Le α-test: Rapid portable sans énumération des CD4 utilisant la salive entier

Published 5/16/2012
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Medicine

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Summary

Une méthode de numération des CD4, l'α-test, est décrite qui utilise la salive ensemble, de fournir rapides et précises des taux de CD4. Les sous-α essai coûts et élimine la nécessité d'une formation technique, des réactifs coûteux tels que les anticorps monoclonaux, l'instrumentation, de réfrigération, le transport des échantillons, ainsi que de collecte et de traitement du sang.

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Bristow, C. L., Babayeva, M. A., Modarresi, R., McArthur, C. P., Kumar, S., Awasom, C., et al. The α-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva. J. Vis. Exp. (63), e3999, doi:10.3791/3999 (2012).

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Abstract

Protocol

1. Préparer une solution fraîche Solutions de travail

  1. SCT: 0,05 M Tris Buffered Saline, pH 7,8 (TBS). Préparer 60 ml TBS / microplaque.
  2. EPI: l'élastase pancréatique porcine, de type 1 (PPE) est fourni sous forme de suspension. Bien agiter et diluer EPI SCT à environ 0,01 U / ml. Préparer 6 ml de solution de travail / microplaque).
  3. SA 3 NA: succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA 3 NA). Préparer 0,1 M de stock SA solution 3 NA dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) et utiliser immédiatement ou conserver à -20 ° C. Préparer la solution de travail 6ml / microplaque par dilution de stock SA solution 3 NA 1/100 dans du TBS.
  4. Bleu de Coomassie: Préparer une solution stock de 10% de bleu de Coomassie R-250 (Bleu de Coomassie) dans du TBS et utiliser immédiatement ou conserver à -20 ° C. Préparer 6 ml de solution de travail en diluant la solution stock de 1/1000 dans du TBS.

2. Préparer la salive

Prélèvement de salive: En position debout, de stimuler l'exsudation du sérum dans la salive en plaçant un sialogogue tels que l'acide citrique ou de chewing-gum dans la bouche. Une goutte de citron sans sucre est commode pour les patients VIH-1, qui sont souvent édentés et incapable de mâcher de la gomme. Avalez le cas échéant pour la première fois 3 min, et de recueillir la salive de toute la bouche dans une tasse plafonné pour le prochain 3 min. Cela permettra d'environ 2 ml de salive. Utiliser immédiatement ou conserver à -80 ° C.
  • MANIPULATION DE SALIVE: Si congelée spécimen dégel, à 37 ° C et le lieu sur la glace. Stockez spécimen frais ou décongelés à 2-4 ° C ne dépasse pas 3 jours. Avez salive pas de tourbillon, et d'éviter de pipetage mucine qui ne contient pas d'exsudat de sérum. Utilisez les précautions standard lors de la manipulation de salive http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf .
  • 3. Microplaques Set-up

    1. SPECIMENS: Pour chaque puits de test, on ajoute 20 ul de salive pour un volume final de 150 pl / puits. Mélanger à la pipette sans introduire de bulles.
    2. COMMANDES: Le contrôle positif contient PPE, mais pas de la salive. Le contrôle négatif contient de la salive, mais pas PPE.To le contrôle positif est bien ajouté 20 uL du SCT. Pour le contrôle négatif est bien ajouté 20 uL de salive.
    3. INCUBATION EPI: Agiter la solution PPE fonctionne bien. Ajouter 50 uL solution de travail PPE à chaque puits à l'exclusion des puits témoins négatifs. Pour les puits de contrôle négatif, ajouter 50 ul du SCT. Incuber 10 min à 23 ° C.
    4. INCUBATION DU SUBSTRAT: Ajouter 50 uL SA solution 3 NA travaille à chaque puits. Incuber 45 min à 23 ° C.
    5. Bleu de Coomassie:. Ajouter 50 ul bleu de Coomassie solution de travail </ Li>
    6. LECTURE: Lire l'absorbance dans un lecteur de microplaques, un 405 nm pour détecter SA 3 clivage NA qui représente activement α 1 PI et A 595 nm pour détecter au bleu de Coomassie qui représente la teneur en protéines.

