Α-מבחן: ראפיד נייד ללא ספירת CD4 באמצעות הרוק שלם

Published 5/16/2012
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Medicine

Your institution must subscribe to JoVE's Medicine section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

שיטת ספירת CD4, α-הבדיקה, מתואר אשר עושה שימוש הרוק כולו לספק מהיר ומדויק ספירת CD4. את α-הבדיקה עולה פרוטות ומונע את הצורך טכניים, חומרים כימיים אימונים יקרים כגון נוגדנים חד שבטיים, מכשור, קירור, הובלה של דגימות, וכן איסוף וטיפול של דם.

Cite this Article

Copy Citation

Bristow, C. L., Babayeva, M. A., Modarresi, R., McArthur, C. P., Kumar, S., Awasom, C., et al. The α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva. J. Vis. Exp. (63), e3999, doi:10.3791/3999 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protocol

1. להכין פתרונות עבודה טריים

  1. כפות: 0.05 מ 'טריס בופר pH מלוחים, 7.8 (TBS). הכן 60 מ"ל כפות / microplate
  2. PPE: elastase חזירי הלבלב, סוג 1 (PPE) הוא כאמור ההשעיה. לנער היטב לדלל PPE ב TBS בכ 0.01 U / ml. הכן 6 מ"ל עובדים פתרון / microplate).
  3. SA 3 NA: Succinyl-L-ALA-L-L-ALA-ALA-P-nitroanilide (SA 3 NA). להכין 0.1 מ 'מניות SA 3 פתרון NA ב sulfoxide דימתיל (DMSO) ולהשתמש באופן מיידי או לשמור ב -20 ° C. הכן את הפתרון עובד microplate 6ml / ידי דילול המניות SA 3 פתרון NA 1/100 ב TBS.
  4. COOMASSIE כחול: הכן פתרון מלאי של 10% Coomassie בריליאנט בלו R-250 (Coomassie כחול) ב TBS ולהשתמש באופן מיידי או בחנות ב -20 ° C. הכן 6 הפתרון עובד מ"ל ידי דילול המניות פתרון 1/1000 ב TBS.

2. הכן את הרוק

אוסף רוק: במצב עמידה, לעורר דיות סרום לתוך הרוק על ידי הנחת sialogogue כגון חומצת לימון או מסטיק בפה. ירידה ללא סוכר לימון נוח HIV-1 מטופלים שאינם edentulous לעתים קרובות מסוגלים ללעוס מסטיק. לבלוע לפי הצורך דקות 3 1, ולאסוף רוק בפה כל לכוס כתרים דקות 3 הבא. זה יספק כ 2 מ"ל של רוק. להשתמש מיד או לאחסן ב -80 ° C.
  • טיפול בתוצרת הרוק: אם הדגימה קפוא, הפשרה על 37 מעלות צלזיוס ומניחים על קרח. אחסן הדגימה טרי או מופשר ב 2-4 מעלות צלזיוס ולא יותר מ -3 ימים. האם הרוק לא מערבולת ולהימנע pipetting mucin אשר אינו מכיל exudate בסרום. אמצעי זהירות רגילים להשתמש במהלך הטיפול בו רוק http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .
  • 3. Microplate Set-up

    1. דוגמאות: במבחן זה היטב, מוסיפים 20 רוק μL עבור נפח סופי של μl 150 / היטב. מערבבים ידי pipetting ללא החדרת בועות.
    2. CONTROLS: שליטה חיובית מכיל PPE, אבל לא רוק. הביקורת השלילית מכיל רוק, אבל לא PPE.To הביקורת החיובית גם הוא הוסיף 20 כפות μL. שליטה שלילי גם הוא הוסיף 20 רוק μL.
    3. דגירה PPE: נער פתרון PPE עובד היטב. הוסף 50 μL פתרון PPE עבודה זה גם לא כולל את בארות שליטה שליליות. כדי בארות שליטה שליליות, מוסיפים 50 כפות μL. דגירה 10 דק 'ב 23 ° C.
    4. דגירה תשתית: הוסף 50 μL SA 3 פתרון NA פועלים היטב כל אחד מהם. דגירה 45 דק 'ב 23 ° C.
    5. COOMASSIE כחול:. הוסף 50 הפתרון μL Coomassie כחול עובד < / Li>
    6. לקריאה מתוך: קרא ספיגת ב microplate הקורא, 405 ננומטר לזהות SA 3 המחשוף NA המייצג פעיל α 1 PI ו 595 ננומטר לזהות Coomassie כחול המייצג את תכולת החלבון.

