α परीक्षण: रैपिड सेल मुक्त सीडी 4 पूरे लार का प्रयोग गणन

Published 5/16/2012
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Medicine

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Summary

एक सीडी 4 गणना विधि, α परीक्षण, वर्णित है जो पूरे लार का उपयोग करने के लिए तेजी से और सही CD4 गिनती प्रदान. α परीक्षण लागत पैसे और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, उपकरण, प्रशीतन, नमूनों के परिवहन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संग्रह और रक्त की हैंडलिंग के रूप में तकनीकी प्रशिक्षण, महंगा अभिकर्मकों के लिए की आवश्यकता eliminates.

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Bristow, C. L., Babayeva, M. A., Modarresi, R., McArthur, C. P., Kumar, S., Awasom, C., et al. The α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva. J. Vis. Exp. (63), e3999, doi:10.3791/3999 (2012).

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Abstract

Protocol

1. ताजा कार्य समाधान तैयार

  1. टीबीएस: 0.05 एम Tris खारा पीएच 7.8 (टीबीएस) के बफर. 60 मिलीलीटर टीबीएस / microplate तैयार.
  2. पीपीई: सुअर अग्नाशय इलास्टेज, टाइप 1 (पीपीई) के निलंबन के रूप में प्रदान की जाती है. अच्छी तरह से हिला और 0.01 लगभग यू / मिलीलीटर टीबीएस में पीपीई पतला. 6 मिलीग्राम / समाधान microplate काम) तैयार करें.
  3. एसए 3 NA: Succinyl - एल - आला - एल आला - एल आला पी nitroanilide (एसए 3 एनए). डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में 0.1 एम स्टॉक एसए 3 एनए समाधान तैयार है और तुरंत उपयोग या -20 डिग्री सेल्सियस की दुकान स्टॉक एसए 3 एनए समाधान / 1 टीबीएस में 100 गिराए द्वारा तैयार 6ml काम कर समाधान / microplate.
  4. COOMASSIE ब्लू: 10% Coomassie खूब R-250 टीबीएस में ब्लू (Coomassie ब्लू) के एक शेयर के समाधान तैयार है और -20 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत या दुकान का उपयोग करें टीबीएस में 1/1000 स्टॉक समाधान गिराए द्वारा 6 मिलीग्राम काम कर समाधान तैयार.

2. लार तैयार

लार संकलन: खड़े स्थिति में, लार में साइट्रिक या मुंह में गम चबाने एसिड के रूप में एक sialogogue रखकर सीरम स्त्राव को प्रोत्साहित. एक नींबू चीनी मुक्त ड्रॉप एचआईवी -1 रोगियों को जो अक्सर दन्तहीन और गम चबाना करने में असमर्थ हैं के लिए सुविधाजनक है. पहले 3 मिनट के लिए आवश्यक के रूप में निगल, और अगले 3 मिनट के लिए एक छाया कप में पूरे मुँह लार इकट्ठा. यह लार के लगभग 2 मिलीग्राम प्रदान करेगा. तुरंत का प्रयोग करें या -80 की दुकान डिग्री सेल्सियस
  • लार हैंडलिंग: जमे हुए, 37 डिग्री सेल्सियस और बर्फ पर जगह पिघलना नमूना. 2-4 पर ताजा या thawed है नमूना स्टोर डिग्री सेल्सियस अधिक नहीं 3 दिनों से. भंवर लार नहीं करो और जो कोई सीरम पीब में mucin pipetting से बचें. मानक सावधानियों का प्रयोग करें, जब लार से निपटने http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .
  • 3. Microplate सेट अप

    1. नमूनों: प्रत्येक परीक्षा के लिए अच्छी तरह से, 150 μl / अच्छी तरह से एक अंतिम मात्रा के लिए 20 μL लार जोड़ा जाता है. शुरू बुलबुले के बिना pipetting द्वारा मिश्रण.
    2. नियंत्रण: सकारात्मक नियंत्रण पीपीई शामिल हैं, लेकिन कोई लार. नकारात्मक नियंत्रण लार शामिल हैं, लेकिन कोई PPE.To सकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से 20 μL टीबीएस जोड़ा जाता है. नकारात्मक को नियंत्रित करने के लिए अच्छी तरह से 20 μL लार के जोड़ा जाता है.
    3. पीपीई ऊष्मायन: पीपीई काम कर समाधान अच्छी तरह से हिलाएँ. अच्छी तरह से नकारात्मक नियंत्रण कुओं को छोड़कर प्रत्येक के लिए 50 μL पीपीई काम कर समाधान जोड़ें. नकारात्मक नियंत्रण कुओं, 50 μL टीबीएस जोड़ें. 23 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट सेते हैं
    4. सब्सट्रेट ऊष्मायन: 50 μL एसए 3 एनए काम करने के लिए एक अच्छी तरह समाधान जोड़ें. 23 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट सेते हैं
    5. COOMASSIE ब्लू: 50 μL Coomassie ब्लू काम कर समाधान जोड़ें </ Li>
    6. पढ़ने के लिए बाहर: absorbance के microplate रीडर में पढ़ें, एक 405 एनएम एसए 3 एनए दरार है जो सक्रिय α 1 PI और 595 एनएम के लिए Coomassie ब्लू, जो प्रोटीन सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है पता लगाने का प्रतिनिधित्व करता है का पता लगाने.

