聚合酶链反应:基本协议加上故障排除和优化策略

Biology
 

Summary

PCR技术已经成为了许多分子生物学实验室常用技术。这里提供几个常规PCR协议是一个快速指导。因为每一个反应是一个独特的试验,以产生不同产品所需的最佳条件。了解反应中的变量,将大大提高故障排除效率,从而增加了机会,以获得所需的结果。

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Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

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Abstract

在生物科学,有技术进步的纪律弹射到发现的黄金年龄。例如,微生物学领域的转化与安东·范·列文虎克的显微镜,它允许科学家们想象的首次原核生物的到来。聚合酶链反应(PCR)的发展是一个创新,改变其影响跨越无数的分支学科,在生物分子科学当然。理论的过程概述了由Keppe和同事在1971年,然而,它是14年,直到完整的PCR过程描述和实验由Kary穆利斯应用,而在鲸鱼座公司于1985年。自动化和完善这一技术进步与引进菌嗜水生 ,因此得名Taq DNA聚合酶的热稳定的DNA聚合酶。

PCR是1鲍威RFUL扩增技术,可以产生一个特定的DNA(即扩增)段供应充足,只有少量的起始原料(即模板DNA或靶序列)。虽然简单,一般无故障,也有复杂的化学反应产生的杂散结果的陷阱。 PCR扩增失败时,它可以导致许多大小不等的非特异性的DNA琼脂糖凝胶带梯子或涂片中出现的产品。有时,没有产品形成所有。另一个潜在的问题发生突变时无意中引入的扩增,在PCR产物的异构人口。 PCR扩增失败可以成为令人沮丧的,除非耐心和细心的故障排除理清和解决的问题(S)。该协议概述了PCR技术的基本原则,提供了一种方法,这将导致大多数靶序列的扩增,并提出了优化反应的战略。按照这样的PCR指南,STudents应该能够:

  • 设立常规PCR实验反应和热循环条件
  • 了解各种反应元件的功能及其在PCR实验的整体效果
  • 设计和优化为任何DNA模板的PCR实验
  • 失败的PCR实验疑难解答

Protocol

1。设计引物

设计适当的引物的PCR实验取得圆满成功是至关重要的。一个引物设计了一套引物的DNA扩增所需的特定区域时,应加股按照惯例,这是面向在5'→3'方向(又称感或者非模板链)和退火其他底漆应该补充的负链,这是面向在3'→5'方向(反义或模板链)。有几个常见的问题出现在设计引物:1)自我退火导致形成二级结构,如发夹环( 图1a)的引物; 2)引物退火对方,而不是DNA为模板,建立底漆二聚体( 图1b),3)截然不同的熔融温度(Tm值)为每对引物,使其难以选择退火温度,将所有OW两个引物,以有效地绑定到循环热敏纸料( 图1c)(熔融温度(Tm值)和修改循环条件计算在T M S的更多信息,请参阅节)期间的目标序列。

  1. 下面是一个设计引物时,应考虑的特性列表。
    1. 引物的长度应为15-30核苷酸残基(基地)。
    2. 优化GC含量应介于40-60%。
    3. 引物的3'端应包含一个G或C,以遏止底漆,防止“呼吸”的两端,增加吸效率。 DNA的“呼吸”发生时,两端不留退火,但磨损或裂开。在GC对三个氢键有助于防止呼吸,但也增加了引物的熔融温度。
    4. 3'端的引物,其中包括正链引物和负链引物,不应该是c omplementary对方,也不能单一的引物的3'到底是互补的其他序列的引物。这两种情况导致引物二聚体及发夹环结构的形成,分别。
    5. 优化的熔融温度(Tm值)为52-58°C间之间的引物范围,虽然范围可以扩大到45-65°C。 T为最后两个引物的M应该相差不超过5°C。
    6. DI-核苷酸重复(例如,GCGCGCGCGC或ATATATATAT)或单一基地运行(例如,AAAAA级或共同体气候变化中心)应避免,因为它们可能导致滑倒沿着DNA和发夹环结构形成的引段。如果不可避免,由于DNA模板的性质,然后只包括重复或单一基地运行最多4个基地。

注释:

  1. 有许多电脑设计方案,以帮助设计引物对。 NCBI的引物设计工具w.ncbi.nlm.nih.gov /工具/引爆炸/“目标=”_blank“> http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/和Primer3 http://frodo的.wi.mit.edu/primer3 /为此建议的网站。
  2. 为了避免相关的假基因或同源的放大,它可能是有用的NCBI BLAST运行为目标的引物特异性检查。

2。材料和试剂

  1. 设立一个PCR实验时,重要的是做好准备。戴上手套,以避免污染或试剂反应混合物。包括阴性对照,如果可能的话阳性对照。
  2. 安排的新鲜填充冰桶中的PCR实验所需的所有试剂,并让他们完全解冻之前,设立一个反应( 图2)。保持冰整个实验试剂。
    • 标准的PCR试剂包括设置适当的引物所需的靶基因或DNA片段扩增,DNA聚合酶,缓冲一个特定的DNA聚合酶,脱氧核苷酸(dNTPs浓度),模板DNA,无菌水。
    • 额外的试剂可能包括2 +(终浓度在0.5至5.0毫米)镁盐,镁,钾盐K +(终浓度在35至100毫米),二甲基亚砜(DMSO;终浓度在1-10% ),甲酰胺(终浓度在1.25-10%),牛血清白蛋白(终浓度在10-100微克/毫升),甜菜碱(终浓度在0.5米至2.5米)。添加剂在故障排除部分进一步讨论。
  3. 组织对实验室设备的工作台。
    • 材料包括PCR管和瓶盖,PCR管架,耐乙醇的标记,和一套micropipettors免除1 - 10μL(10页),2 - 20微升(P20〜),20 - 200μL(P200的)200 - 1000μL(P1000的),以及热循环。
    • 时,设立若干PCR实验,都使用相同的试剂,它们可以适当缩小,并结合在主混合物(主混音)。在无菌的1.8 ml离心管(见注),可以做到这一步。
    • 分析扩增PCR实验试剂和琼脂糖凝胶电泳设备是必需的。近似​​的PCR产物的大小,适当的,市售的分子量大小标准是必要的。

