Die α-Test: Rapid Zellfreie CD4-Zählung mit ganzen Speichel

Published 5/16/2012
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Medicine

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Summary

Eine Aufzählung CD4-Methode, die α-Test, beschrieben, nutzt ganzen Speichel auf eine schnelle und genaue CD4-Werten geben. Die α-Test kostet Pfennige und eliminiert die Notwendigkeit für technische Schulungen, teure Reagenzien wie monoklonale Antikörper, Mess-, Kälte-, Transport der Proben, sowie Sammlung und Handhabung von Blut.

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Bristow, C. L., Babayeva, M. A., Modarresi, R., McArthur, C. P., Kumar, S., Awasom, C., et al. The α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva. J. Vis. Exp. (63), e3999, doi:10.3791/3999 (2012).

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Abstract

Es besteht ein dringender Bedarf an erschwinglichen CD4-Enumeration, um HIV-Erkrankung zu überwachen. CD4-Zählung ist außerhalb der Reichweite in Regionen mit begrenzten Ressourcen aufgrund der Zeit und Temperatur Einschränkungen, technische Raffinesse, und die Kosten für Reagenzien, insbesondere monoklonale Antikörper gegen CD4 auf Blutzellen, die einzige derzeit akzeptable Methode zu messen. Eine häufig verwendete kostengünstige und zeitsparende Labor Strategie ist es, zu berechnen, anstatt Maßnahme bestimmte Blutwerte. Zum Beispiel werden LDL-Spiegel unter Verwendung der gemessenen Werte von Gesamtcholesterin, HDL und Triglyceride 1. Somit zählt Identifizierung von zellfreien korreliert, die direkt regulieren die Anzahl der CD4 + T-Zellen konnte eine genaue Methode zur Berechnung CD4 bereitzustellen aufgrund der physiologischen Bedeutung der korreliert.

Die Anzahl der Stammzellen, die Blut eintreten und bestimmt zu werden zirkulierender CD4 + T-Zellen wird durch das Chemokin CXCL12 einer bestimmtennd seinen Rezeptor CXCR4 durch ihren Einfluss auf die Fortbewegung 2. Verfahren nach Stammzellen Bewegung in Blut wird zusätzlich durch Zelloberfläche menschliche Leukozyten-Elastase (HLE CS) und dem HLE CS-reaktiven aktiven α 1-Proteinase-Inhibitor1 PI, α 1-Antitrypsin, SERPINA1) 3 geregelt. In HIV-1-Erkrankung, ist α 1 PI inaktiviert durch Krankheitsprozesse 4. In den frühen Gruppen von asymptomatischen HIV-1 Erkrankung, wurde die aktive α 1 PI zufolge unter werden in 100% der unbehandelten HIV-1-Patienten (M = 12 pM, und ein normales während der symptomatischen Kategorien 4, 5 zu erreichen normal. Diese Muster hat Immunsystem Inaktivierung zugeschrieben, nicht ausreichend Synthese proteolytischen Inaktivierung oder Sauerstoff. Wir beobachteten, dass bei HIV-1-Patienten mit> 220 CD4-Zellen / ul, CD4-Zahlen mit Serum Spiegel der aktiven α 1 PI korreliert (r 2 = 0,93, p &lt; 0,0001, n = 26) und inaktive α 1 PI (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 26) 5. Die Verabreichung von α 1 PI, um HIV-1 infizierten und nicht infizierten Probanden führte zu dramatischen Anstieg der CD4-Zellzahl darauf hindeutet, α 1 PI beteiligt an der Regulation der Anzahl der CD4 + T-Zellen im Blut 3.