    4. Α एक पीआई सूचकांक की गणना

    1. औसत एक 405 एनएम और एक 595 एनएम मानक के अनुसार: प्रत्येक तीन प्रतियों के लिए, औसत की गणना. नमूना औसत से नकारात्मक नियंत्रण औसत घटाना. थाली थाली भिन्नता को कम करने के लिए, के रूप में प्रत्येक नमूना औसत सकारात्मक नियंत्रण के औसत से विभाजित करके औसत मानक के अनुसार:

    एक समीकरण

    1. Α एक पीआई INEX की गणना: सामान्यीकृत एक 595 एनएम से 405 एनएम सामान्यीकृत फूट डालो:


    5. प्रतिनिधि परिणाम

    चाहे α परीक्षण उपयोग के लिए एक स्क्रीनिंग परीक्षा के बिंदु की देखभाल के रूप में स्थानिक, संसाधन सीमित क्षेत्रों में CD4 गिनती की निगरानी करने के लिए उपयुक्त हो सकता है निर्धारित करने के लिए प्रेरित लार 20 महिला से एकत्र किया गया था और 11 पुरुष एचआईवी -1 विषयों में भाग लेने के लिए क्लिनिक कैमरून में नियमित देखभाल. Α परीक्षण न्यूयॉर्क शहर में एकत्र लार का उपयोग कर के विकास के दौरान प्रारंभिक टिप्पणियों के साथ संगत, α 1 लार में पीआई सूचकांक CD4 गिनती (r = 0.91 = पी .०,००१. पता 2 31) के साथ सहसंबद्ध कैमरून में एकत्र. इस संबंध में 3 पैरामीटर sigmoidal वक्र जो संबंध खुराक - प्रतिक्रिया (2A चित्र) के साथ संगत है द्वारा परिभाषित किया गया था. 95% विश्वास और भविष्यवाणी अंतराल नीले और लाल लाइनों, क्रमशः (चित्रा 2B) के साथ चित्रित कर रहे हैं.

    मेंपिछले एक अध्ययन, हम निर्धारित किया है कि सीडी 4 + टी कोशिकाओं प्रदर्शन 23 आवधिकता साथ sinusoidal सायकलिंग ± एचआईवी -1 के विषयों में और α 1 पीआई (PIZZ) की कमी से 3 की विरासत संस्करण के साथ विषयों में 3.5 दिन. यहाँ चित्रित कंप्यूटर जनित एक गैर एचआईवी -1 स्वस्थ 27 दिन आवधिकता (चित्रा 3A) का प्रदर्शन नियंत्रण में साइकिल सीडी 4 साइन वक्र विश्लेषण का एक प्रतिनिधि उदाहरण है.

    कंप्यूटर जनित सीडी 4 साइन वक्र विश्लेषण + 6 विषयों में टी सेल में परिवर्तन शिखर करने के लिए पीक और 3 दोलन के आयाम अक्ष के लिए मानों झुकेंगे. के रूप में की उम्मीद होगी, दोलन आयाम (आर 2 = 0.96, पी 0.009 =, n = 6) (3B चित्रा) की धुरी के साथ सहसंबद्ध था. रोगियों में कम सीडी 4 टी होगा + कोशिकाओं की गिनती, CD4 टी कोशिकाओं की संख्या में चक्रीय परिवर्तन छोटे थे, और उच्च सीडी 4 + टी कोशिकाओं की गिनती के साथ रोगियों में, चक्रीय परिवर्तन बड़े थे.