3。设置了反应混合物

  1. 由表将被添加到反应混合物( 见表1)试剂的开始。
  2. 下一步,耐乙醇标记的标​​签PCR管(S)。
  3. 反应量会有所不同取决于股市试剂的浓度。最终浓度(CF)的是一个典型的50μl反应如下。
    • X缓冲区(通常由DNA聚合酶的制造商提供的,可能含有MgCl 2的 15毫米)。添加5%10X反应缓冲液。
    • 200μM的dNTPs浓度(每个四种核苷酸的50微米)。加入1μLdNTPs浓度每反应(的dATP,dCTP,dTTP和三磷酸在2.5毫米)10毫米。
    • 1.5毫米Mg 2 +的 。只有加入,如果不是目前在10X的缓冲区,或用于PCR优化的需要。例如,要获得4.0 mm的Mg 2 +的保守566 bp的DNA,发现在一个未知的分枝杆菌噬菌体加入8μl到25毫米MgCl 2的反应( 图3)段的最佳扩增生产所需。
    • 20至50 pmol的每个引物。添加20μM的引物各1μL。
    • 新增10 4 10 7分子(或约1到1000纳克)DNA模板。加入0.5μL的2NG /&亩; L基因分枝杆菌噬菌体的DNA。
    • 例如加入0.5至2.5单位每50μl反应体系的DNA聚合酶(参见制造商的建议),添加0.5μL西格玛0.5单位/μLTaq DNA聚合酶。
    • 新增QS无菌蒸馏水,获得每50μl的反应终体积为试剂表中预先确定的(QS是拉丁文缩写,意思是所需要的金额为量子SATIS)。因此,33%μL反应带来了体积达50μL。然而,应当指出,加水第一,但需要先使试剂表,并确定所有其他试剂加入反应体积。

4。基本PCR技术协议

  1. 放置到96孔板为0.2毫升薄壁PCR管持有人的冰桶。允许到0.2毫升冷薄壁PCR管中加入PCR试剂将有助于防止nucleasE活性和特异性启动。
  2. 按下列顺序将吸取0.2毫升薄壁PCR管( 图4)以下的PCR试 ​​剂:无菌水,10X PCR缓冲液,dNTPs浓度,MgCl 2的引物和模板DNA( 见表1)。由于实验应该有至少一个阴性对照,可能是一个积极的控制,有利于建立在1.8 ml离心管硕士组合(见注释解释)。
  3. 在一个单独的0.2毫升薄壁PCR管( 图4)所有试剂添加模板DNA为阴性对照异常(增加水的丢失量,以弥补)。此外,另一种反应(如试剂可用)应包含阳性对照模板DNA或以前称为作为实验的PCR管在同等条件下扩增的引物。
  4. Taq DNA聚合酶在50%的甘油通常存储反应混合物中的解决方案和完整的传播需要温柔的PCR试剂混合,吸取了至少20倍。的移液器应设置为大约一半的主结构的反应体积混合时,应小心,以避免引入气泡。
  5. 把0.2毫升薄壁PCR管盖,放入热循环仪( 图5)。一旦热循环仪的盖子紧闭启动程序( 见表2)。
  6. 当程序已经完成,0.2毫升薄壁PCR管可能被删除,并储存在4°C可以检测PCR产物琼脂糖凝胶然后染色的DNA凝胶电泳溴化乙锭以下迁移井装载到每个反应等分。如果PCR产物,溴化乙锭将插之间的DNA链的基地,允许带是用紫外灯的可视化。 </ LI>

注释:

  1. 当设置了多重PCR实验,这是有利的组装共同所有的反应(即,主混音)试剂的混合物。通常鸡尾酒含有一个DNA聚合酶,dNTPs浓度,反应缓冲液,并组装成1.8 ml离心管水的解决方案。主结构是每个试剂的添加量相当于反应的总数加10%,四舍五入到最接近的整反应。例如,如果有10×0.1 = 1的反应,然后(10 +1)×5μL10X缓冲等于55μl10X缓冲的主结构的。轻轻抽一个移液器柱塞上下约20倍以上所述,在预混试剂混匀。每个PCR管接收到一个主混合DNA为模板,任何所需的引物,以及具体的实验,试剂,然后加入( 见表1和7)等分。
  2. 在fo​​llowi纳克网站提供计算器http://www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.html一个确定的模板DNA(副本)。总数的双链DNA的复制品,可使用下列公式计算:
    (DNA量(纳克)6.022x10 23)= DNA的拷贝数/(DNA x 1×10 9毫微克/毫升×650道尔顿的长度)
    DNA拷贝数的计算是用来确定每个反应需要多少模板。
  3. 作为结转从另一个PCR反应后琼脂糖凝胶电泳多个不受欢迎的产品,这将是可视化的后果可能发生误报。因此,谨慎的做法是使用适当的技术,包括阴性对照(阳性对照)。
  4. 而溴化乙锭是最常见的污渍f或有核酸几个安全和毒性较低的替代品。下面的网站介绍几个的替代品,包括亚甲基蓝,结晶紫,安全的SYBR,凝胶以及描述如何使用和最终产品的检测(红色http://bitesizebio.com/articles/ethidium-bromide-the-替代/ )。
  5. 而最现代的PCR机器使用0.2 ml反应管,有些机型可能需要0.5毫升管反应。见你的热循环仪手册,以确定适当的大小管。