Mit Stimulation, enthält ganze Speichel ausreichend seröse Exsudat (Plasma, das verbleibende Material, das durch Wände der Blutgefäße in den Speichel übergeht), damit die Messung von aktiven α 1 PI und die Korrelation dieser Messung gibt Hinweise, dass es eine genaue Methode zur Berechnung der CD4-Zellzahl ist. Kurz gesagt, stimulieren sialogogues wie Kaugummi oder Zitronensäure die Exsudation von Serum in ganzen Mund Speichel. Nach Stimulation Serum Exsudation, wird die Aktivität von Serum α 1 PI im Speichel durch seine Fähigkeit, Elastase-Aktivität zu hemmen gemessen. Schweine-Pankreas-Elastase (PPE)ist ein leicht verfügbares preiswerten Quelle für Elastase. PPE bindet an α 1 PI Bilden einer eins-zu-eins-Komplex, der verhindert, PPE Abspaltung ihrer spezifischen Substraten, von denen die kolorimetrische Peptid ist, Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-Nitroanilid (SA 3 NA). Inkubation von Speichel mit einer sättigenden Konzentration von PSA für 10 Minuten bei Raumtemperatur ermöglicht die Bindung von PSA an alle aktiven α 1 PI im Speichel. Die daraus resultierende Hemmung der PSA, die unter aktiver α 1 PI kann durch Zugabe des PSA-Substrat SA 3 NA. (Abbildung 1) gemessen werden. Obwohl CD4 in Bezug auf das Blutvolumen (CD4-Zellen / ul) gemessen werden, wird die Konzentration an α 1 PI im Speichel zu der Konzentration von Serum im Speichel und nicht die für die Menge der Speichel da das Volumen beträchtlich variieren während des Tages und Person bis 6 Personen. Es ist praktisch das gesamte Protein im Speichel durch Serumgehalt, und das Protein von Speichel wird gemesversicherbar 7. Somit wird aktiven α 1 PI im Speichel im Verhältnis zum Speichel Proteingehalt berechnet und wird als α 1 PI-Index. Hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die α 1 PI-Index eine genaue und präzise physiologische Verfahren zur Berechnung CD4 bietet.

Protocol

1. Bereiten Sie frische Arbeitskopie Lösungen

  1. TBS: 0,05 M Tris-gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,8 (TBS). Bereiten Sie 60 ml TBS / Mikroplatten.
  2. PSA: Schweine-Pankreas-Elastase, Typ 1 (PSA) wird als Suspension zur Verfügung gestellt. Gut schütteln und verdünnen PSA in TBS auf etwa 0,01 U / ml. Bereiten Sie 6 ml Arbeitslösung / Mikroplatten).
  3. SA 3 NA: Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA 3 NA). Bereiten 0,1 M Lager SA 3 NA Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) und sofort verwenden oder bei -20 ° C lagern Bereiten 6ml Arbeitslösung / Mikrotiterplatten durch Verdünnung Lager SA 3 NA-Lösung 1/100 in TBS.
  4. Coomassie-Blau: Bereiten Sie eine Stammlösung von 10% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Coomassie-Blau) in TBS und sofort verwenden oder bei -20 ° C. Bereiten Sie 6 ml Arbeitslösung durch Verdünnen Stammlösung 1/1000 in TBS.

2. Bereiten Saliva

Speichelsammelsystem: im Stehen, stimulieren Serum Exsudation in Speichel, indem Sie einen sialogogue wie Zitronensäure oder Kaugummi im Mund. Eine zuckerfreie Zitronen-Tropfen ist praktisch für HIV-1-Patienten, die häufig zahnlosen und nicht in der Lage, Kaugummi zu kauen sind. Schlucken, weil für die ersten 3 min benötigt, und sammeln ganzen Mund Speichel in einem verschlossenen Becher für die nächsten 3 min. Dies wird etwa 2 ml Speichel. Verwenden Sie sofort oder bei -80 ° C lagern
  • SPEICHEL HANDHABUNG: Wenn gefroren, auftauen Probe bei 37 ° C und auf Eis stellen. Bewahren Sie frische oder aufgetaute Probe bei 2-4 ° C nicht mehr als 3 Tage. Nicht vortexen und Speichel zu vermeiden Pipettieren Mucin, das kein Serum Exsudat enthält. Verwenden Sie Standard-Vorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Speichel http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .
  • 3. Mikroplatten Set-up

