توجه التمييز بين الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة نحو الخلايا اللمفية تي

JoVE Journal
Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

جيل من الخلايا الليمفاوية T من الخلايا المحفزة التي يسببها (آي بي إس) الجذعية يعطي نهجا بديلا من استخدام الخلايا الجذعية الجنينية لعلاج مناعي خلية القاعدة T. أسلوب يدل على أن إما عن طريق استخدام

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (63), e3986, doi:10.3791/3986 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

بالتبني نقل الخلية (ACT) من الخلايا الليمفاوية T مستضد CD8 + محددة السامة للخلايا (CTLs) هو علاج واعد لمجموعة متنوعة من الأورام الخبيثة 1. يمكن التعرف CTLs الخلايا الخبيثة من خلال التفاعل مستضدات الأورام مع مستقبلات الخلايا T (TCR)، وإطلاق سراح cytotoxins وكذلك السيتوكينات لقتل الخلايا الخبيثة. من المعروف أن أقل متباينة، ووسط الذاكرة تشبه (وهو ما يسمى شديدة التفاعل) CTLs هي الأمثل لسكان ACT المستندة إلى العلاج المناعي، وذلك لأن هذه CTLs له قدرة عالية التكاثري، هي أقل عرضة للموت الخلايا المبرمج من الخلايا أكثر تمايزا ولها أعلى قدرة على الاستجابة لالسيتوكينات استتبابي 2-7. ولكن نظرا لصعوبة الحصول على عدد كبير من المرضى من هذه CTLs، هناك حاجة ملحة لإيجاد نهج جديد لتوليد شديدة التفاعل حج محددة CTLs لعلاجات ناجحة ACT القائم.

TCR تنبيغ من الجذعية الذاتية المتجددةخلايا المناعة لإعادة لديها امكانات علاجية لعلاج أمراض 8-10. ومع ذلك، فإن النهج للحصول على خلايا جذعية جنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) من المرضى غير ممكن. على الرغم من استخدام الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) لأغراض علاجية تطبق على نطاق واسع في العيادة 11-13، خفضت HSCs التمايز والقدرات التكاثري، وHSCs يصعب التوسع في زراعة الخلايا في المختبر في 14-16. تكنولوجيا خلايا الجذع الأخيرة ووضع نظام في المختبر لتوصيل الجينات هي قادرة على توليد خلايا الجذع من المرضى دون أي نهج الجراحية. وبالإضافة إلى ذلك، مثل المجالس الاقتصادية والاجتماعية، وخلايا الجذع لديها القدرة التكاثري إلى أجل غير مسمى في المختبر، ولقد تبين أن تفرق في الخلايا المكونة للدم. وهكذا، خلايا الجذع لديك إمكانات أكبر لاستخدامها في العلاج المناعي القائم على ACT مقارنة المجالس الاقتصادية والاجتماعية أو HSCs.

هنا، نقدم طرق لتوليد اللمف Tcytes من خلايا الجذع في المختبر، والبرمجة في الجسم الحي من المستضد محددة CTLs من خلايا الجذع لتعزيز مراقبة السرطان المناعي. التحفيز في المختبر مع يجند الشق يدفع تمايز الخلايا T من خلايا الجذع، والنتائج TCR تنبيغ الجينات في خلايا الجذع في التفريق مستضد محددة الخلايا T في الجسم الحي، والذي يمنع نمو الأورام. وهكذا، علينا أن نبرهن مستضد محددة الخلايا T تمايز الخلايا من IPS. دراساتنا توفير نهج أكثر كفاءة يحتمل لتوليد مستضد محددة CTLs لACT العلاجات المستندة وتيسير وضع استراتيجيات علاجية للأمراض.

Protocol

1. خلية ثقافة

  1. إعداد الخلايا المغذية المشع SNL76 / 7 (irSNL76 / 7) للثقافة.
    يتم الاحتفاظ عادة SNL76 / 7 الخلايا في مصل بقري جنيني 10٪ (FBS) في Dulbecco معدلة النسر متوسطة (DMEM) وسائل الاعلام.
    1. ستكون مغلفة طبق الثقافة أو قارورة مع حل الجيلاتين 0.1٪ في 37 ° C؛ الحاضنة لمدة 30 دقيقة قبل أن يتعافى SNL76 / 7 الخلايا من النيتروجين السائل.
    2. عندما SNL76 / 7 خلايا تصل confluency، سيتم إيقاف الخلايا trypsinized، بالطرد المركزي في 400 غ لمدة 5 دقائق ومعلق في وسائل الإعلام الجديدة.
    3. سيشرق معلق SNL76 / 7 الخلايا في irradiator 60 شركة مع جرعة من أصل 5000 راد.
      يمكن أن نهج بديل، يمكن الاستعاضة SNL76 / 7 خلايا الجنينية من الخلايا الليفية الماوس (MEF) وميتوميسين تعطيل الاستبدال التشعيع.
    4. بعد التشعيع، سيتم طرد الخلايا في 400 غ لمدة 5 دقائق ومعلق في سلفوكسيد ثنائي ميثيل 10٪ (DMSO) FBS العازلة تجميد، قسامة فيcryovials والحفاظ عليها في النيتروجين السائل للاستخدام في المستقبل.
  2. إعداد OP9-DL1 الخلايا في التمايز عن المختبر.
    سيتم OP9-DL1 الخلايا بشكل عام المحافظة على 20٪ في المتوسط ​​α الحد الأدنى الضروري FBS (α-MEM) وسائل الاعلام. وعندما تصل إلى خلايا confluency منقسمة على نفسها في التخفيف 01:05.
  3. إعداد الخلايا التوتة E.G7.
    سيتم E.G7 خلايا التوتة بشكل عام المحافظة على 10٪ FBS في روزويل بارك التذكاري المتوسطة معهد (RPMI) -1640 وسائل الإعلام. عندما تصل إلى confluency، سيتم تقسيم الخلايا في التخفيف 1:10.
  4. الصيانة العامة للبرامج المتكاملة وTCR-transduced خلايا الجذع.
    1. ستكون مغلفة طبق الثقافة مع حل الجيلاتين 0.1٪ في C ° 37 لمدة 30 دقيقة قبل البذر الخلايا المغذية irSNL76 / 7 قبل يوم واحد من الانتعاش أو انقسام خلايا الجذع.
    2. لانقسام خلايا الجذع، سيتم trypsinized الخلايا خارج، بالطرد المركزي في 400 غ لمدة 5 دقائق ومعلق في DMEM FBS 15٪ سائل الإعلام.
    3. Trypsinized الجذعسيتم حضنت الخلايا على طبق ثقافة جديدة لمدة 30 دقيقة في 37 ° C حاضنة قبل البذر على طبق خلية جديدة irSNL76 / 7 المغذية لاستبعاد الخلايا precoated متباينة، والخلايا المغذية بقايا.
    4. بعد الحضانة، سيتم المصنف 4 × 10 6 خلايا في طبق الثقافة 100mm.