5。计算熔融温度(Tm值)

  1. 了解引物的熔融温度(Tm值)必须是一个成功的PCR实验。虽然有几个 Tm计算器,重要的是要注意,这些计算估计实际 Tm缺乏一个特定的反应和作出的假设中 Tm计算器自己的算法的具体信息。然而,最近的邻居的热力学模型在更传统的计算:Tm值≈4(GC)+ 2(AT)的首选。前者将提供更准确 Tm估计,因为它考虑到了相邻的碱基堆积能源。后者则是更频繁地使用,因为计算很简单,可以迅速由手工完成。各种PCR条件和添加剂如何影响熔融温度的信息,请参阅“疑难解答”一节。
    热力学模型,近邻以下计算器计算Tm值的建议:
    http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/
    EDU /〜ZIMMER / oligoTMcalc.html“的目标=”_blank“> http://www.cnr.berkeley.edu/〜ZIMMER / oligoTMcalc.html的
    http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
    http://www.finnzymes.com/tm_determination.html~~V
    #形式::融化http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?

6。设置热循环条件

  1. PCR热循环快速加热,冷却反应混合物,从而诱导双链DNA(链分离)的热变性,加号和减号的DNA模板链的引物退火,延伸PCR产物。基于模板和DNA的GC含量的大小,循环次数计算。一般formul与最初的变性步骤开始在94°C至98°C间根据DNA聚合酶活性和DNA模板GC含量的最佳温度。一个典型的反应将开始一分钟变性94°C。任何时间超过3分钟可灭活的DNA聚合酶,破坏其活性。的方法之一,被称为热启动PCR技术,极大地扩展了最初从3分钟到9分钟变性时间。热启动PCR,DNA聚合酶添加完成后的最初夸张的变性步骤。本协议的修改,避免了可能失活的DNA聚合酶。是指本协议约热启动PCR和其他替代方法的更多信息疑难解答“一节。
  2. 下一步是设置热循环启动25至35轮的三个步骤的温度循环( 见表2)。而35岁以上的周期数增加,将导致PCR产物的数量,太多子弹,往往造成不良次级产品的丰富。在一个周期内的温度三个步骤完成三项任务:第一步变性的模板(并在以后的周期,扩增为),第二步允许最佳的引物退火,第三步允许绑定到DNA聚合酶DNA为模板合成的PCR产物。可能会改变一个周期内的每个步骤的时间长短和温度,以优化生产所需的扩增。
    保持尽可能短的时间为变性步骤。一般10至60秒,足以满足大多数DNA模板。变性时间和温度可能会有所不同取决于模板DNA的GC含量,以及斜坡率,这是改变从一个温度下的热循环所花费的时间。这一步的温度通常是相同​​的,变性初始阶段使用(步骤#1以上,例如,94°C间)。
    内循环30秒退火步骤如下设定温度约5°以下明显的T 的引物℃(理想之间的52°C至58°C间)。
    周期的总结与延伸。温度取决于实验选定的DNA聚合酶。例如,Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度为70°C到80°C间需要1分钟延长第2 KB,然后需要一个额外的分钟每增加1 kb的扩增。 Pfu DNA聚合酶是另一种耐高温的酶具有最佳延伸温度为75°C。 Pfu DNA聚合酶建议使用PCR和要求高的保真度和需要2分钟,每1 kb的扩增引物延伸反应。看到确切的延伸温度和延伸时间为每个特定的DNA聚合酶表示制造商的建议。
  3. Taq DNA聚合酶的情况下,允许所有PCR产物的3'末端腺嘌呤残留此外。这种修改是介导的末端转移酶活性 Taq DNA聚合酶,并为随后的分子克隆程序,需要一个3'-突出有用。
  4. 终止反应是通过心寒的混合物4°C和/或通过加入EDTA至终浓度为10 mM。

7。当故障排除PCR技术的重要的考虑因素

如果标准的PCR反应条件不产生预期的扩增,PCR优化是必要的,以达到更好的效果。紧缩的反应可能是调制这样的调整是通过改变变量,特异性试剂(例如,浓度,循环条件)的影响的扩增剖面的结果。例如,如果反应不够严格,许多虚假的扩增将产生可变长度。如果反应是过于苛刻,没有产品将生产。 PCR反应故障排除,可能是一个令人沮丧的努力。但是,仔细分析,很好地理解了在PCR实验所用试剂可以取得预期的效果需要时间和试验量减少。所有的考虑,影响PCR紧绌,滴定Mg 2 +和/或操纵退火温度可能会解决大部分问题。但是,改变任何东西之前,一定是一个错误的结果是不是由于人为错误。首先,确认所有被添加到一个给定的反应试剂和试剂没有受到污染。还需要注意的错误的结果,并提出下列问题:底漆二聚体对凝胶electropho后可见电阻(这些小波段运行<100)线近车道的底部?是否有非特定产品(带迁移比大小不同所需的产品)?在那里没有任何产品吗?靶DNA是质粒或基因组DNA的提取物?此外,它是明智的分析所需的扩增GC含量。