    1. EXEMPLARE: Zu jedem Test gut, wird 20 ul Speichel für ein Endvolumen von 150 ul / Vertiefung zugegeben. Durch Pipettieren gründlich mischen, ohne dabei Blasen.
    2. STEUERUNG: Die positive Kontrolle enthält PPE, aber kein Speichel. Die negative Kontrolle enthält Speichel, aber kein PPE.To die positive Kontrolle ist gut 20 ul TBS aufgenommen. Um die negative Kontrolle wird 20 ul Speichel aufgenommen.
    3. PSA Inkubation: Schütteln Sie PSA gut funktionierende Lösung. Dann werden 50 ul PSA arbeiten Lösung in jede Vertiefung mit Ausnahme der negativen Kontrollvertiefungen. Um den negativen Kontrollvertiefungen, fügen Sie 50 ul TBS. Inkubieren 10 min bei 23 ° C
    4. SUBSTRATINKUBATION: Je 50 ul SA 3 NA funktionierende Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren 45 min bei 23 ° C
    5. Coomassie-Blau:. Dann werden 50 ul Coomassie Blue Arbeitslösung </ Li>
    6. Read-Out: Extinktion in Mikroplatten-Reader, A 405 nm bis SA 3 NA-Spaltung die aktive α 1 PI und A 595 nm bis Coomassie Blue, die Eiweißgehalt darstellt erkennen repräsentiert zu erkennen.

    4. Berechnen Sie α 1 PI Index

    1. Normalisieren der Durchschnitt eine 405 nm und einer 595 nm: Für jeden dreifacher Ausfertigung, berechnen Sie den Durchschnitt. Subtrahieren Sie die Negativ Kontrolle Durchschnitt von der Probe Durchschnitt. Um von Platte zu Platte Variation zu minimieren, normalisieren die Durchschnitte, indem jede Probe durchschnittlich durch die positive Kontrolle im Durchschnitt wie folgt:

    Gleichung 1

    1. BERECHNEN α 1 PI INEX: Teilen Sie den normalisierten A 405 nm durch den normierten A 595 nm:


    5. Repräsentative Ergebnisse

    Um festzustellen, ob die α-Test geeignet sein könnten für die Verwendung als ein Point-of-care-Screening-Test CD4-Zellzahlen in endemischen, mit begrenzten Ressourcen zu überwachen, um Regionen, wurde angeregt Speichel aus 20 weiblichen und 11 männlichen gesammelt HIV-1 Patienten betreuende Klinik für Routineversorgung in Kamerun. In Übereinstimmung mit vorläufigen Beobachtungen während der Entwicklung des α-Test unter Verwendung von Speichel in New York City gesammelt, das α 1 PI Index im Speichel in Kamerun mit CD4-Zellzahlen (r 2 = 0,91, p <0,0001. N = 31) korreliert gesammelt. Die Beziehung war von einem 3-Parameter-förmigen Kurve, die im Einklang mit einer Dosis-Wirkungs-Beziehung (Abbildung 2A) ist definiert. Die 95%-Vertrauensbereich und Vorhersage-Intervalle sind mit blauen und roten Linien (Abbildung 2B) dargestellt.

    InEine frühere Studie haben wir festgestellt, dass CD4 + T-Zellen sinusförmige Periodizität Radfahren mit 23 ± 3,5 Tage in der HIV-1 Patienten und bei Patienten mit der vererbten Version von α 1 PI-Mangel (PiZZ) 3 aufweisen. Abgebildet sind, ist ein repräsentatives Beispiel von Computer-generierten Sinuskurve Analyse der CD4 Radfahren in einer nicht-HIV-1-gesunden Kontrollgruppe zeigt 27 Tage Periodizität (Abbildung 3A).

    Computer-generierte Sinuskurve Analyse der CD4 + T-Zell-Veränderungen in 6 Fächer ergaben Werte für Spitze-Spitze-Amplitude und Schwenkachse 3. Wie erwartet, wurde die Achse der Schwingung mit der Amplitude (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6) (3B) korreliert. Bei Patienten werden niedrige CD4-T-Zellzahlen waren die zyklischen Veränderungen der CD4-T-Zellzahl klein, und bei Patienten mit hoher CD4 + T-Zellzahl, waren zyklische Veränderungen groß.