2. في المختبر البرمجة

  1. في نظام coculture المختبر.
    1. في يوم 0، سيتم المصنف 4 5x10 الخلايا المحفزة على طبق الثقافة 100mm تحتوي على أحادي الطبقة متموجة الخلية OP9-DL1 في وسائل الإعلام 20٪ α-MEM FBS.
    2. في يوم 3، سيتم تغيير ثقافة الإعلام بأخرى جديدة.
      1. في يوم 5، سيتم trypsinized خلايا بالطرد المركزي في الخروج و400 غ لمدة 5 دقائق قبل تفرخ على طبق الثقافة 100mm الطازجة لمدة 30 دقيقة في 37 ° C الحاضنة.
      2. وسيتم جمع الخلايا العائمة وعدها، سيتم نقل 5x10 5 خلايا إلى ثقافة جديدةطبق يحتوي على خلية متموجة أحادي الطبقة OP9-DL1 في وسائل الإعلام 20٪ α-MEM FBS. خلوى mFlt-3L (تركيز النهائي: 5 نانوغرام / مل) ستضاف في الثقافة.
      1. في يوم 8، والخلايا المرفقة فضفاضة يمكن ماصة بلطف إلى أسفل.
      2. غسل طبقة التغذية OP9-DL1 مع 10 مل مرة واحدة أكثر PBS للحصول على الانتعاش القصوى لخلايا الجذع متباينة جزئيا.
      3. بعد حصاد الخلايا من coculture، سيتم طرد الخلايا في 400 غ لمدة 5 دقائق ومعلق في 20٪ FBS-α MEM وسائل الإعلام تستكمل مع 7-MIL-3L mFlt (5 نانوغرام / مل) و (1 نانوغرام / مل).
      4. وسيتم نقل الخلايا إلى لوحة الثقافة جيدا 6 المغلفة مع الخلايا OP9-DL1 متموجة. وعادة ما يتم نقل خلايا الجذع تعافى من 100 مم طبق الثقافة في واحدة جيدا من لوحة 6 أيضا.
      1. من يوم 10، سيتم تغيير الثقافة في وسائل الإعلام كل يوم (20٪ FBS-α MEM وسائل الإعلام supplementeد مع mFlt-3L (5 نانوغرام / مل) وMIL-7 (1 نانوغرام / مل)).
      2. لوحات الثقافة المغلفة مع المغذية سيتم تغيير OP9-DL1 الخلايا في 4-6 أيام اعتمادا على نمو الخلايا المغذية.
  2. في نضوج خلايا الجذع من الجسم الحي متباينة جزئيا.
    1. في يوم 22 من coculture، سيتم trypsinized خلايا الجذع باتجاه آخر، بالطرد المركزي في 400 غ لمدة 5 دقائق وحضنت على طبق ثقافة جديدة في C ° 37 لمدة 30 دقيقة.
    2. وسيتم جمع الخلايا العائمة، مرت الى 70 ميكرومتر مصفاة النايلون لاستبعاد كتل الخلايا التي قد تسبب الانسداد الرئوي على الفئران وغسلها ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني الباردة.
    3. سيتم معلق الخلايا في برنامج تلفزيوني مع تركيز 1.5x10 7 خلايا / مل.
    4. وسيتم الحفاظ على الجليد الخلايا قبل الحقن.
    5. قبل الحقن عن طريق الوريد الرابع الذيل، سيتم وضع الفئران تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء لتمدد الأوردة من الذيل.
    6. بعد د الوريدسيتم ilatation، 200 ميكرولتر تعليق الخلية أو الخلايا 3x10 6 adoptively نقل إلى الأسبوع 4 قديم B6.129S7-Rag1 tm1Mom / J-الماوس من خلال الوريد ذيله. ويسمح لثلاثة أسابيع في نضوج خلايا الجذع من الجسم الحي متباينة جزئيا.
  3. التقييم.
    1. التغييرات المورفولوجية للخلايا متباينة، ومعدلات الاسترداد الخلية. الشكل 1.