  1. 首先要确定,如果有任何的PCR试剂你的反应是灾难性的。这可以通过编写新的试剂(例如,新鲜的股票,新的稀释),然后在系统中添加一个新的试剂到反应混合物的时间。这一进程将确定该试剂PCR实验失败的罪魁祸首。在非常古老的DNA,这往往积累抑制剂的情况下,它已被证明,牛血清白蛋白除了可能有助于缓解这一问题。
  2. 引物二聚体形成引物时,优先自退火或退火反应中的其他底漆。如果发生这种情况,一个小小于100 bp的产品将出现在琼脂糖凝胶。开始通过改变模板,以引物的比例,如果引物浓度是在极端的模板浓度超过过剩,然后引物,将更有可能超过自己或对方的DNA模板退火。加入DMSO或使用热启动热循环方法可以解决这个问题。最终,它可能是必要的,以设计新的引物。
  3. 当PCR紧缩是过低导致非特异性PCR扩增带可变长度的非特定产品的生产。这将产生一个阶梯上的琼脂糖凝胶效果。然后,它是明智的选择PCR反应条件,提高严格。涂抹的各种尺寸也可能会导致高度重复序列设计引物扩增基因组DNA时。然而,同样的引物可扩增质粒上的目标序列,没有遇到同样的问题。
  4. PCR产物的缺乏可能是由于反应条件过于严格。形成与变性的模板DNA引物或引物二聚体及发夹环结构也可以防止扩增PCR产物,因为这些分子可能不再与所需的DNA对应的碱基对。
  5. 如果尚未分析GC含量,它是这样做的时间。 GC丰富的地区,聚合酶链反应(GC含量> 60%),对一些到PCR的最大挑战。不过,也有很多添加剂,已被用来帮助减轻面临的挑战。

8。操纵PCR试剂

时,首先决定如何最好地改变反应条件,以获得所需的产品,了解常规PCR试剂的作用是至关重要的。成功仅仅依靠改变,氯化钾, 氯化镁 ,dNTPs浓度,引物,模板DNA,或DNA聚合酶浓度。然而,这种试剂的错误的浓度可能会导致虚假的结果,减少stringency的反应。故障排除时,PCR扩增,只有一个试剂应在操纵。然而,它可能是审慎的滴定操作的试剂。

  1. 镁盐镁2 +(0.5至5.0毫米的最终反应浓度)
    耐热DNA聚合酶需要作为辅助因子,在反应过程中镁的存在。改变镁离子浓度,是一个最简单的试剂可能操纵上影响最大的PCR的严格。在一般情况下,PCR产物的产量将增加另外较高浓度的Mg 2 +。然而,增加的Mg 2 +浓度也将减少的特异性和DNA聚合酶的保真度。大多数制造商的解决方案,随着DNA聚合酶和10X PCR缓冲液氯化镁(氯化镁2)。 10×PCR缓冲液可能含有MgCl 2的 15毫米,这足以为一个典型的PCR在一个特定的反应进行了优化,浓度分别反应,或者它可能会增加。 Mg 2 +的实际消耗的反应,但没有它存在的反应不能进行。当有过多的Mg 2 +的 ,它可能会妨碍稳定的双面链完整的DNA模板变性。过多的Mg 2 +也可以稳定虚假,不正确的模板网站和减少意外PCR产物的特异性引物退火。当有没有足够的Mg 2 +的反应将无法进行,导致在没有PCR产物。
  2. 钾盐的K +(35至100毫米的最终反应浓度)
    减少其正常的50毫米反应浓度钾盐(氯化钾),往往在结合DMSO和/或甘油此外,较长的PCR产物(10至40 KB)的利益。如果所需的扩增低于1000 bp和长期的非特定产品正在形成,特异性的TY可提高通过滴定氯化钾,浓度增加10毫米递增至100毫米。增加盐的浓度允许较短的DNA分子变性优先更长的DNA分子。
  3. 脱氧核苷酸5'-三磷酸(20和200μM的最终反应浓度)
    脱氧核苷酸5'-三磷酸(dNTPs浓度)可导致PCR的问题,如果他们没有在适当的当量浓度(即[] = [T]的= [] = [克])和/或由于其不稳定反复冻融。通常dNTP浓度为50微米四个dNTPs浓度。然而,PCR可以容忍之间的20和200μM的浓度。 dNTPs浓度低浓度可能会增加反应的特异性和保真度,而过量的dNTP浓度实际上可以抑制PCR技术。然而,对于较长的PCR扩增片段,dNTP浓度较高的可能需要。 dNTP浓度在一个大的变化,可能有必要corres积水中浓度变化+。
  4. 热稳定的DNA聚合酶
    与这些酶有关的PCR酶和缓冲区已经走过了很长的路要走,首先从最初的Taq DNA聚合酶。因此,选择合适的酶,能有助于获得所需的扩增产品。例如,使用Taq DNA聚合酶可首选Pfu DNA聚合酶processivity和/或PCR产物的3'末端腺嘌呤残留此外,如果需要的。 3此外,腺嘌呤,已成为一个有用的战略“胸腺嘧啶出挑成局长丝毫3载体克隆PCR产物。然而,如果保真度更重要的是,如Pfu酶可能是更好的选择。几个生产有特殊需求而设计的特定DNA聚合酶阵列。看看所需的扩增反应条件和特点,然后匹配的PCR实验与相应的DNA Polymerase。大多数制造有表,援助上市的特点,如保真度,产量,速度,最优的目标长度,无论是有益的富含GC放大或热启动PCR的DNA聚合酶的选择。
  5. 模板DNA
    DNA的质量和纯度,将有一个成功的PCR实验的可能性产生重大影响。 DNA和RNA的浓度可确定在260 nm(外径260)使用其光密度测量。在溶液中纯化核酸的质量计算在50微克/毫升的双链DNA或RNA或单双链DNA在一个外径260 = 1.0微克/毫升40。 DNA提取污染物共同在PCR抑制剂,应小心避免。共同的DNA提取的PCR抑制剂,包括蛋白质,RNA,有机溶剂和清洁剂。使用外径260核酸的最大吸收蛋白质OD280(外径260/280)相比,它有可能determine和估计的提取DNA的纯度。理想的情况下,外径260/280的比例是1.8和2.0之间。较低的OD 260/280是表示蛋白质和/或溶剂的污染,在所有的可能性,将用于PCR的问题。
    除了模板DNA的质量,优化的DNA的数量可能会大大受益的PCR实验的结果。虽然很方便,以确定在ng /μl的,这常常是现代nanospectrophotometers的输出量,为一个成功的PCR实验的有关单位是分子的数量。也就是说,PCR引物的互补序列的DNA模板的副本包含多少?最优目标分子的分子之间10 4 10 7,可在上述票据计算。