    4. Calculer α 1 Indice PI

    1. NORMALIZE LA MOYENNE A 405 nm et un nm 595: Pour chaque trois exemplaires, calculer la moyenne. Soustraire la moyenne du contrôle négatif de la moyenne des échantillons. Afin de minimiser la plaque à la plaque de variation, de normaliser les moyennes en divisant chaque moyenne des échantillons par la moyenne de contrôle positif comme suit:

    L'équation 1

    1. CALCUL DE LA α 1 PI INEX: Diviser le normalisé A 405 nm par les normalisés A 595 nm:


    5. Les résultats représentatifs

    Pour déterminer si l'α-test peut être adapté pour être utilisé comme un test de dépistage au point de soins pour surveiller la numération des CD4 dans les pays endémiques, des régions à ressources limitées, la salive stimulée a été recueillies auprès de 20 femmes et 11 hommes VIH-1 clinique des sujets traitant pour des soins de routine au Cameroun. Concorde avec les observations préliminaires au cours du développement de l'α-test à l'aide de salive recueillis à New York, le α 1 Indice PI dans la salive recueillie au Cameroun en corrélation avec le nombre de CD4 (r 2 = 0,91, p <0,0001. N = 31). La relation a été définie par une courbe sigmoïde 3-paramètre qui est compatible avec une relation dose-réponse (figure 2A). La confiance de 95% et des intervalles de prédiction sont représentées par des lignes bleues et rouges, respectivement (figure 2B).

    Dansune étude précédente, nous avons déterminé que les cellules T CD4 présentent vélo sinusoïdale avec une périodicité de 23 ± 3,5 jours dans le VIH-1 sujets et chez les sujets atteints de la version héritée de α carence en 1 IP (PIZZ) 3. Présentée dans le présent est un exemple représentatif de l'ordinateur généré par analyse de la courbe sinusoïdale de CD4 vélo dans un non-VIH-1 présentant 27 témoins sains périodicité jour (figure 3A).

    Générée par ordinateur d'analyse courbe sinusoïdale des cellules CD4 + changements de cellules T chez 6 sujets a donné des valeurs de crête à crête d'amplitude et de l'axe d'oscillation 3. Comme on pouvait s'y attendre, l'axe d'oscillation a été corrélée avec une amplitude (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6) (figure 3B). Chez les patients seront CD4 bas T + nombre de cellules, les changements cycliques de la numération de lymphocytes T CD4 étaient de petite taille, et chez les patients atteints de CD4 + élevé de lymphocytes T, les changements cycliques étaient grandes.

    Parce que ledroite de régression montre la figure 2 estime l'axe d'oscillation et de l'axe d'oscillation est corrélée avec une amplitude, l'amplitude peut être calculée pour la ligne de régression estimant ainsi dans quelle mesure ci-dessus et ci-dessous les CD4 + de la ligne de régression des cellules T on peut s'attendre à varier en raison de vélo (figure 3C). Superposer l'amplitude calculée à la figure 3C et l'intervalle de confiance calculé à la figure 2B, on a constaté que l'amplitude (ligne verte) se situe dans les 95% l'intervalle de confiance (ligne bleue) (figure 3D).

    Figure 1
    Figure 1. Résumé de la procédure: l'acide citrique dans la bouche de la Place et de recueillir la salive. Ajouter la salive dilués dans les puits d'une microplaque en triple exemplaire. Ajouter EPI à chaque puits et incuber pendant 15 min à 23 ° C. Ajouter le substrat PPE à chaque puits et incuber pendant 45 min à 23 ° C. Ajouter au bleu de Coomassie et lire à 405 nm pour détecter l'activité de protection individuelle et à 595 nm pour détecter la protéine.

    Figure 2
    Figure 2. Comparaison de l'α-test avec la méthode d'énumération CD4 standard. A) Le α-test a été réalisé par la quantification de la α 1 Indice PI dans la salive la bouche stimulé l'ensemble. La numération des CD4 ont été réalisées par un laboratoire médical indépendant utilisant la cytométrie de flux standard. Sang pour la cytométrie de flux et de salive ont été prélevés lors de la visite même clinique. La relation entre l'α 1 Indice PI et la numération des CD4 a été définie par une courbe sigmoïde à 3 paramètres (r 2 = 0,91, p <0,0001, n = 31). B) La confiance de 95% et des intervalles de prédiction sont représentées en bleu et rouge lignes, respectivement.