      1. في أيام مختلفة من coculture مع OP9-DL1 الخلايا، سيتم اتخاذ الصور الحية تحت المجهر الخلايا التقليدية.
      2. وسيتم احتساب معدلات الاسترداد الخلية استنادا إلى عدد من الخلايا التي تحصد من الثقافة.
    2. تحليل تدفق cytometric من التغييرات علامة السطح. 2A الشكل.
      1. في أيام مختلفة من coculture، ستتم إزالة الخلايا من الثقافة عن طريق غسلها وtrypsinization مع PBS الباردة قبل الانتقال إلى تلطيخ سطح الخلية.
      2. قبل تلطيخ الطرافةح مختلف الأجسام المضادة مترافق ملون تألقي، سيتم منع الخلايا بها نادي مانع 24G2 في C ° 4 لمدة 20 دقيقة.
      3. بعد 20 دقيقة تلطيخ في 4 درجات مئوية، وسيتم غسلها ثلاث مرات في خلايا PBS الباردة قبل الفحص تدفق cytometric.
    3. تفعيل الخلايا في المختبر الجذع متباينة الشكل 2B.
      1. قبل يوم واحد مقايسة التنشيط، precoat لوحة 24 جيد مع المضادة للCD3 (تركيز النهائي: 4 ميكروغرام / مل، في PBS) في أكثر من 4 درجة مئوية ليلا.
      2. في يوم 22 من coculture، وخلايا الجذع خلايا T أن تحصد المستمدة من الثقافة وغسلها مع برنامج تلفزيوني الباردة قبل حفز مع الأجسام المضادة المقاومة للCD28 وحة المغلفة المضادة للCD3 وقابل للذوبان (تركيز النهائي: 4 ميكروغرام / مل).
      3. وسيتم تنفيذ حضانة في 37 ° C، 5٪ CO 2 حاضنة لمدة 40 ساعة ثم سيتم إضافة Befeldin A في الثقافة لمدة 4 ساعات.
      4. في نهاية coculture، وسوف تكون خلايا هارالمكتسبة، وغسلها وسدت مانع التيسير كما هو موضح أعلاه. سيتم ملطخة الخلايا منعت لعلامات السطحية سلسلة Vβ CD8 وTCR باستخدام الأجسام المضادة مترافق ملون تألقي.
      5. بعد تلطيخ سطح الخلية، وسوف تكون ثابتة الخلايا باستخدام الفورمالدهيد 4٪ وpermeabilized باستخدام عدة Biolegend في Permeabilizing.
      6. بعد permeabilization، سيتم ملطخة الجزيئات داخل الخلايا مثل IL-2-γ IFN وباستخدام الأجسام المضادة مترافق ملون تألقي.
      7. قبل الفحص النهائي تدفق cytometric، سيتم غسلها ثلاث مرات في خلايا PBS الباردة لاستبعاد الأجسام المضادة المفرطة.
    4. النضج في خرقة / - الفئران.
      1. بعد ثلاثة أسابيع من التنمية في الجسم الحي، خرقة / - سوف الطحال، وسيتم التضحية الفئران والغدد الليمفاوية يمكن إزالتها من الفئران.
      2. وسيتم تجهيز الخلايا واحد من خلال عطل ميكانيكي. سيتم هي lysed خلايا الدم الحمراء باستخدام العازلة تحلل وACKوسيتم جمع وغسلها مرتين mononucleocytes في برنامج تلفزيوني الباردة.
      3. بعد غسل، سيتم منع الخلايا مع نادي مانع 24G2 في C ° 4 لمدة 20 دقيقة وعند نهاية حظر، سيتم ملطخة الخلايا مع ملون تألقي مترافق مختلفة لمكافحة CD3 CD4 المضادة لل، ومعاداة CD8 والأجسام المضادة المقاومة للTCRβ في 4 ° C لمدة 20 دقيقة.
      4. في نهاية تلطيخ، سيتم غسلها ثلاث مرات في خلايا PBS الباردة قبل الفحص تدفق cytometric.