9。添加剂试剂

添加剂试剂可能产生的结果,当一切都失败了。了解试剂和他们所使用的是确定哪些试剂可能收购所需的PCR产物中最有效的关键。事实上,一个试剂的操作可能会影响另一试剂可用浓度添加试剂的反应是复杂的。除了下面列出的试剂,专有市售的添加剂是可以从许多生物技术公司。

10。添加剂有利于GC丰富的模板

  1. 二甲基亚砜(1-10%DMSO的最终反应浓度)
    在模板DNA尤其是富含GC(GC含量> 60%),加入DMSO可能通过破坏碱基配对,并有效地降低了Tm值提高反应的PCR实验。一些Tm值计算器包括加入DMSO浓度在PCR实验所需的变量条目。然而,增加超过2%的DMSO可能需要增加更多的DNA聚合酶,因为它已证明strated抑制Taq DNA聚合酶。
  2. 甲酰胺(1.25-10%的最终反应浓度)
    如二甲基亚砜,甲酰胺,也破坏碱基配对,而增加的引物退火紧缩,从而减少非特异性的启动和增加的扩增效率。甲酰胺也已被证明是一个富含GC的模板的增强。
  3. 7 deaza-2'-脱氧鸟苷5'-三磷酸(DC 7最终反应浓度的GTP; 3直流7 GTP的:1三磷酸50微米)
    使用3部分组成,或37.5μM鸟嘌呤基地模拟DC 7 GTP,配合第1部分,或12.5μM,三磷酸会破坏产品的二级结构的形成。作为扩增模板DNA变性,往往会形成二级结构,如发夹环。 7 GTP的直流纳入的DNA扩增,将禁止这些异常结构的形成。

注意:

7 GTP jove_content衰减溴化乙锭染色,这就是为什么它被使用的比例为3:1,在与三磷酸的信号。

  1. 甜菜碱(最终反应浓度的0.5M到2.5M)
    甜菜碱(,N,N N-trimethylglycine),是一个两性的氨基酸类似物,减少,甚至可能消除核苷酸组成的DNA熔点的温度依赖性。它被用来作为一种添加剂,以帮助PCR扩增富含GC的目标。甜菜碱经常与DMSO相结合,可以大大提高扩增目标DNA的GC含量高的机会。

11。添加剂,以帮助在抑制剂存在的PCR

  1. 非离子型洗涤剂的功能,以抑制二级结构的形成,并有助于稳定DNA聚合酶。非离子型洗涤剂的Triton X-100,吐温20,或NP-40,如可用于反应浓度在0.1至1%,以提高扩增生产。但是,concentr1%以上的ations可能抑制PCR技术。非离子型洗涤剂的存在降低了PCR紧缩,可能导致杂散产物的形成。然而,它们的使用也将抵消抑制的SDS,DNA提取协议偶尔污染物的影响。
  2. 此外,特定的蛋白质,如牛血清白蛋白(BSA)在400 ng /μl的和/或T4基因32蛋白在150 ng /μl的援助PCR技术中存在的抑制剂,如氯化铁,氯化血红素,黄腐酸,腐植酸,单宁酸,或从粪便,淡水和海水的提取物。然而,一些PCR抑制剂,包括胆盐,胆红素,EDTA,氯化钠,十二烷基硫酸钠,或Triton X-100的,不是由BSA或T4的基因32蛋白除了缓解。

12。修改循环条件

  1. 优化退火温度将提高任何PCR反应,并应考虑与其他添加剂和/或连同其他钼结合循环条件difications。因此,以计算出最佳的退火温度采用下列公式:
    ţ1 OPT的 = 0.3 Tm 底漆 + 0.7 Tm 产品 -14.9
    使用公式对不太稳定 Tm Tm 底漆的计算公式为:
    Tm 底漆 =((△H /(△S + R x LN(C / 4)))-273.15 + 16.6日志[K +]如果ΔH是近邻杂交焓变化的总和;ΔS为总和近邻熵的变化,R为气体常数(1.99 CAL的K-1 mol-1的); C是引物浓度; [K +钾离子浓度。
    使用在以下网址中列出 Tm计算器之一,后者的公式可以计算:
    RS /融化/ sup_mat的/ servers_list.html“目标=”_blank“> http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/melting/sup_mat/servers_list.html
    Tm 产品的计算公式如下:
    Tm 产品 = 0.41(%GC)的16.6日志K + - 675/product长度
    对于大多数PCR反应,钾(K +)的浓度要达到50毫米。
  2. 热启动PCR是一种多用途的修改,在最初的变性时间显着增加( 表4)。这可以纳入循环条件的其他修改或不修改。此外,经常使用结合气质扩增形成的添加剂。事实上,热启动PCR是越来越多地纳入经常作为一般循环条件方面。热启动已经证明,以提高扩增产量,同时增加了反应的特异性和保真度。热启动PCR背后的理由是,以消除引物二聚体和非特异性的启动,可能会导致设立以下 Tm反应的后果。因此,一个典型的热启动反应的样品加热到最佳 Tm温度以上,至少到60℃前的任何放大是能够发生的。在一般情况下,DNA聚合酶反应被扣压在最初,拉长,变性时间。虽然有时省略,而不是DNA聚合酶反应的其他组成部分,在这里我们将着重对DNA聚合酶。有几种方法,使DNA聚合酶仍然无效或物理隔离,直到最初的变性期间已完成,包括使用固体蜡屏障,抗DNA聚合酶抗体,并辅助蛋白。另外,DNA聚合酶可能只是被添加到反应完成后初始变性周期。
  3. 降落PCR(TD-PCR法)打算采取的一些猜测的工作包围计算退火温度Tm值计算的局限性。这个概念是设计两个阶段的循环条件( 见表5)。第一阶段采用连续较低的退火温度每第二个周期(传统1.0℃),开始在10℃以上,并在计算 Tm整理或略低于。第二阶段采用3步的标准条件,退火温度设定在5°C以下的计算T的另外20至25个周期的 。第一阶段的功能,应减轻错配,赋予了4倍的优势,以正确的产品。因此,10个循环后,会产生410倍的优势超过任何虚假吸4096份正确的产品。
    • 降压PCR是类似的TD-PCR与在第一阶段的吸增量少。作为一个例子,第一阶段降低退火温度第二个周期由3℃,开始在10°C以上,并在2°C以下 Tm计算整理。 TD-PCR技术一样,第二阶段采用3步的标准条件,退火温度设定在5℃以下,另外20至25个周期计算 Tm。这将允许正确的产品超过256倍的优势虚假吸产品。
    • 放缓PCR是简单的TD-PCR法的修改,并已成功地放大非常富含GC(83%以上)序列( 表6)。的概念,考虑到一个相对较新的功能与现代热循环,从而使调整的斜坡速度以及冷却速度。该协议还采用直流7 GTP的减少2°结构的形成,可以抑制反应。斜坡速度降低到2.5°C间与退火周期的冷却速度为1.5°C S -1。第一阶段开始与安安退火温度为70°C,并降低退火温度1°C间,每3回合,直到它达到58°C。第二阶段,然后继续一个额外的15个循环,58℃退火温度。
  4. 巢式PCR是一种强大的工具,用来消除虚假的产品。使用嵌套引物,尤其是有帮助的,当有一个单一的基因组中的几个paralogous基因或当有一个目标序列的拷贝数低内异构人口的同源序列。基本程序包括两对引物,扩增的DNA单地区。外引物跨越部分的利息和用于生成往往在20至30次的非特异性PCR产物。一个小等份,通常约5从第50μl反应液,然后用DNA为模板,扩增另一个使用20至30轮第二组的引物退火到内部的相对位置在第一组。