    क्योंकिप्रतिगमन चित्रा 2 में दर्शाया लाइन का अनुमान आयाम कंपन और दोलन की धुरी का अक्ष के साथ सहसंबद्ध है, के कारण भिन्न आयाम प्रतिगमन लाइन जिससे आकलन ऊपर कितनी दूर और नीचे प्रतिगमन लाइन सीडी 4 + टी कोशिकाओं की उम्मीद होगी के लिए गणना की जा सकती है साइकिल चालन (चित्र 3C). चित्रा 3C और विश्वास अंतराल चित्र 2B में गणना में गणना आयाम एक छवि, यह पाया गया कि आयाम (ग्रीन लाइन) 95% के भीतर निहित विश्वास अंतराल (नीली रेखा) (चित्रा 3 डी).

    चित्रा 1
    आकृति 1. जगह मुंह में साइट्रिक एसिड और लार इकट्ठा: प्रक्रिया सारांश. तीन प्रतियों में एक microplate के कुओं पतला लार जोड़ें. एक अच्छी तरह से जोड़ें पीपीई और 23 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए सेते हैं पीपीई सब्सट्रेट एक अच्छी तरह से जोड़ें और 23 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए सेते हैं. Coomassie ब्लू जोड़ें और 405 एनएम पर पढ़ने के लिए पीपीई गतिविधि का पता लगाने और 595 एनएम में प्रोटीन का पता लगाने के लिए.

    चित्रा 2
    चित्रा 2. Α - परीक्षण की मानक सीडी 4 गणना विधि के साथ तुलना करें. ए) α परीक्षण प्रेरित पूरे मुँह लार में α 1 पीआई सूचकांक quantitating द्वारा प्रदर्शन किया गया था. CD4 गिनती एक स्वतंत्र चिकित्सा मानक प्रवाह cytometry का उपयोग कर प्रयोगशाला द्वारा प्रदर्शन किया गया. प्रवाह cytometry के लिए रक्त और लार में एक ही क्लिनिक यात्रा पर एकत्र किए गए. α 1 पीआई सूचकांक और CD4 गिनती के बीच संबंध 3 पैरामीटर sigmoidal (नि. 2 0.91 = पी .0001 <n, 31 =) वक्र). बी 95% विश्वास और भविष्यवाणी अंतराल नीले और लाल रंग में चित्रित कर रहे हैं द्वारा परिभाषित किया गया लाइनों क्रमशः.

    चित्रा 3
    चित्रा 3. सीडी 4 ग की गणना की शुद्धताα1PI Index.A का उपयोग ounts) सीडी 4 + टी कोशिकाओं गैर एचआईवी -1 स्वस्थ नियंत्रण में 27 दिन आवधिकता के साथ sinusoidal साइकिल चालन का प्रदर्शन किया. दोलन की धुरी में दिखाया गया है (लाल बिंदीदार रेखा)) कम्प्यूटर सीडी 4 टी सेल साइकिल चालन के लिए चार एचआईवी - 1 विषयों में पीक करने के लिए पीक और दोलन के आयाम अक्ष की गणना के लिए इस्तेमाल किया गया था, 1 एचआईवी गैर उत्पन्न साइन लहर विश्लेषण बी -1 PIzz विषय, और गैर एचआईवी -1 स्वस्थ भाग ए में सीडी 4 के बीच संबंधों को दर्शाया नियंत्रण + टी सेल आयाम और दोलन की धुरी 3 पैरामीटर sigmoidal वक्र (आर 2 = 0.96, पी = .009, एन द्वारा परिभाषित किया गया था = 6). सी) और दोलन के आयाम और अक्ष के बीच sigmoidal संबंध बी हिस्सा) में प्राप्त करने के लिए चित्रा 2 से प्रतिगमन लाइन (काला लाइन) के साथ अंक की उम्मीद आयाम (हरे रंग की लाइनों) की गणना के लिए इस्तेमाल किया गया था डी) उम्मीद आयाम. अंतराल (हरे रंग की लाइनों) 95% विश्वास अंतराल से काफी अलग था (नीला) लाइनों के रूप में मान व्हिटनी दरजा Sum टेस्ट और आयाम लाइन और प्रतिगमन रेखा (37 कोशिकाओं के बीच में बीच का अंतर (95% विश्वास अंतराल और प्रतीपगमन रेखा (63 कोशिकाओं / μl के बीच बीच का अंतर की तुलना के आधार पर) द्वारा निर्धारित μl /), पी 0.001 =).