    Da dieRegressionslinie in Abbildung 2 dargestellt schätzt die Schwingungsachse und die Achse der Schwingung mit der Amplitude korreliert die Amplitude für die Regressionslinie dadurch Abschätzen, wie weit oberhalb und unterhalb der Regressionslinie CD4 + T-Zellen zu erwarten würde, kann berechnet werden, um variieren aufgrund Radfahren (3C). Die Überlagerung der Amplitude in 3C und das Konfidenzintervall in 2B berechnet berechnet wurde festgestellt, dass Amplitude (grüne Linie) innerhalb des 95% liegt das Konfidenzintervall (blaue Linie) (3D).

    1
    Abbildung 1. Zusammenfassung Vorgehensweise: Legen Sie Zitronensäure in den Mund und Speichel zu sammeln. In verdünnten Speichel zu Vertiefungen einer Mikrotiterplatte in dreifacher Ausfertigung. Fügen PSA in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 15 min bei 23 ° C. Fügen Sie den PSA-Substrat in jede Vertiefung und inkubieren Sie für 45 min bei 23 ° C. In Coomassie-Blau und bei 405 nm auf PSA Aktivität zu detektieren und bei 595 nm bis Proteins nachzuweisen.

    2
    Abbildung 2. Vergleich der α-Test mit dem Standard-CD4-Zählweise. A) Die α-Test wurde durch die Quantifizierung der α 1 PI Index in stimulierten ganzen Mund Speichel durchgeführt. CD4-Zahlen wurden von einem unabhängigen medizinischen Labor mit Hilfe der Durchflusszytometrie durchgeführt. Blut für die Durchflusszytometrie und Speichel wurden in derselben Klinik Besuch gesammelt. Die Beziehung zwischen der α 1 PI-Index und CD4-Zellzahl wurde durch eine 3-Parameter-förmigen Kurve (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 31). B) Die 95%-Vertrauensbereich und Vorhersage-Intervalle werden in blau und rot dargestellt definiert Linien angezeigt sind.

    Abbildung 3
    Abbildung 3. Die Genauigkeit der Berechnung CD4 counts mit dem α1PI Index.A) CD4 + T-Zellen zeigten eine sinusförmige Radfahren mit 27 Tage Periodizität in einer nicht-HIV-1-gesunden Kontrollgruppe. Die Schwenkachse ist gezeigt (rot gepunktete Linie). B) Computer festgelegt Sinuswelle Analyse von CD4-T-Zellzyklus verwendet werden, um den Spitze-Spitze-Amplitude und der Achse der Schwingung in 4 HIV-1-Patienten berechnet wurde, ein nicht-HIV -1 Pizz unterliegen, und die Nicht-HIV-1 gesunden Kontrollpersonen in Teil A. schilderte die Beziehung zwischen CD4-T-Zelle + Amplitude und Drehachse des Pendels wurde durch 3-Parameter-förmigen Kurve (r 2 = 0,96, p = 0,009, n definiert = 6). C) Die sigmoide Beziehung zwischen Amplitude und Drehachse des Pendels in Teil B) abgeleitet wurde benutzt, um die erwartete Amplitude (grüne Linien) der Punkte entlang der Regressionsgeraden (schwarze Linie) aus Abbildung 2 zu berechnen. d) die erwartete Amplitude Intervall (grüne Linien) unterschied sich signifikant von dem 95%-Konfidenzintervall (blaue Linien) wie von der Mann-Whitney-Rangsummentest (basierend auf einem Vergleich des mittleren Differenz zwischen dem 95%-Konfidenzintervall und Regressionsgerade (63 Zellen / ul) und die mediane Differenz zwischen der Amplitude Linie und Regressionsgerade (37 Zellen bestimmt / ul); p = 0,001).