3. في الجسم الحي برمجة

  1. بناء جيل من فيروسات.
    1. هي التي شيدت MSCV-IRES-DsRED (MIDR) متجه يعتمد على MSCV-IRES-GFP ناقلات عن طريق استبدال الجين GFP مع الجين DsRED.
    2. وsubcloned OT-I مستقبلات الخلايا T الجينات في ناقلات MIDR لجعل OT-I/MiDR بناء.
  2. تنبيغ فيروسات والفرز الخلية.
    1. بلات-E التعبئة والتغليف الخلايا عاستخدام البريد لتوليد pseudovirus التي سيتم استخدامها لتنبيغ التالية.
      1. والمصنف 3x10 6 خلايا بلات-E على طبق مم الثقافة 100 يوم واحد قبل ترنسفكأيشن.
    2. في يوم 0، سيتم تقاس بلات-E مع الخلايا OT-I MIDR البلازميد باستخدام كاشف ترنسفكأيشن GeneJamma.
    3. في يوم 1، سيتم المصنف 1x10 6 خلايا الجذع في واحدة جيدا من 0.1٪ الجيلاتين لوحة 24-precoated جيدا.
      1. في يوم 2، pseudovirus التي تحتوي على وطاف من بلات-E ثقافة جمع ومرت ميكرون 0،4 مرشح لاستبعاد الملوثات المحتملة.
      2. سيتم تنفيذ تنبيغ تحت شرط الطرد المركزي من 32 ° C الساعة 1400 دورة في الدقيقة لمدة 1 ساعة في وجود من 5 ميكروغرام / مل polybrene.
      3. بعد الطرد المركزي القائم على تنبيغ، سيتم وضع الخلايا في 32 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة أكثر من ليلة.
    4. في اليوم 3، كرر يوم 2 هيئة تنظيم الاتصالاتالإجراء nsduction كما هو موضح أعلاه. سيتم precoated صفيحة 6 جيد مع الخلايا irSNL76 / 7 المغذية لاستخدامها في المستقبل.
    5. في يوم 4، transduced سيتم trypsinized خلايا الجذع باتجاه آخر، بالطرد المركزي في 400 غ لمدة 5 دقائق والمصنف على الخلايا المغذية precoated irSNL76 / 7.
    6. في confluency، سيتم إيقاف الخلايا trypsinized، بالطرد المركزي في 400 غ لمدة 5 دقائق ومعالجتها للفرز الخلايا. سيتم فرز الخلايا GFP إيجابية وDsRED الضعف بحلول فارز الخلية MoFlo. وسيتم فرز الخلايا المستزرعة على الخلايا المغذية irSNL76 / 7 لاستخدامها في المستقبل.
  3. ونقل بالتبني التحدي الورم.
    transduced OT-I TCR يتم الاحتفاظ عادة الجذع (OT-I/iPS) الخلايا على الخلايا المغذية irSNL76 / 7 على النحو المبين أعلاه.
    1. في يوم نقل بالتبني، وtrypsinized الخلايا OT-I/iPS إيقاف، طرد في 400 غ لمدة 5 دقائق ومعلق في وسائل الإعلام الجديدة.
    2. 30 دقيقة الحضانة على طبق ثقافة جديدة في 37 ° C مطلوب حاضنة للقضاء على الخلايا المتمايزةوالخلايا المغذية بقايا.
    3. في نهاية الحضانة، وسوف يتم جمع الخلايا العائمة وبالطرد المركزي في 400 غ لمدة 5 دقائق.
    4. سيتم غسلها الخلية بيليه في برنامج تلفزيوني الباردة لثلاث مرات، وسيتم تمرير الخلايا من خلال مصفاة ميكرومتر النايلون 70 في اثنين من بين يغسل استبعاد كتل الخلايا (2X الترشيح).
    5. بعد غسل، سيتم احتساب الخلايا ومعلق في برنامج تلفزيوني الباردة في تركيز 1.5x10 7 خلايا / مل.
    6. وسيتم الحفاظ على الجليد الخلايا قبل الحقن.
    7. لنقل بالتبني، سيتم استخدام 4-6 أسابيع من العمر أنثى الفئران C57BL/6J. قبل الحقن عن طريق الوريد الرابع الذيل، سيتم وضع الفئران تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء لتمدد الأوردة الذيل.
    8. بعد توسع الوريد، وسوف يكون 200 ميكرولتر تعليق الخلية أو الخلايا 3x10 6 adoptively نقل عن طريق الوريد الذيل. وسيسمح لستة أسابيع في الجسم الحي من النضج OT-I TCR transduced الخلايا المحفزة.
      1. بعد ستة أسابيع من الحقن الرابع، سيتم تلقيح 4x10 6 خلايا التوتة E.G7 الغشاء البريتونى.
      2. سيتم حصادها E.G7 خلايا التوتة من الثقافة وغسلها ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني.
      3. في نهاية غسل، سيتم تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني الباردة في تركيز 8X10 7 خلايا / مل.
      4. وسيتم حقن 50 تعليق خلية ميكرولتر أو 4x10 6 خلايا في التجويف البريتوني.
  4. التقييم.
    1. في المختبر transduced توصيف OT-I TCR الخلايا المحفزة.
      1. الفلورسنت الفحص المجهري للDsRED، سيتم تنفيذ GFP إيجابية الخلايا المزدوجة تحت المجهر الفلورسنت التقليدية غير المثبتة مع الخلايا الحية.
      2. وسيتم تحليل التكامل الجينات والتعبير من قبل كل من PCR والتحليلات RT-PCR.
        1. سيتم عزل DNA أو RNA الخلوية بشكل منفصل من عينات DNA باستخدام QIAGEN أوRNA العزلة عدة.
        2. سيتم تنفيذ PCR PCR-RT وباستخدام الاشعال التي تعترف على وجه التحديد المنطقة VDJ معاد من سلسلة Vβ5 TCR.
    2. T تطور الخلايا والنضج. 3A الشكل.
      1. في الأسبوع 2، سيتم التضحية 4 و 6 نقل الخلية آخر والحيوان وستتم إزالة الطحال، العقد الليمفاوية من الحيوانات.
      2. وسوف تتاح واحدة من خلال تعليق الخلية عطل ميكانيكي. سيتم هي lysed خلايا الدم الحمراء باستخدام العازلة تحلل وACK mononucleocytes وسيتم جمع وغسلها مرتين في برنامج تلفزيوني الباردة.