    Figure 3
    Figure 3. Précision de calcul CD4 contants en utilisant le Index.A α1PI) cellules T CD4 + exposé vélo sinusoïdale avec 27 périodicité jour dans un contrôle non-VIH-1 en bonne santé. L'axe d'oscillation est représenté (pointillé rouge). B) Computer analyse généré onde sinusoïdale de CD4 des lymphocytes T du vélo a été utilisé pour calculer l'amplitude de crête à crête et de l'axe d'oscillation dans 4 sujets VIH-1, 1 non-VIH -1 Pizz sujet, et le non-VIH-1 de contrôle sain représenté dans la partie A. La relation entre T CD4 + amplitude cellule et axe d'oscillation a été définie par le 3-paramètre courbe sigmoïde (r 2 = 0,96, p = 0,009, n = 6). C) La relation sigmoïde entre l'amplitude et l'axe d'oscillation provenant en partie B) a été utilisée pour calculer l'amplitude attendue (lignes vertes) de points le long de la ligne de régression (ligne noire) de la figure 2. D) L'amplitude attendue intervalle (lignes vertes) était significativement différente de l'intervalle de confiance 95% (lignes bleues) comme déterminé par le test de Mann-Whitney somme des rangs (basée sur une comparaison de la différence moyenne entre l'intervalle de confiance de 95% et la ligne de régression (63 cellules / uL) et la différence moyenne entre la ligne de l'amplitude et la droite de régression (37 cellules / pl); p = 0,001).

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    Discussion

    Sérum non dilué contient médiane 36 uM α 1 PI et 3,6 uM α 2-macroglobuline2 M) une différence de 10 fois 8. Les deux protéines compétition pour la liaison aux EPI. Ces deux caractéristiques, la concentration et l'affinité EPI, ont été exploitées pour développer une méthode qui est capable de mesurer précisément α 1 PI dans le sérum normal en présence de concurrence α 2 M 8. Cette méthode permet de détecter aussi peu que 50 μ nM 1 PI dans le sérum de 0,3%. Lors d'une dilution du sérum de 2,5%, la liaison de α 2 M aux EPI devient indétectable, et cette dilution contient environ 900 nM α 1 PI et 90 nm α 2 M.

    À la différence de sérum qui est composé de plus de 10 fois α 1 α 2 PI que M, de la salive toute la bouche contient une différence de 20 fois 9. Nous avons trouvé dans la présente étude que les non dilué, la salive stimuléecontient environ 30 fois moins α 1 IP que le sérum, soit environ 1200 nm α 1 PI et serait prévu pour contenir environ 60 nM α 2 M. La dilution optimale pour la salive α-test a été trouvé à 13% la salive stimulée, et cette dilution serait de penser qu'elles contiennent environ 160 nM α 1 PI et 8 nm α 2 M, une concentration de α 2 M qui est en dessous du seuil de détection dans le protocole. En raison de la faible concentration de α 2 M, il est possible de déterminer avec précision l'activité spécifique de α 1 PI dans la salive sans se préoccuper de la concurrence des α 2 M. Les mesures de α actif 1 PI et la teneur en protéines dans la salive a permis le calcul de la α 1 Indice PI qui a été trouvé une corrélation avec la méthode standard pour mesurer le nombre de CD4, cytométrie en flux. Fait important, les résultats de l'analyse de régression (r

    Méthodes de dénombrement des CD4 n'ont pas déjà pris en considération la variation est due à vélo. En termes pratiques, le nombre de CD4 peut varier jusqu'à 200 cellules / ul entre le nadir et le sommet avec une périodicité de 23-27 jours, et cela est vrai indépendamment de la méthode de mesure de cellules T CD4 + 3. Ainsi, l'axe d'oscillation sinusoïdale donne une mesure plus précise de CD4 véritables d'un individu + nombre de lymphocytes T que la mesure d'un seul jour, car l'axe d'oscillation est l'heure constante en heure, de semaine en semaine. Bien qu'il puisse ne pas être possible de mesurer directement l'axe d'oscillation de CD4 d'une personne + de cellules T, ce qui peut être estimée en utilisant une moyenne de CD4 + longitudinales numération des lymphocytes T pour autant que la variation dans le taux de CD4 ne dépasse pas l'amplitude attendue. Une grande variations dans la numération des CD4 indique l'influence d'autres variables que le cyclisme.