其他PCR协议更加专业化,超出了本文的范围。例子包括RACE-PCR技术,多重PCR,Vectorette-PCR,定量PCR,RT-PCR技术。

13。代表结果

按照上面介绍的基本PCR协议代表PCR结果产生。结果纳入几个故障排除策略,证明反应的各种试剂和条件的影响。在这些实验中,从芽殖酵母酿酒酵母和未知分枝杆菌噬菌体的基因扩增。下文所述的所有三个实验采用标准的3步PCR协议表2所列。

成立之前都 ,基因组DNA的PCR实验酵母和的分枝杆菌噬菌体进行了量化和稀释浓度,异体瓦特之间10 4 10 7,每个反应的DNA分子。准备工作库存如下。一个基因酵母DNA的制备取得了10 4 ng /μl的。一个稀释至10 ng /μl的产生由452 TE的pH值8.0的缓冲液中加入48微升。自的S.酵母基因组约12.5 MB,10纳克含有7.41×10 5分子。基因分枝杆菌噬菌体DNA的制备,取得了313 ng /μl的。生成一个以2 ng /μl的稀释到993.6 TE的pH值8.0的缓冲液中加入6.4μL。此噬菌体DNA是大约67 KB。因此,1毫微克含有2.73×10 7的分子,这是在DNA上普遍使用的PCR限制。工作库存,然后用于产生混合主表7所列的解决方案。试验不同循环条件如下所述。

图3a中,基因组DNA, S 酵母被用来作为模板扩增GAL3基因,其中半乳糖代谢有关的蛋白质进行编码。这个实验的目的是要确定最佳的离子浓度这套试剂。无MgCl 2的是在原有的PCR缓冲液中,必须在测试范围从0.0毫米至5.0毫米表示的浓度补充。正如图中所示,PCR产物的预期大小(2098 BP)的Mg 2 +浓度为2.5毫米最佳浓度(6车道),在4.0毫米(9巷)开始出现。由制造商提供的建议浓度为1.5毫米,这是典型的PCR缓冲液中所提供的数额。也许令人惊讶的是,在这个实验中形成的产品所需的必要的浓度超过这一数额。

不同的DNA模板,用于在图3b中提出的实验。从分枝杆菌噬菌体的基因组DNA扩增一个保守的566 bp的DNA片段。像以前的实验中,最佳Mg 2 +浓度待定。 图3b所示,扩增所需的PCR产物至少需要2.0毫米的离子(车道5)。虽然有更多的MgCl 2的浓度增加,在产品形成量的变化,最PCR产物观察到4毫米,Mg 2 +的 (车道),相同的浓度为酵母GAL3基因观察。

请注意,在图3a和3b中的实验,离散频段被认为是最佳的引物退火温度的基础上使用循环条件得到。具体来说,变性温度为95°C的退火温度为61°C,扩展进行了1分钟,72℃30个循环Ç。最后5分钟的延长,然后在72°C。 图3c中的第三个实验图3c所示,在图3a是一个离散带,成为这些次优的循环条件下的非特定产品的涂抹。此外,与整体紧缩的减少反应较低的数额,镁2 +是需要形成一个扩增。

所有这三个实验表明,当Mg 2 +的浓度太低,没有扩增生产。这些结果还表明,当两个循环条件正确的设计和最佳浓度的试剂,PCR实验产生预期的大小对应一个不显眼的扩增。结果表明,在足够高的紧缩(例如,与一抹黑谨慎带)的PCR实验的重要性。此外,实验结果表明,改变一个参数可以影响另一个参数,从而影响反应的结果。