      3. بعد غسل، سيتم منع الخلايا مع نادي مانع 24G2 في C ° 4 لمدة 20 دقيقة وعند نهاية حظر، سيتم aliquotted الخلايا والأجسام المضادة المختلفة ملطخة مترافق ملون تألقي في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      4. في نهاية تلطيخ، سيتم غسلها ثلاث مرات في خلايا PBS الباردة قبل تحميل على قياس التدفق الخلوي.
    3. التحفيز الببتيد. 3B الشكل.
      1. في يوم 50 من التحدي الورم، سيتم التضحية الحيوانات وستتم إزالة الطحال، العقد الليمفاوية من الحيوانات.
      2. وسوف تتاح واحدة من خلال تعليق الخلية عطل ميكانيكي. سيتم هي lysed خلايا الدم الحمراء باستخدام العازلة تحلل وACK mononucleocytes وسيتم جمع وغسلها مرتين في برنامج تلفزيوني الباردة.
      3. CD8 + سيتم عزل خلايا T باستخدام CD8 + Miltenyi بيوتيك لعدة T العزلة الخلية. سوف تكون مختلطة معزولة CD8 + T مع الخلايا المشع splenocytes الفئران المعزولة من السذاجة C57BL/6J في نسبة 1:10 و نابض مع 0.5 ميكرومول / مل OVA الببتيد 257-264 لمدة 40 ساعة. بعد ذلك، سوف يتم إضافة Brefeldin في الثقافة لمدة 4 ساعات.
      4. في نهاية coculture، سيتم حصادها الخلايا، وغسلها وسدت مانع التيسير كما هو موضح أعلاه.
      5. سيتم ملطخة الخلايا منعت لسطح علامةالمتطلبات البيئية وسلسلة Vβ5 CD8 وTCR باستخدام الأجسام المضادة مترافق ملون تألقي.
      6. بعد تلطيخ سطح الخلية، وسوف تكون ثابتة الخلايا باستخدام الفورمالدهيد 4٪ وpermeabilized باستخدام الخلايا عدة permeabilization.
      7. بعد permeabilization، سيتم ملطخة الجزيئات داخل الخلايا مثل IL-2-γ IFN وباستخدام الأجسام المضادة مترافق ملون تألقي.
      8. قبل الفحص النهائي تدفق cytometric، سيتم غسلها ثلاث مرات في خلايا PBS الباردة لاستبعاد الأجسام المضادة المفرطة.
    4. في الجسم الحي مما أسفر عن مقتل مقايسة. الشكل 3C.
      1. سيتم عزلها من الفئران Splenocytes C57BL/6J السذاجة وصفت مع carboxyfluorescein succinimidyl استر (CFSE) والخلايا المستهدفة.
      2. الخلايا التي تحمل سيتم نابض 5 ميكرومول / مل CFSE (خلايا مرحبا CFSE) مع 10 ميكروغرام / مل OVA 257-264 الببتيد وصفت الخلايا مع 0.5 ميكرومول / مل CFSE (CFSE الخلايا الصغرى) لن نابض. وسيتم مزيج من 2.5x10 6 خلايا مرحبا CFSE بالإضافة إلى 2.5x10 6 خلايا CFSE لو نقل adoptively عن طريق الحقن في الرابع المتلقي المشار إليه.
      3. بعد 16 ساعة، وسوف تكون معزولة عن تلك splenocytes الفئران وسوف يتم تحليل الخلايا + CFSE بواسطة التدفق الخلوي.
    5. عدد خلايا الورم داخل الصفاق. الشكل 4.
      في يوم 20 من التحدي الورم، سيتم التضحية الفئران وسيتم تنفيذ البريتوني غسيل تجويف باستخدام PBS الباردة. تعافى غسيل البريتوني سوف تحسب الخلايا السرطانية.
    6. ورم الخلايا T التسلل تحديد الهوية. الشكل 5.
      1. في المرحلة المتأخرة من الورم التحدي، سيتم التضحية الفئران وستتم إزالة ورم من التجويف البريتوني من مجموعات مختلفة.
      2. وسيتم خفض الورم إلى أجزاء، وسيتم وضع قطعة واحدة في cryovial وضعت على الثلج الجاف مباشرة، وسوف تكون ثابتة في النصف الآخر للسيتم الحفاظ maldehyde وقطعة ثالثة في وسائل الإعلام مكيفة-1640 RPMI لاستخدامها في المستقبل.
      3. سيتم تنفيذ H & E تلطيخ وفقا لبروتوكول عام من الفورمالديهايد الثابتة وعينات ملفوفة البارافين.
      4. سوف يتم تنفيذها على عينات تلطيخ مناعي cryopreserved.
        1. وسوف يكون مقطوع الأنسجة والحفاظ عليها في -20 درجة مئوية قبل الاستخدام.
        2. سوف تكون أقسام الأنسجة الهواء المجفف قبل 15 دقيقة من 15 دقيقة تثبيت الأسيتون الباردة.
        3. بعد التثبيت، سوف تكون المقاطع الهواء المجفف لمدة 15 دقيقة قبل غسل PBS 5 دقائق.
        4. بعد غسل مكان الشرائح، في غرفة رطبة وتغطية الأنسجة مع قسم BSA ميكرولتر 30 3٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة لمنع غير محددة وملزمة.
        5. في نهاية حظر، حظر صمة عار قبالة العازلة وتغطي أقسام الأنسجة مع 50 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة Vα2 PE-المضادة للTCR والأجسام المضادة FITC مضادة للOVA مخففة في BSA 3٪في برنامج تلفزيوني.
        6. احتضان في غرفة رطبة لمدة 2 ساعة وعند نهاية الحضانة، سيتم غسلها الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني الباردة وشنت وسائل الاعلام مع تصاعد المياه القائمة قبل الفحص المجهري الفلورسنت.
      5. تحليل تدفق cytometric من ورم الخلايا T التسلل.
        1. وسوف يكون الورم ممرود في التعليق خلية واحدة، وسيتم هي lysed خلايا الدم الحمراء عن طريق تحلل العازلة ACK.
        2. بعد الغسيل وعرقلة، وسوف يكون المسمى الخلايا مع أجسام مضادة مختلفة مترافق ملون تألقي التي تعترف على وجه التحديد CD8، وTCR Vα2 TCR V β5 الجزيئات التي أعربت على سطح الخلية.
    7. البقاء على قيد الحياة الماوس. الشكل 6.
      بعد التحدي الورم، سيتم رصدها بعناية بقاء الماوس.