    4. חישוב α 1 אינדקס PI

    1. לנרמל את בממוצע 405 ננומטר ננומטר 595: עבור כל אחד בשלושה עותקים, לחשב את הממוצע. הפחת הממוצע בקרה שלילית מממוצע הדגימה. כדי למזער את הצלחת אל הצלחת השינוי, לנרמל את הממוצעים על ידי חלוקת כל הממוצע הדגימה בממוצע הביקורת חיובית באופן הבא:

    משוואה 1

    1. חישוב 1 α לצרכן INEX: מחלקים את מספר מנורמל 405 ננומטר על ידי כמה לנורמליזציה 595 ננומטר:

    "Jove_content"> משוואה 2

    5. נציג תוצאות

    כדי לקבוע אם α בדיקה יכול להיות מתאים לשימוש כמבחן נקודה של טיפול הקרנה לעקוב אחר ספירת מסוג CD4 ב אנדמיים, משאבים מוגבלים לאזורים, רוק מגורה נאסף נקבה 20 ו 11 גברים HIV-1 נושאים המרפאה השתתפות עבור שגרת טיפול בקמרון. עולה בקנה אחד עם תצפיות ראשוניות במהלך הפיתוח של הבדיקה-α באמצעות רוק שנאספו בעיר ניו יורק, 1 α אינדקס לצרכן ברוק אסף בקמרון מתואם עם ספירת CD4 (r 2 = 0.91, p <0.0001. N = 31). יחסים הוגדר על ידי עקומת 3-פרמטר sigmoidal אשר עולה בקנה אחד עם יחסים מנה תגובה (איור 2 א). ביטחון 95% ו מרווחי חיזוי מתוארים בקווים כחולים ואדומים, בהתאמה (איור 2 ב).

    בתוךמחקר קודם, קבענו כי CD4 + ותאי T התערוכה אופניים סינוסי עם מחזוריות 23 ± 3.5 ימים ב-HIV-1 נושאים ו בנבדקים עם הגרסה בירושה של α 1 PI חסר (משתין) 3. במסמך זה מתוארת היא דוגמה מייצגת של המחשב שנוצר על ניתוח עקומת הסינוס של CD4 רכיבה על השליטה הלא HIV-1 בריאה מציג 27 מחזוריות היום (איור 3 א).

    מחשב שנוצר עקומת הסינוס ניתוח מסוג CD4 + את השינויים תא ה-T ב 6 נושאים הניב ערכי המשרעת שיא אל שיא ציר תנודה 3. כפי שניתן היה לצפות, ציר של תנודה היתה בקורלציה עם משרעת (r 2 = 0.96, p = 0.009, n = 6) (איור 3 ב). בחולים יהיה CD4 + T נמוך ספירת תאים, שינויים מחזוריים ספירת תא T מסוג CD4 היו קטנים, ובחולים עם CD4 גבוהות + ספירות טי סלולריים, שינויים מחזוריים גדולים.

    כיקו רגרסיה מתואר באיור 2 מעריכה את ציר התנודה ואת ציר תנודה מתואם עם אמפליטודה, משרעת ניתן לחשב את קו הרגרסיה ובכך להעריך כמה רחוק מעל ומתחת קו רגרסיה מסוג CD4 + ותאי T צפויה להשתנות בהתאם רכיבה על אופניים (איור 3 ג). שכיסה משרעת מחושב איור 3 ג ו רווח סמך חישוב 2B איור, נמצא כי משרעת (הקו הירוק) נמצא במרחק 95% רווח בר סמך (הקו הכחול) (איור 3D).