试剂 浓度的股票解决方案 体积 13X **
预混
终浓度
2 O的无菌Ĥ qs的50μL qs的650μL
PCR缓冲液 10X 5μL 65μL 1X
核苷酸的 10毫米 1μL 13μL 200微米
MgCl 2的 25毫米 3μL 39μL 1.5毫米
正向引物 20μM的= 20 pmol /μL的 1μL 13μL 20 pmol
反向引物 20μM的= 20 pmol /μL的 1μL 13μL 20 pmol
模板DNA 变量变量变量 〜10 5分子
Taq DNA聚合酶 5个/μL* 0.5μL 6.5μL 2.5个单位
50μL/反应

表1。PCR试 ​​剂的顺序应增加。

*单位可能会有所不同厂商之间的

**所有试剂加入到主混合,不含任何需要滴定或可能是可变的反应。上述表中所描述的预混计算为11反应加2个额外的反应,以确保有足够的分装到每个反应管容纳吸管转移损失。

标准的3步PCR循环
循环步骤 温度 时间 循环次数
初始变性 94°C至98°C间 1分钟 1
变性
退火
延期
94℃
5°C以下 Tm
70℃至80℃
10至60秒
30秒
扩增和DNA聚合酶依赖
25-35
最后一次延长 70&D例如,C到80°C 5分钟 1
按住 * 4℃ 1

表2。标准的3步PCR循环。

*热循环,有能力在4°C间无限期周期结束暂停。

70℃至80℃
2步PCR循环
循环步骤 温度 时间 循环次数
初始变性 94°C至98°C间 1分钟 1
变性
退火/延伸
10至60秒
扩增和DNA聚合酶依赖
25-35
最后一次延长 70℃至80℃ 5分钟 1

表3。2步PCR循环。

热启动PCR循环
循环步骤 温度 时间 周期
初始变性 - 60°C至95°C 5分钟,然后加入DNA聚合酶 1
变性
退火
延期
94℃
5°C以下 Tm
70℃至80℃
10至60秒
30秒
扩增和DNA聚合酶依赖
25-35
最后一次延长 70℃至80℃ 5分钟 1

表4。热启动PCR循环。

降落PCR骑自行车
循环步骤 温度 时间 周期
初始变性 94°C至98°C间 1
变性
退火
延期
94℃
= 10°C以上 Tm
70℃至80℃
10至60秒
30秒
扩增和DNA聚合酶依赖
2
变性
退火


延期
94℃
X - 2°C降低1°C的所有其他周期
70℃至80℃
10至60秒
30秒
扩增和聚合酶依赖
28
变性
退火
延期 94℃
5°C以下 Tm
70℃至80℃
10至60秒
30秒
扩增和DNA聚合酶依赖
20-25
最后一次延长 70℃至80℃ 5分钟 1

表5。降落PCR骑自行车。

放缓PCR循环
循环步骤 TEM温度 时间 周期
初始变性 94°C至98°C间 1分钟 1
变性
退火
延期
94℃
X°C = 10°C以上 Tm
70℃至80℃
10至60秒
30秒
扩增和聚合酶依赖
2
变性
退火


延期
94℃
X - 2°C降低1°C的所有其他周期
〜70°C至80°C *
10至60秒
30秒
一取决于mplicon和聚合酶
28
变性
退火
延期
94℃
5°C以下 Tm
70℃至80℃
10至60秒
30秒
扩增和聚合酶依赖
20-25
最后一次延长 70℃至80℃ 5分钟 1

表6。放缓PCR循环。

*斜坡速度放缓聚合酶链反应,下调至2.5°C s:依-1与退火周期的冷却速度为1.5°C S -1。

原液 体积增加至50μl反应体系 13台X酵母预混 13台X噬菌体预混 终浓度
2 O的无菌Ĥ QS到 50μL= 31μL或30.5 QS 650μL= 396.5 qs的520μL= 403微升
PCR缓冲液 10X 5μL 65μL 65μL 1X
10毫米 1μL 13μL 13μL 200微米
MgCl 2的 滴定添加到每个反应添加到每个反应添加到每个反应变量看到滴定
正向引物 20μM的= 20 pmol /μL的 1μL 13μL 13μL 20 pmol
反向引物 20μM的= 20 pmol /μL的 1μL 13μL 13μL 20 pmol
模板DNA 2 ng /μl的噬菌体或10 ng /μl的酵母 0.5μL噬菌体或1μL酵母 6.5μL 13μL 〜10 7分子噬菌体〜10 5分子酵母
聚合酶 0.5单位/μL** 0.5μL 6.5μL 6.5μL 0.5单位/反应
40μL+ 10(滴定法)μL/反应 滴定
[氯化镁2] 0.00毫米 0.5毫米 1.0毫米 1.5MM 2.0毫米 2.5毫米 3.0毫米 3.5毫米 4.0毫米 4.5毫米 5.0毫米
MgCl 2的 0.00μL 1.00μL 2.00μL 3.0μL 4.00μL 5.00μL 6.00μL 7.00μL 8.00μL 9.00μL 10.00μL
H 2 O 10.00μL 9.00μL 8.00μL 7.00μL 6.00μL 5.00μL 4.00μL 3.00μL 2.00μL 1.00μL 0.00μL

<强>表7。滴定的Mg 2 +图3中使用。

图1
图1引物和3步PCR扩增目标DNA的过程中出现的常见问题。 (一)自退火引物,造成二次发夹环结构的形成。请注意,引物并不总是退火在极​​端的两端,并可能形成小环结构。 (二)引物退火对方,而不是DNA模板,引物二聚体。一旦引物退火对方,他们将拉长引物两端。 (三)PCR循环产生特定的扩增。标准的3步PCR循环包括变性的模板DNA,引物退火和延伸目标DNA的DNA聚合酶(扩增)。