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    Discussion

    Undiluted सीरम मंझला 36 माइक्रोन α 1 PI और 3.6 α 22 एम) macroglobulin माइक्रोन एक 10 गुना 8 अंतर. दोनों प्रोटीन पीपीई के लिए बाध्य करने के लिए प्रतिस्पर्धा. इन दो विशेषताओं, एकाग्रता और पीपीई आत्मीयता, के लिए एक तरीका है कि विशेष रूप से α 2 8 एम प्रतिस्पर्धा की उपस्थिति में सामान्य सीरम में α 1 पीआई मापने के लिए सक्षम है विकसित किया गया शोषण किया है. 0.3% सीरम में इस विधि के रूप में छोटा रूप में 50 एनएम μ 1 पीआई का पता लगा सकते हैं. 2.5% की एक सीरम कमजोर पड़ने पर, α 2 पीपीई एम के बंधन से undetectable हो जाता है, और इस कमजोर पड़ने के बारे में 900 α 1 PI और 90 α 2 एम एनएम एनएम

    सीरम जो 10 गुना अधिक α 1 पीआई से α 2 एम, पूरे मुँह लार एक 20 गुना 9 अंतर होता है से बना है के विपरीत. हम वर्तमान अध्ययन में पाया कि undiluted, उत्तेजित लारलगभग 30 गुना कम सीरम या एनएम 1200 लगभग α एक पीआई से α 1 पीआई होता है और लगभग 60 एनएम α 2 एम शामिल करने के लिए उम्मीद की होगी α परीक्षण के लिए इष्टतम लार कमजोर पड़ने के लिए प्रेरित लार 13% हो पाया था, और यह कमजोर पड़ने के लिए लगभग 160 एनएम शामिल करने के लिए उम्मीद की होगी α 1 PI और 8 है α 2 एम, α 2 एम की एक एकाग्रता है कि सीमा से नीचे है एनएम प्रोटोकॉल में पता लगाने की. Α एम के 2 कम एकाग्रता के कारण, यह संभव है करने के लिए सही α एम. से 2 प्रतियोगिता के लिए चिंता के बिना लार में α 1 पीआई की विशिष्ट गतिविधि का निर्धारण सक्रिय α 1 PI और लार में प्रोटीन सामग्री की माप α 1 पीआई सूचकांक जो CD4 गिनती, प्रवाह cytometry को मापने के लिए मानक विधि के साथ सहसंबंधी पाया गया था की गणना की अनुमति दी. महत्वपूर्ण बात, प्रतीपगमन विश्लेषण के परिणाम (नि.

    सीडी 4 गणना तरीकों पहले ध्यान में भिन्नता है कि साइकिल चालन के कारण नहीं लिया है. व्यावहारिक दृष्टि से, CD4 गिनती के रूप में ज्यादा के रूप में 200 कोशिकाओं / नादिर और शीर्ष के बीच 23-27 दिनों की आवधिकता के साथ μl से भिन्न है, और यह सच मापने सीडी 4 + टी कोशिकाओं 3 के लिए विधि की परवाह किए बिना. इस प्रकार, साइन लहर अक्ष दोलन की एक और अधिक सटीक उपाय एक व्यक्ति की सही सीडी 4 + टी सेल गिनती एक ही दिन के उपाय से प्रदान करता है क्योंकि दोलन की धुरी घंटे के लिए सप्ताह सप्ताह से लगातार घंटा है. जबकि यह सीधे एक व्यक्ति की सीडी 4 + टी कोशिकाओं के लिए दोलन की धुरी को मापने के लिए संभव नहीं हो सकता है, यह CD4 गिनती में अनुदैर्ध्य सीडी 4 के एक औसत + टी सेल मायने रखता है के रूप में भिन्नता के रूप में लंबे समय का उपयोग करने की उम्मीद आयाम से अधिक नहीं करने के लिए अनुमान लगाया जा सकता है. बड़ी भिन्नताCD4 गिनती में साइकिल चालन से अन्य चर के प्रभाव का संकेत होगा.

    चित्रा 2 में चित्रित प्रतिगमन लाइन दोलन की धुरी का एक अनुमान है. प्रतीपगमन रेखा के ऊपर और नीचे की उम्मीद आयाम की गणना से पता चला है कि आयाम 95% विश्वास अंतराल के भीतर निहित है. 95% विश्वास अंतराल और प्रतिगमन लाइन के बीच बीच का अंतर 63 कोशिकाओं CD4 / μl है, और आयाम और प्रतिगमन लाइन के बीच बीच का अंतर 37 कोशिकाओं CD4 / μl है. यह मतलब है कि सीडी 4 का 95% α परीक्षण माप से गणना मायने रखता है 63 लगभग कोशिकाओं CD4 / वास्तविक CD4 गिनती से μl भीतर और है कि इस अंतर का लगभग 58% की सीडी 4 साइकिल चालन के कारण होगा होगा व्याख्या की जा सकती है. इस प्रकार, α परीक्षण की परिशुद्धता विश्वास अंतराल और आयाम है जो कोशिकाओं / μl लगभग 26 सीडी 4 के बीच की दूरी है, और α परीक्षण की सटीकता सहसंबंध coefficieNT के प्रतिगमन लाइन जो 0.95 या 95% है.