    איור 1
    באיור 1. סיכום הליך: חומצה ציטרית מקום בפה לאסוף רוק. הוסף הרוק בדילול מלא לבארות של microplate בשלושה עותקים. הוסף PPE זה טוב דגירה של 15 דקות בשעה 23 ° C. מוסיפים את המצע PPE זה טוב דגירה של 45 דק 'ב 23 ° C. הוסף Coomassie כחול ולקרוא על 405 ננומטר לאתר פעילות PPE ובו 595 ננומטר לזהות חלבון.

    איור 2
    איור 2. השוואה בין מבחן α עם שיטת ספירת CD4 רגיל. א) α-הבדיקה בוצעה על ידי quantitating אינדקס 1 α לצרכן ברוק מגורה כל הפה. ספירת CD4 בוצעו על ידי מעבדה רפואית עצמאית באמצעות cytometry זרימה רגילה. דם cytometry זרימת ורוק נאספו בכל ביקור במרפאה אחת. הקשר בין מדד 1 PI α ואת ספירת CD4 הוגדר על ידי עקומת 3-פרמטר sigmoidal (r 2 = 0.91, p <0.0001, N = 31). ב) 95% ו מרווחי חיזוי מתוארים כחול ואדום השורות, בהתאמה.

    איור 3
    איור 3. הדיוק של חישוב CD4 גounts באמצעות Index.A α1PI) מסוג CD4 + T תאים הציג אופניים סינוסי עם מחזוריות 27 יום בשליטה ללא HIV-1 בריא. ציר של תנודה מתואר (קו מקווקו אדום). ב ') באופן מחשב גל סינוס ניתוח של רכיבה על אופניים T מסוג CD4 התא ששימש לחישוב את המשרעת שיא אל שיא ציר התנודה ב -4 HIV-1, 1 נושאים שאינם ב-HIV -1 נושא משתין, ואת אי - HIV-1 הביקורת הבריאה המתואר חלק א 'הקשר בין CD4 + T משרעת התא ציר תנודה הוגדר על ידי עקומת 3-פרמטר sigmoidal (r 2 = 0.96, p = 0.009, n = 6). ג) הקשר בין sigmoidal משרעת ציר תנודה נגזר בין השאר ב ') נעשה שימוש כדי לחשב את האמפליטודה הצפויה (קווים ירוקים) של נקודות לאורך קו הרגרסיה (קו שחור) מ באיור 2. D) משרעת הצפוי מרווח (קווים ירוקים) היה שונה באופן משמעותי מרווח ביטחון של 95% (קווים כחולים) כפי שנקבע על ידי מבחן ויטני דרגה סכום מאן (על בסיס השוואה של ההפרש הממוצע בין מרווח ביטחון של 95% קו רגרסיה (63 תאים / μl) ואת ההבדל הממוצע בין קו משרעת קו רגרסיה (37 תאים / μl), p = 0.001).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    הסרום מכיל חי חציון 36 מיקרומטר α 1 PI ו 3.6 מיקרומטר α 2 macroglobulin (α 2 מ ') 10 הפרש של פי 8. שני חלבונים להתחרות על קשירה PPE. שני מאפיינים אלה, הריכוז PPE זיקה, נוצלו לפתח שיטה כי הוא מסוגל במיוחד למדידת α 1 PI בסרום נורמלי בנוכחות מתחרים α 2 מ '8. שיטה זו יכולה לזהות קטנה כמו 50 μ nM 1 PI בנסיוב 0.3%. בדילול בסרום של 2.5%, מחייב של 2 מ 'α כדי PPE הופך בלתי ניתן לגילוי, וגם דילול זה מכיל כ -900 ננומטר α 1 לצרכן ו 90 ננומטר α 2 יג