4. ممثل النتائج

وتستخدم CD3 وTCRβ كعلامات من Tالخلايا. لتحديد ما إذا تحفيز خلايا الجذع مع DL1 يجند الشق يمكن أن تسهم في تمايز الخلايا T، قمنا بتقييم التعبير عن CD3 + وTCRβ على الخلايا المشتقة من خلية الجذع، والتعبير مزيد من التحليل للCD4 CD8 و، تبوب على CD3 + + وTCRβ السكان. كما هو موضح هنا، في يوم 22، CD3 + CD4 + TCRβ - CD8 + تم إنشاؤها واحدة إيجابية (SP) خلايا T من خلايا الجذع في المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، كانت الخلية المستمدة من الخلايا المحفزة SP قادرة على انتاج IL-2-γ IFN وعندما حفزت في المختبر عن طريق لوحة المغلفة CD3 المضادة للطائرات والمضادة للذوبان الأجسام المضادة CD28 (الشكل 2)، مما يشير إلى مصلحة السجون الخلايا المشتقة خلايا T وظيفية.

بعد نقل بالتبني في الفئران المتلقية، فإن غالبية الجينات TCR transduced الخلايا المحفزة خضع التمايز في CD8 + CTLs، والتي وردت في المختبر لتحفيز الببتيد بواسطة SEcreting IL-2-γ IFN و. (الشكل 3) الأهم من ذلك، نقل بالتبني TCR-transduced الخلايا المحفزة أثار تسلل OVA التفاعل CTLs إلى أنسجة الورم والحيوانات المحمية من التحدي ورم (الشكل 5-6). ومن ثم لا يمكن، TCR الجينات transduced خلايا الجذع تفرق في CTLs مستضد محددة وظيفية في الجسم الحي.

الشكل 1
الشكل 1. الصرف من تمايز الخلايا IPS. في أيام مختلفة، والماوس الخلايا المحفزة شارك في تربيتها مع OP9-DL1 الخلايا α-MEM في المتوسط ​​تستكمل مع FCS 20٪ و 2.2 بيكربونات الصوديوم ز / L في وجود mFlt3L نانوغرام / مل 5 و 1 نانوغرام / مل مل-7 .

الشكل 2
الرقم خلية T 2. تمايز الخلايا من IPS. والماوس خلايا الجذع شارك في تربيتها مع OP9-DL1 الخلايا كما هو موضح في الشكل 1. على دAY 22، تم عزل خلايا الجذع المستمدة من الخلايا وتحليلها. A) CD4 + CD8 - أو CD4 - CD8 + الخلايا بعد النابضة على CD3 + + TCRβ والسكان. B) وحفز الخلايا مع أجسام مضادة لمكافحة CD28 وحة المغلفة المضادة للCD3 وقابل للذوبان لمدة 5 ساعات في C ° 37 بنسبة 5٪ CO 2. وقد تم تحليل IL-2-γ IFN وتلطيخ من داخل الخلايا، بعد النابضة الحية على CD4 - CD8 + الخلايا التائية.

الشكل 3
الشكل 3. مستضد محددة CD8 + T-خلية من خلايا الجذع التنمية في الجسم الحي. تم حقن OT-I TCR الجينات transduced خلايا الجذع الرابع في C57BL / الفئران 6. بعد ستة إلى عشرة أسابيع، تقرر OVA CD8 محددة + T + خلية Vβ5 التنمية. A) CD8 + + Vβ5 تم تحليل الخلايا T من LNS المجمعة والطحال بواسطة التدفق الخلوي، بعد النابضة على Cالسكان + D8. B) IL-2-γ IFN والإنتاج (خطوط داكنة، وتم تحديد المناطق المظللة تشير الضوابط نمط إسوي) من خلال تلطيخ خلوى داخل الخلايا، بعد النابضة على السكان CD8 + + Vβ5 C) في مقايسة الانتشار / السمسة الجسم الحي. ونابض مرحبا CFSE (قمم اليمين) والصغرى CFSE (قمم اليسار) مع الخلايا المستهدفة الببتيد OVA 257-264 والسيطرة، على التوالي، وحقنت في الفئران عشرة أسابيع بعد نقل الخلايا الجذع أو يوم واحد بعد نقل CTL OT-I.

الشكل 4
الشكل 4. نقل بالتبني OT-I TCR الجينات transduced خلايا الجذع يقمع نمو الورم. تم نقل adoptively OT-I TCR الجينات transduced الخلايا في الفئران C57BL الجذع / 6. تم حقن مجموعة من الفئران واحدة مع OVA CD8 + التفاعل خلايا T من OT-I TCكان R الفئران المعدلة وراثيا، ومجموعة واحدة من الفئران لا يوجد نقل الخلية. بعد ستة أسابيع أو في اليوم التالي بعد نقل الخلايا، وتعرض الفئران للطعن مع خلايا الورم E. G7. في يوم 20، وتعداد الخلايا السرطانية في التجويف البريتوني.

الشكل 5
الشكل 5. الجذع الخلية المستمدة من المستضد محددة CTLs التسلل إلى أنسجة الورم. في يوم 30 حتي 35 بعد التحدي الورم، تم فحص أنسجة الورم لورم التفاعل تسلل خلية T. A) H & E تلطيخ. تسلل خلايا التهابية في أنسجة الورم (↓). B) تلطيخ Immunohistological. OVA محددة Vα2 + CTLs (أحمر) تسللت في OVA، معربا عن أنسجة الورم (الخضراء). C) وقد تم تحليل وحيدة الخلية تعليق من أنسجة الورم للتعبير عن Vα2 + + من قبل وVβ5 التدفق الخلوي، بعد النابضة على السكان + CD8.