图2
图2。与REAG冰桶已废除,移液器和机架,需要一个PCR。 (1)P-200吸管,(2)移液器的P-1000,(3)的P-20吸管,(4)的P-10吸管,(5)96孔板和0.2毫升薄壁PCR管,(6)试剂,包括Taq聚合酶,10X PCR缓冲液,MgCl 2的无菌水,dNTPs浓度,引物,模板DNA,(7)1.8毫升管和机架。

图3
图3。的Mg 2 +滴定用于优化PCR实验,使用标准的3步PCR协议为例。 (一)S酵母酵母基因组DNA为模板,扩增出2098 bp的GAL3基因。在车道1 - 6,Mg 2 +浓度太低,要么是有没有形成(1-5车道)或非常小的产品形成(6车道)的产品。 7 - 11车道代表2098 bp的扩增产物的存在表明,最佳浓度的Mg 2 + PCR实验。 (二)一个uncharacteriZED分枝杆菌噬菌体的基因组DNA为模板,扩增出566 bp的扩增。 1 - 4车道,Mg 2 +浓度太低,表示产品的情况下。 5 - 11车道代表的Mg 2 +本项PCR为566 kb的扩增产品的存在表明的最佳浓度。 (三) 研究酵母酵母基因组DNA为模板,扩增出2098 bp的GAL3基因在面板显示。然而,退火温度从61℃降低到58℃,导致生产琼脂糖凝胶涂抹效果的可变长度的非特异性PCR带。车道1 - 4,Mg 2 +浓度太低,没有产品的形成。 5 - 8车道代表+本项PCR 的最佳浓度为2098 kb的扩增产物大小涂片和周围带的存在。 9 - 11车道是没有形成产品的条件过于严格的指标。 (AC)车道12是一个negatiVE的控制,不包含任何模板DNA。加载与NEB次梯巷米(标记)。

图4
图4。用于PCR使用的无菌试管。 (1)1.8 ml管(2)0.2毫升的个人薄壁PCR管,(3)0.2毫升带薄壁PCR管和瓶盖。

图5
图5。热循环仪。关闭热循环左边的图像。右边的图像包含0.2毫升薄壁PCR管放置在一个开放的热循环加热块。

Discussion

PCR技术已成为不可或缺的工具,在生物科学宝库。 PCR技术已经改变了科学课程,让生物学家产生了基因组的力量,并具有新功能的混合基因,使具体和准确的临床试验,获得进入基因组和多样性,以及简单的克隆基因作进一步的生化分析的见解。 PCR的应用是有限的,只有挥动其权力的科学家的想象力。有许多书籍和文章描述的PCR新的专门用途,并有更多的将通过开发下一代生物科学。然而,无论预期的方法,基本框架已经保持不变。聚合酶链反应,在其所有的宏伟,是在体外生成一个特定的DNA片段的大量的应用。

设计PCR实验要求的思想和耐心。在图3所示的结果,体现的主要通道之一allenges设计时的PCR优化策略。也就是说,PCR扩增作为一个参数被改变,它可能会影响另一个。作为一个例子,如果初始PCR分最佳退火温度(58℃)进行了一个最佳的Mg 2 +浓度为2.0毫米,那么其结果将产生在图3c看到涂抹。试图解决涂片可能涉及设立含有2.0毫米MgCl 2的反应PCR条件和退火温度调整到61°C。然而,在图3a可见,这不会产生任何产品。因此,它是最好的试剂,滴定,而不是加入一个集中到一个单一的反应,故障排除时,杂散结果。此外,最常见的是调整优化PCR实验的要求是改变Mg 2 +浓度和纠正的退火温度。但是,如果这些变化不减少或废除异常的结果,additi滴定VES和/或改变循环条件如表2-6中所述的协议可能会缓解这一问题。如果一切都失败了,重新设计的引物和尝试,再试一次。

Disclosures

我什么都没有透露。

Acknowledgments

特别感谢在加州大学洛杉矶分校的克里斯Reddi设立试剂和浇注凝胶和艾琳·桑德斯在加州大学洛杉矶分校的灵感,指导和支持,并校对稿件。我还想感谢吉安卡洛Costaguta和格雷戈里·S·佩恩提供酵母基因组DNA和引物放大GAL3的基因。我还想感谢Bhairav​​沙阿拍照的实验室设备和试剂用于使数字2 - 4。霍华德休斯医学研究所(HHMI的批准号:52006944),为这个项目提供了资金。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq Polymeras Sigma-Aldrich D4545-25UN
dNTPs Qiagen 201225
0.2 ml Thin Wall Tubes PCR tubes Bio-Rad 223-9469
0.2 ml Thin Wall Tube caps Bio-Rad 223-9472
EDTA disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
Trizma-HCl Sigma-Aldrich T-3253
Custom Phage Primer Invitrogen 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG
Custom Phage Primer Invitrogen 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT
Custom Yeast Primer Integrated DNA Technologies SacI-Gal3(-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG
Custom Yeast Primer Integrated DNA Technologies Gal3(1848)-SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG
Thermal Cycler Bio-Rad 170-9703 My Cycler
Agarose ISC BioExpress E-3120-500
Gel electrophoresis Hoeffer Scientific Instruments Model HE33
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S
Bio Rad Power Pack Bio-Rad 164-5050 PowerPac Basic
Gel Doc system Fotodyne Incorporated FOTO/Analyst Investigator FX Workstation

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Comments

1 Comment

  1. Thanks for the great overview of the all-important PCR procedure. I will no doubt reference it often in the future.

    I have a PCR troubleshooting question...what do to about streaking on the gel after a successful amplification? My bands are nice and bright and where they are supposed to be, but there is a heavily-streaked "path" starting at the wells and following until the end where my bands are. Is there something I can do about my PCR conditions, or the thermocycler settings? Any comments would be appreciated.

    Reply
    Posted by: Doug E.
    September 8, 2013 - 1:23 PM

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