    בניגוד סרום המורכבת של פי 10 PI יותר מ 1 α α 2 מ ', רוק בפה כולה מכילה 20 הבדל של פי 9. מצאנו במחקר הנוכחי, כי חי, רוק מגורהמכיל כ 30 פי לצרכן פחות מ 1 α בסרום או כ 1200 ננומטר α 1 ו PI יהיה צפוי להכיל כ 60 ננומטר α 2 יג דילול רוק אופטימלי עבור מבחן α נמצאה רוק מגורה 13%, וזה הדילול יהיה צפוי להכיל כ 160 ננומטר α 1 PI ו -8 nM α 2 מ ', ריכוז של 2 מ' α, כי הוא מתחת לסף הגילוי בפרוטוקול. בשל הריכוז הנמוך של α 2 מ ', ניתן לקבוע במדויק את הפעילות הספציפי של PI 1 α ברוק ללא חשש לתחרות בין α 2 מ' מדידות של פעילות α 1 PI ואת תכולת החלבון ברוק אפשרה חישוב של מדד לצרכן 1 α שנמצא לתאם עם שיטה סטנדרטית למדידת מסוג CD4 חשובה, cytometry זרימה. חשוב לציין, את התוצאות של ניתוח רגרסיה (r

    מסוג CD4 שיטות ספירה לא נקטו בעבר בחשבון את השינוי, כי הוא עקב רכיבה על אופניים. במונחים מעשיים, ספירת CD4 יכול להשתנות כמו 200 תאים / μl בין נאדר איפקס עם מחזוריות של 23-27 ימים, וזה נכון ללא קשר לשיטה למדידת CD4 + T תאים 3. לכן, גל סינוס ציר תנודה מספק מדד מדויק יותר של CD4 האמיתיים של האדם + T ספירת תאים מאשר מידה של יום בודד, כי ציר תנודה הוא קבוע משעה לשעה, משבוע לשבוע. אמנם זה לא יכול להיות אפשרי למדוד באופן ישיר את ציר תנודה של CD4 + של בודדים ותאי T, זה ניתן להעריך באמצעות האורך הממוצע של CD4 + T תא ספירת כל עוד וריאציה ספירת CD4 אינו עולה על האמפליטודה הצפויה. גדול וריאציהים של ספירת CD4 היה מציין את ההשפעה של משתנים אחרים מאשר רכיבה על אופניים.

    קו רגרסיה מתואר באיור 2 הוא אומדן של הציר של תנודה. חישוב המשרעת לצפות מעל ומתחת לקו הרגרסיה הראה כי אמפליטודת נמצא בתוך רווח הסמך 95%. ההבדל הממוצע בין מרווח ביטחון של 95% קו רגרסיה הוא 63 תאים מסוג CD4 / μl, ואת ההבדל בין חציון המשרעת ואת קו הרגרסיה הוא 37 תאים מסוג CD4 / μl. זה יכול להתפרש במובן של 95% CD4 הרוזנים לחשב את α-Test מדידות יהיה בתוך כ 63 תאים מסוג CD4 / μl מן ספירת CD4 עצמם, וכי כ 58% הבדל זה יהיה עקב רכיבה על אופניים CD4. לפיכך, הדיוק של הבדיקה-α הוא המרחק בין רווח הסמך לבין המשרעת המהווה כ 26 תאים מסוג CD4 / μl, ואת רמת הדיוק של הבדיקה-α הוא coefficie קשרNT של קו הרגרסיה שהוא 0.95 או 95%.