الشكل 6. نقل بالتبني OT-I TCR الجينات transduced خلايا الجذع. يديم بقاء الماوس TCR OVA الجينات transduced تم نقل adoptively الخلايا المحفزة في الفئران C57BL / 6 التي تعرض للطعن مع خلايا الورم G7 E. كما هو موضح في الشكل. 4. وقد تبين الماوس على البقاء على قيد الحياة 50 يوما من منحنيات البقاء على قيد الحياة كابلان ماير (ن = 6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

لACT العلاجات المستندة، والمختبر في توليد أعداد كبيرة من الخلايا غاية محددة حج رد الفعل T في الجسم الحي لإعادة ضخ هو النهج الأمثل. على الرغم من أن أسلوبنا في المختبر من خلايا يثير T الوظيفية من خلايا الجذع، أعداد كبيرة من الخلايا المحفزة المستمدة من الخلايا تموت في أربعة أسابيع، وخاصة في الأسبوع الرابع. نستنتج ان الاشارة بوساطة إشارات من البقاء على قيد الحياة من قبل الشق DL1 وكذلك IL-7 و FLt3L ليست كافية للحفاظ على بقاء الخلية المستمدة من خلايا الجذع T السلف، قد تكون عوامل أخرى البقاء على قيد الحياة التعاونية لتنظيم هذه نضوج الخلية. TCR تنبيغ الجينات والتحفيز المختبر مع يجند الشق مباشرة إلى حد كبير تمايز الخلايا T من خلايا الجذع، ومع ذلك، فإن الخلايا المشتقة من الخلايا المحفزة مستضد محددة T لا تزال لا يمكن البقاء على قيد الحياة لفترة أطول، مما يمنع الحصول على الأعداد المناسبة من الخلايا المشتقة من الجذع مستضد T خلايا معينة لACT المستندة إلى العلاج المناعي.

ve_content "> تطوير الخلايا الليمفاوية T في الغدة الصعترية هي عملية حسن انتظام. ويشار إلى نقص نمو الخلايا الصعترية التعبير عن CD4 CD8 وإلى ضعف الخلايا و(DN) سلبية. السلائف DN تنقسم إلى مجموعات فرعية على أساس التنموية التعبير عن CD44 وCD25: DN1 (CD44 CD25 + -)، DN2 (CD44 CD25 + +)، DN3 (CD44 - CD25 +) وDN4 (CD44 - CD25 -) فقط DN3 الخلايا التي قد ولدت سلسلة TCRβ الوظيفية، والتي مع أزواج ثابتة قبل Tα وسلاسل CD3 لتشكيل ما قبل TCR ويتم اختيار لمزيد من التمايز. هذا الحدث، ووصف β-التحديد، يمثل أول نقطة تفتيش أثناء تطوير خلية T. قبل TCR انتشار إشارات تشكيل وإنهاء إعادة ترتيب موضع TCRβ ، والتفريق بين thymocytes DN CD4 + إلى + CD8 الإيجابية المزدوجة (DP) المرحلة 17. لدينا في المختبر التحفيز ثإيث الشق يجند DL1 يدفع الخلايا المحفزة للمرور عبر الحاجز β-التحديد في 2 أسابيع، وتصبح الخلايا T قبل (CD3 + + TCRβ؛ CD25 - CD44 CD4 - CD8 -). 2-الاسبوع إضافية التحفيز قبل T يسمح الخلايا لعبور إلى CD8 + T ناضجة الخلايا (CD3 + + TCRβ؛ CD4 - CD8 CD62L + + CD27 + CCR7 CD127 +). فإن الخلايا T الناضجة SP يموت في حالة عدم وجود المزيد من التحفيز من قبل TCR ومعقدة CD3.

في البرمجة المجراة من المستضد محددة CTLs من آي بي إس يمكن التغلب على نقص الخلايا للحصول على عدد كاف من الخلايا T للACT العلاجات المستندة. على الرغم من السيطرة الملحوظة من نمو الورم، حددنا بعض القيود المفروضة على ACT مع خلايا الجذع TCR الجينات transduced. أولا، على الأقل ستة أسابيع في الجسم الحي التنمية أمر ضروري لتمايز الخلايا T-المستمدة من رransferred الخلايا المحفزة. الثاني، لاحظنا فقدان الفراء، وهشاشة العظام وغيرها من مظاهر المناعة الذاتية طفيفة في الفئران التي تلقت TCR-transduced الخلايا المحفزة كما لوحظ في بعض التجارب السريرية ادارة العلاج المناعي سرطان الخلايا T مقرا لها. قد يكون سبب هذه الآثار من قبل جيل من غيرها من أنواع الخلايا المناعية من نقل خلايا الجذع. ولكن، كيف يتم إنشاء هذه الخلايا في الجسم الحي ما زال مجهولا. الثالث، ونقل بالتبني من الخلايا المحفزة TCR الجينات transduced لديه خطر توليد مسخي بسبب النمط الظاهري ساقها. ولكن حتى الآن في دراستنا، وجدناها فقط في واحدة الشامل extrathymic Rag1 - / - الماوس ولم يلاحظ خلل في C57BL التقليدية / الفئران 6. لذلك، نقترح، للحصول على أقصى كفاءة، فمن الأفضل للحصول على الخلفية الوراثية للمباراة في التفريق الجذع الجسم الحي.