    La ligne de régression représentée sur la figure 2 est une estimation de l'axe d'oscillation. Calcul de l'amplitude attendue au-dessus et en dessous de la ligne de régression a montré que l'amplitude se situe dans l'intervalle de confiance de 95%. La différence moyenne entre l'intervalle de confiance de 95% et la droite de régression est de 63 CD4 cellules / ul, et la différence moyenne entre l'amplitude et la droite de régression est de 37 CD4 cellules / ul. Cela peut être interprété comme signifiant que 95% des taux de CD4 calculé à partir des mesures α-test sera dans environ 63 CD4 cellules / ul des taux de CD4 réels et que environ 58% de cette différence sera due à vélo CD4. Ainsi, la précision de l'α-test est la distance entre l'intervalle de confiance et de l'amplitude qui est approximativement 26 CD4 des cellules par microlitre, et la précision de l'α-test est le coefficie corrélationnt de la ligne de régression, qui est de 0,95 ou 95%.

    Il existe plusieurs limites à la α-test tel que décrit ici, mais des solutions sont déjà disponibles. Par exemple, même si l'α-test décrit utilise un format microplaque, la capacité d'effectuer l'α-test en utilisant une dilution de salive seule permet le test α-être utilisé avec la technologie jauge, un instrument-libre, système technologiquement simple. Environ 2% des échantillons de salive prélevés au Cameroun étaient trop visqueux à manipuler, et cela est compatible avec la salive recueillie à New York. L'application de ces échantillons à la DNase peut être utilisé pour améliorer la viscosité permettant ainsi la mesure 10. Une solution complémentaire pourrait consister à utiliser sialagogues pharmacologiques qui stimulent la sécrétion de salive spécifiquement par la voie parasympathique par rapport sympathique produisant ainsi la salive aqueuse. Un sialagogue telle est la pilocarpine 11. Enfin, l'α-test n'a past encore été validé, et cela est nécessaire pour déterminer si la performance est suffisamment discriminatoire pour les niveaux critiques de la numération des CD4 12.

    Les niveaux critiques de la numération des CD4 sont dans la région linéaire de la courbe de régression sigmoïdale qui a permis ces valeurs doit être calculée par un algorithme linéaire. Dans cette population, la régression linéaire pour des valeurs inférieures à 860 cellules CD4 / ul (r 2 = 0,86, n = 30, p <2x10 -7) était aussi bonne que la régression sigmoïdale (r 2 = 0,88, n = 30, p < 0,0001). La régression linéaire pour les indices alpha PI 1 ci-dessus 67 qui correspond à environ 350 CD4 (cellules / ul r 2 = 0,88, n = 15, p = 0,002) était aussi bonne que la régression sigmoïdale (r 2 = 0,89, n = 15, p <0,0001). Cependant, la corrélation n'est pas significative au Indices alpha PI 1 ci-dessous 67 qui correspondait à moins de 350 cellules CD4 / ul (r 2 = 0,17, p = 0,54, n = 15). Il s'agit d'une valeur critique puisque WLignes directrices HO recommander un taux de CD4 <350 cellules CD4 / ul de se qualifier pour l'accès à la thérapie antirétrovirale 13. Afin de mieux cerner la performance de l'α-test et d'améliorer la sensibilité à des valeurs moindres, un supplémentaire de 800 échantillons de salive sont collectés au Cameroun à partir de 4 groupes: les nouveau-nés-2 ans, 3-5 ans et 6-15 ans et 16 ans et plus.

    En conclusion, l'α-test est physiologiquement pertinente pour le nombre de cellules CD4 dans le sang mais peut être réalisée en utilisant la salive fournissant ainsi un non invasive, précise et exacte au point de méthode de suivi des soins de CD4 dans les régions endémiques sans instrumentation à un coût par test qui est inférieur à un dollar.

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    Disclosures

    Pas de conflits d'intérêt déclarés.

    Acknowledgements

    La recherche a été soutenue par la Fondation de recherche Harry Winston.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sialogogue, 0.05M citric acid Eda’s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144 Sugar-Free Lemon dropS
    Porcine pancreatic elastase, type 1 (EC 3.4.21.36) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103 E1250
    Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide Sigma-Aldrich S4760
    Coomassie Brilliant Blue R-250 Sigma-Aldrich B7920
    Tissue culture-treated, 96 well microplates Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886 35-3072
    Microplate Reader with filters for 405nm and 595nm MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182 Dynex P97277

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    References

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