    ישנן מספר מגבלות על הבדיקה α, כמתואר להלן, אבל פתרונות זמינים. לדוגמה, אף על פי α בדיקה תיאר משתמש בתבנית microplate, את היכולת לבצע α בדיקה באמצעות דילול רוק יחיד מאפשר בדיקה α-לשימוש עם טכנולוגיית dipstick, מכשיר חינם, מערכת פשוטה טכנולוגית. כ 2% של דגימות רוק שנאספו בקמרון היו צמיגי מדי כדי לתפעל, וזה עולה בקנה אחד עם הרוק אסף בניו יורק. היישום של DNase קטעים כאלה יכולים לשמש כדי לשפר צמיגות ובכך המתיר מידה 10. פתרון נוסף עשוי להיות השימוש sialagogues תרופתי ספציפית לעורר הפרשת הרוק דרך מסלול הפאראסימפתטית מול אוהד ובכך לייצר רוק מימי. אחד כזה הוא sialagogue pilocarpine 11. לבסוף, α-test איןעדיין לא אומתו, ואת זה צריך לקבוע אם ביצועי מפלה מספיק על רמות קריטיות של ספירת CD4 12.

    רמות קריטיות של ספירת CD4 הם באזור הליניארי של עקומת רגרסיה sigmoidal שאיפשר את הערכים הללו כדי להיות מחושב על ידי אלגוריתם ליניארי. באוכלוסייה זו, רגרסיה ליניארית של ערכי תאים מסוג CD4 <860 / μl (r 2 = 0.86, N = 30, p <2x10 -7) היה טוב כמו רגרסיה sigmoidal (r 2 = 0.88, N = 30, p < 0.0001). רגרסיה ליניארית של אלפא 1 מדדי לצרכן מעל 67 אשר תואמים את כ 350 CD4 תאים / μl (r 2 = 0.88, N = 15, p = 0.002) היה טוב כמו רגרסיה sigmoidal (r 2 = 0.89, N = 15, p <0.0001). עם זאת, הקשר לא היה משמעותי על אלפא 1 מדדי לצרכן מתחת 67 אשר תואם את CD4 <350 תאים / μl (r 2 = 0.17, P = 0.54, N = 15). זהו ערך קריטי מאז Wהנחיות הו ממליץ ספירת CD4 <350 תאים מסוג CD4 / μl להעפיל גישה לטיפול תרופתי 13. כדי לקבוע טוב יותר את הביצועים של הבדיקה-α ולשפר את הרגישות על ערכים נמוכים יותר, תוספת של 800 דגימות רוק הם נאספים בקמרון בין 4 קבוצות: תינוקות, 2 yrs, 3-5 ו 6-15 yrs yrs ו 16 yrs ומעלה.

    לסיכום, α-מבחן רלוונטי מבחינה פיזיולוגית למספר תאים מסוג CD4 בדם עדיין יכול להתבצע באמצעות הרוק ובכך לספק פולשני, מדויק מדויק לנקודה של טיפול בשיטה לניטור מסוג CD4 ספירת באזורים אנדמיים עם מכשור ללא עלות הבדיקה היא פחות מדולר.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    אין ניגוד עניינים הצהיר.

    Acknowledgements

    המחקר נתמך על ידי קרן המחקר הארי וינסטון.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sialogogue, 0.05M citric acid Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 Sugar-Free Lemon dropS
    Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 E1250
    Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide Sigma-Aldrich S4760
    Coomassie Brilliant Blue R-250 Sigma-Aldrich B7920
    Tissue culture-treated, 96 well microplates Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 35-3072
    Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 Dynex P97277

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study. Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).
    2. Lapidot, T., Petit, I. Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells. Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).
    3. Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection. Alfano, M. Bentham Science Publishers. (2010).
    4. Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).
    5. Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease. PLoS One. Forthcoming (2011).
    6. de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review. J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).
    7. Edgar, W. M. Saliva: its secretion, composition and funcitons. Br. Dent. J. 172-305 (1992).
    8. Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus. Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).
    9. Pederson, E. D. Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease. Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).
    10. Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum. PNAS. 87, 9188-9192 (1990).
    11. LeVeque, F. G. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients. J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).
    12. Stevens, W. Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries. Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).
    13. WHO. 2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map. Available from: http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html (2010).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Video Stats