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    Discussion

    Unverdünntes Serum enthält Median 36 um α 1 PI und 3,6 um α 2 Makroglobulin (α 2 M) ein 10-facher Unterschied 8. Beide Proteine ​​um die Bindung an PSA. Diese beiden Eigenschaften, Konzentration und PPE Affinität, wurden genutzt, um ein Verfahren, das imstande ist, spezifisch Messen α 1 PI in normalem Serum in Gegenwart von konkurrierenden α 2 M 8 zu entwickeln. Diese Methode kann so wenig wie 50 nM μ 1 PI in 0,3% Serum zu detektieren. Bei einer Serumverdünnung von 2,5% liegt, wird die Bindung von α 2 M auf PSA nachweisbar, und dieser Verdünnung enthält etwa 900 nm α 1 PI und 90 nm α 2 M.

    Im Gegensatz zu Serum, das von 10-fach mehr α 1 PI als α 2 M, ganz Mundspeichel ein 20-facher Unterschied 9 enthält zusammengesetzt ist. Wir fanden in der vorliegenden Studie, dass unverdünnt, stimulierte Speichelenthält etwa 30-mal geringer α 1 PI als Serum oder ca. 1200 nm α 1 PI und zu erwarten, dass etwa 60 nM α 2 M. enthalten Die optimale Verdünnung für die Speichel-α-Test wurde festgestellt, dass 13% stimuliert Speichel und diese Verdünnung zu erwarten, dass etwa 160 nM enthalten α 1 PI und 8 nM α 2 M, eine Konzentration von α 2 M, die unter der Schwelle der Erfassung des Protokolls. Aufgrund der geringen Konzentration von α 2 M ist es möglich, eine genaue Bestimmung der spezifischen Aktivität der α 1 PI im Speichel, ohne Sorge um Konkurrenz aus α 2 M. Messungen der aktiven α 1 PI-und Eiweißgehalt im Speichel erlaubt die Berechnung des α 1 PI Index gefunden, die mit dem Standard-Verfahren zur Messung der CD4-Zellzahl, Durchflusszytometrie wurde korrelieren. Wichtig ist, dass die Ergebnisse einer Regressionsanalyse (r

    CD4-Zählung Methoden wurden bisher nicht berücksichtigt die Variation, die durch Radfahren ist genommen. In der Praxis kann CD4-Zellzahl um nicht weniger als 200 Zellen / ul zwischen dem Tiefpunkt und Höhepunkt mit einer Periodizität von 23 bis 27 Tagen variieren, und dies gilt unabhängig von der Methode zur Messung der CD4 + T-Zellen 3. Somit stellt die Sinus-Achse der Schwingung eine genauere Messung der individuellen wahren CD4 + T-Zellzahl als eines eintägigen Maßnahme, da die Achse der Schwingung konstant Stunde zu Stunde, Woche zu Woche. Obwohl es nicht durchführbar sein kann, direkt die Schwenkachse für die individuelle CD4 + T-Zellen, kann dies unter Verwendung eines geschätzten mittleren Längsachse des CD4 + T-Zellzahlen, solange Variation in CD4-Zahlen nicht übersteigt erwarteten Amplitude werden. Große Unterschiedes in CD4-Zahlen würden zeigen den Einfluss von anderen Variablen als Radfahren.

    Die Regressionslinie in 2 dargestellt ist eine Schätzung der Schwenkachse. Die Berechnung der erwarteten Amplitude oberhalb und unterhalb der Regressionsgeraden zeigten, dass Amplitude innerhalb des 95%-Konfidenzintervall liegt. Die mittlere Differenz zwischen dem 95%-Konfidenzintervall und Regressionsgerade beträgt 63 CD4-Zellen / ul, das Durchschnittseinkommen der Unterschied zwischen Amplitude und der Regressionsgeraden beträgt 37 CD4-Zellen / ul. Dies kann interpretiert werden, dass 95% der CD4 aus den α-Testmessungen zählt, berechnet wird innerhalb von etwa 63 CD4-Zellen / ul von den tatsächlichen CD4-Zellzahl und dass ungefähr 58% dieser Differenz wird durch CD4-Radsport werden. Somit ist die Genauigkeit der α-Test der Abstand zwischen dem Konfidenzintervall und Amplitude, die etwa 26 CD4-Zellen / ul ist, und die Genauigkeit der α-Test ist die Korrelation coefficient der Regressionsgeraden, die 0,95 oder 95% ist.