    Α परीक्षण के रूप में यहाँ वर्णित करने के लिए कई सीमाएं हैं, लेकिन समाधान आसानी से उपलब्ध हैं. उदाहरण के लिए, भले ही वर्णित α परीक्षण एक microplate स्वरूप का उपयोग करता है, α परीक्षण एक एकल लार कमजोर पड़ने का उपयोग कर प्रदर्शन करने की क्षमता के परीक्षण α डिपस्टिक प्रौद्योगिकी, एक साधन मुक्त, तकनीकी रूप से सरल प्रणाली के साथ इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है. कैमरून में एकत्र लार के नमूने का लगभग 2% भी हेरफेर करने के लिए चिपचिपा थे, और यह न्यूयॉर्क शहर में एकत्र की लार के साथ संगत है. DNase के ऐसे नमूने के आवेदन करने के लिए जिससे 10 माप की अनुमति चिपचिपापन उन्नति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. एक अतिरिक्त समाधान के के pharmacologic sialagogues है कि विशेष रूप से में parasympathetic बनाम सहानुभूति जिससे पानी लार के उत्पादन मार्ग के माध्यम से लार के स्राव को प्रोत्साहित करने के लिए उपयोग हो सकता है. ऐसा ही एक sialagogue 11 pilocarpine है. अंत में, α परीक्षण नहींटी अभी तक मान्य किया गया है और यह तय है कि प्रदर्शन सीडी 4 12 की गिनती के महत्वपूर्ण स्तर के लिए पर्याप्त भेदभावपूर्ण है आवश्यक है.

    CD4 गिनती के महत्वपूर्ण स्तर sigmoidal प्रतिगमन वक्र है जो इन मूल्यों को एक रेखीय एल्गोरिथ्म द्वारा की गणना की अनुमति के रेखीय क्षेत्र में हैं. इस जनसंख्या में, मूल्यों के लिए रेखीय प्रतिगमन <860 सीडी 4 कोशिकाओं / μl (r 2 0.86 = n = 30, पी <2x10 -7) के रूप में sigmoidal प्रतिगमन (r 2 के रूप में अच्छा था 0.88 = n = 30, पी < .०००१). α 1 ऊपर 67 पीआई सूचकांक है जो लगभग 350 कोशिकाओं CD4 / μl (r 2 0.88 = n = 15, पी 0.002 =) के रूप में sigmoidal प्रतिगमन (आर 2 0.89 = n = 15 के रूप में अच्छा करने के लिए संगत के लिए रेखीय प्रतिगमन, p .०००१ <). हालांकि, सह α 1 नीचे 67 पीआई सूचकांक जो <350 सीडी 4 करने के लिए corresponded में महत्वपूर्ण नहीं था कोशिकाओं / μl (r 2 = 0.17, पी 0.54 = एन = 15). यह डब्ल्यू के बाद से एक महत्वपूर्ण मूल्य हैहो दिशानिर्देश CD4 गिनती कोशिकाओं <350 सीडी 4 / μl 13 एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी के लिए उपयोग के लिए अर्हता प्राप्त करने के लिए सलाह देते हैं. Α-परीक्षण के प्रदर्शन को बेहतर ढंग से निर्धारित किया गया है और कम मूल्यों पर संवेदनशीलता पर सुधार करने के लिए, एक अतिरिक्त 800 लार के नमूने 4 समूहों से कैमरून में एकत्र: नवजात शिशुओं-2 yrs, 3-5 yrs और 6-15 yrs के और 16 yrs बड़े और.

    अंत में, α परीक्षण physiologically रक्त में सीडी 4 कोशिकाओं की संख्या के लिए प्रासंगिक है अभी तक लार जिससे एक noninvasive, स्थानिकमारी वाले क्षेत्रों में CD4 गिनती की निगरानी के लिए कोई उपकरण के साथ एक सही और सटीक बिंदु का ध्यान विधि प्रदान का उपयोग किया जा सकता है लागत - प्रति - परीक्षण है कि एक डॉलर से कम है.

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    Disclosures

    ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

    Acknowledgements

    अनुसंधान हैरी विंस्टन रिसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sialogogue, 0.05M citric acid Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 Sugar-Free Lemon dropS
    Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 E1250
    Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide Sigma-Aldrich S4760
    Coomassie Brilliant Blue R-250 Sigma-Aldrich B7920
    Tissue culture-treated, 96 well microplates Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 35-3072
    Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 Dynex P97277

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    References

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