وعلى النقيض من مشتقات المجالس الاقتصادية والاجتماعية، والشاذ التعبير الجيني في بعض خلايا متباينة من خلايا الجذع لديهم امكاناتهال للحث الخلايا T-التي تعتمد على الاستجابة المناعية في متلقي مسانج 18. ولذلك، ينبغي تقييم المناعية من الخلايا المشتقة من الخلايا المحفزة المريض محددة قبل التفكير في أي التطبيق السريري لهذه الخلايا ذاتي. من خلال تحليل الجينات التعبير ملامح من خلايا الجذع المستمدة من الخلايا، وقد تبين أن أعرب عن مجموعة من 9 الجينات (Hormad1، Zg16، Cyp3a11، Lce1f، Spt1، Lce3a، Chi3L4، Olr1، Retn) عند مستويات مرتفعة بشكل غير طبيعي . وبالإضافة إلى ذلك، التعبير حمل ثلاثة من هذه الجينات (Hormad1، وZg16 Cyp3a11) في الخلايا المناعية ES زيادة كبيرة في زرع المتلقين في مطابقة وراثيا 18. وهكذا، فإن مجموعة من 9 البروتينات لديه القدرة على أن يسبب الرفض المناعي للخلايا الخلية المستمدة من الجذع بعد نقل بالتبني، وربما تمثل علامات مناعة. ومع ذلك، فإن المناعية المحتملة للخلية الجذع ديلم يتم تحديد الخلايا اللمفية تي rived.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر الدكتور شينيا ياماناكا (جامعة كيوتو) لتوفير IPS-NG-MEF-20D-17 خط خلية الدكتور داريو Vignali (مستشفى سانت جود للأطفال للبحوث) لدعم OT1-2A • pMig II بناء، والدكتور خوان كارلوس زونيغا-Pflucker (قسم علم المناعة في جامعة تورونتو) لدعم خط خلية OP9-DL1، والدكتور كينت E Vrana (قسم علم الأدوية، جامعة ولاية بنسلفانيا كلية الطب) لمساعدة تصميم هذه الدراسة. ويتم تمويل هذا المشروع، في إطار المنح مع عدد من المنح K18CA151798 المعهد الوطني للسرطان، صندوق Barsumian والميلانوما مؤسسة البحوث (J. أغنية).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 002216
Anti-CD3 (2C11) antibody BD Biosciences 553058
Anti-CD28 (37.51) antibody BD Biosciences 553295
Anti-CD3 (17A2) antibody BioLegend 100202
Anti-CD4 (GK1.5) antibody BioLegend 100417
Anti-CD8 (53-6.7) antibody BioLegend 100714
Anti-CD25 (3C7) antibody BioLegend 101912
Anti-CD44 (1M7) antibody BioLegend 103012
Anti-CD117 (2B8) antibody BioLegend 105812
Anti-TCR-β (H57597) antibody BioLegend 109220
Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody BioLegend 503810
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody BioLegend 505822
DMEM Invitrogen ABCD1234
α-MEM Invitrogen A10490-01
FBS Hyclone SH3007.01
Brefeldin A Sigma-Aldrich B7651
Polybrene Sigma-Aldrich 107689
GeneJammer Integrated Sciences 204130
RNA kit Qiagen 74104
DNA kit Qiagen 69504
CD8 Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-095-236
ACK lysis buffer Lonza Inc. 10-548E
mFlt-3L PeproTech Inc 250-31L
mIL-7 PeproTech Inc 217-17
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
FITC-anti-OVA antibody Rockland Immunochemicals 200-4233
Permeabilization buffer Biolegend 421002
BSA Sigma-Aldrich A7906
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
0.4 μm filter EMD Millipore
Moflo Cell Sorter Dako
Calibur Flow Cytometer BD Biosciences
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences
Mouse restrainer Braintree Scientific, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
  2. Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
  3. Seki, Y. IL-7/STAT5 cytokine signaling pathway is essential but insufficient for maintenance of naive CD4 T cell survival in peripheral lymphoid organs. J. Immunol. 178, 262-270 (2007).
  4. Stemberger, C. A single naive CD8+ T cell precursor can develop into diverse effector and memory subsets. Immunity. 27, 985-997 (2007).
  5. Siewert, C. Experience-driven development: effector/memory-like alphaE+Foxp3+ regulatory T cells originate from both naive T cells and naturally occurring naive-like regulatory T cells. J. Immunol. 180, 146-155 (2008).
  6. Wang, L. X., Plautz, G. E. Tumor-primed, in vitro-activated CD4+ effector T cells establish long-term memory without exogenous cytokine support or ongoing antigen exposure. J. Immunol. 184, 5612-5618 (2010).
  7. Hinrichs, C. S. Human effector CD8+ T cells derived from naive rather than memory subsets possess superior traits for adoptive immunotherapy. Blood. 117, 808-814 (2011).
  8. Alajez, N. M., Schmielau, J., Alter, M. D., Cascio, M., Finn, O. J. Therapeutic potential of a tumor-specific, MHC-unrestricted T-cell receptor expressed on effector cells of the innate and the adaptive immune system through bone marrow transduction and immune reconstitution. Blood. 105, 4583-4589 (2005).
  9. Yang, L., Baltimore, D. Long-term in vivo provision of antigen-specific T cell immunity by programming hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 4518-4523 (2005).
  10. Zhao, Y. Extrathymic generation of tumor-specific T cells from genetically engineered human hematopoietic stem cells via Notch signaling. Cancer Res. 67, 2425-2429 (2007).
  11. Boztug, K. Stem-cell gene therapy for the Wiskott-Aldrich syndrome. N. Engl. J. Med. Med, N. .E. ngl.J. . 363, 1918-1927 (2010).
  12. Peerani, R., Zandstra, P. W. Enabling stem cell therapies through synthetic stem cell-niche engineering. J. Clin. Invest. 120, 60-70 (2010).
  13. Mendez-Ferrer, S. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466, 829-834 (2010).
  14. Daley, G. Q. Towards the generation of patient-specific pluripotent stem cells for combined gene and cell therapy of hematologic disorders. Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 17-22 (2007).
  15. Boitano, A. E. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329, 1345-1348 (2010).
  16. Himburg, H. A. Pleiotrophin regulates the expansion and regeneration of hematopoietic stem cells. Nat. Med. 16, 475-482 (2010).
  17. Tanigaki, K., Honjo, T. Regulation of lymphocyte development by Notch signaling. Nature immunology. 8, 451-456 (2007).
  18. Zhao, T., Zhang, Z. N., Rong, Z., Xu, Y. Immunogenicity of induced pluripotent stem cells. Nature. 474, 212-215 (2011).

Comments

2 Comments

  1. I enjoyed reading and watching your article. I would like to ask you if we can obtain OP9-DL1 from you.

    Reply
    Posted by: Byoung K.
    May 14, 2013 - 8:35 PM
  2. thanks

    Reply
    Posted by: Rashad A.
    February 26, 2014 - 10:06 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics