzel-Glaser BB018018A1
Microscope Slides Menzel-Glaser AA00000102E
Immersion Oil Carl Zeiss, Inc. Immersol 518F
Agarose Invitrogen 16500-500
FluoSpheres Invitrogen F8795

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References

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