    Es gibt einige Einschränkungen auf die α-Test, wie hierin beschrieben, aber Lösungen sind leicht erhältlich. Zum Beispiel, obwohl die α-Test beschrieben eines Mikroplatten-Format verwendet, ermöglicht die Fähigkeit, die α-Test unter Verwendung eines einzigen Speichelprobe Verdünnung durchzuführen die α-Test mit Ölmessstab Technik, ein Instrument-befreit, technologisch einfach verwendet werden. Etwa 2% der Speichelproben in Kamerun gesammelt waren zu viskos, um zu manipulieren, und dies steht im Einklang mit Speichel in New York City gesammelt. Die Anwendung von DNase, solche Proben verwendet werden, um Viskosität wodurch Messung 10 verbessern werden. Eine weitere Lösung könnte darin bestehen, die speziell sialagogues pharmakologische Stimulierung Speichel-Sekretion über den Parasympathikus gegenüber sympathischen Weg wodurch Speichel wässrig zu verwenden. Eine solche sialagogue Pilocarpin ist 11. Schließlich hat die α-Test nichtt noch nicht validiert wurde, und das ist notwendig, um festzustellen, ob die Leistung ausreichend diskriminierend kritische Werte bei CD4-Zellzahlen 12 ist.

    Die kritische Masse von CD4-Zellen sind in dem linearen Bereich der sigmoidalen Regressionskurve, die diese Werte durch eine lineare Algorithmus berechnet werden dürfen. In dieser Population die lineare Regression für Werte <860 CD4-Zellen / ul (r 2 = 0,86, n = 30, p <2x10 -7) war so gut wie die sigmoidale Regression (r 2 = 0,88, n = 30, p < 0,0001). Die lineare Regression für α 1 PI-Indizes über 67, die auf etwa 350 CD4-Zellen / ul (r 2 = 0,88, n = 15, p = 0,002) war so gut wie die sigmoidale Regression (r 2 = 0,89, n = 15 entspricht, p <0,0001). Allerdings war Korrelation nicht an α 1 PI Indizes unterhalb von 67, die auf <350 CD4-Zellen entsprachen signifikante / ul (r 2 = 0,17, p = 0,54, n = 15). Dies ist ein kritischer Wert, da WHO-Richtlinien empfehlen eine CD4-Zellzahl <350 CD4-Zellen / ul, für den Zugang zu antiretroviraler Therapie 13 zu qualifizieren. Um besser zu bestimmen, die Leistung des α-Test und zur Verbesserung der Empfindlichkeit bei niedrigeren Werten, werden zusätzlich 800 Speichelproben in Kamerun aus 4 Gruppen gesammelt: Neugeborenen-2 Jahre, 3-5 Jahre und 6-15 Jahre und 16 Jahre und älter.

    Zusammenfassend ist die α-Test physiologisch relevant für die Zahl der CD4-Zellen im Blut noch kann mit Speichel, wodurch eine nicht-invasive, genaue und präzise Point-of-Care-Methode zur Überwachung CD4-Zellzahlen in endemischen Gebieten ohne Instrumentierung zu eins werden Cost-per-Test, der weniger als einem Dollar ist.

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    Disclosures

    Keine Interessenskonflikte erklärt.

    Acknowledgements

    Forschung wurde von der Harry Winston Forschungsgemeinschaft unterstützt.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sialogogue, 0.05M citric acid Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 Sugar-Free Lemon dropS
    Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 E1250
    Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide Sigma-Aldrich S4760
    Coomassie Brilliant Blue R-250 Sigma-Aldrich B7920
    Tissue culture-treated, 96 well microplates Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 35-3072
    Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 Dynex P97277

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    References

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