Author Produced

الحصاد والبرد تبريد بلورات من بروتينات الغشاء يزرع في Mesophases شحمي لتحديد هيكل للعلم البلورات ضخم الجزيئات

Biology
 

Summary

يوصف هنا الإجراءات المنفذة في الغشاء Caffrey الهيكلية والوظيفية لمجموعة الأحياء بلورات الحصاد والبرد بارد من البروتين غشاء شحمي تزرع في مراحل مكعب والإسفنج لاستخدامه في تحديد هيكل الجزيئات باستخدام الأشعة السينية البلورات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography. J. Vis. Exp. (67), e4001, doi:10.3791/4001 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

طريقا هاما لفهم كيفية البروتينات تعمل على مستوى الآلية هو أن يكون هيكل البروتين المستهدف المتاحة، من الناحية المثالية في قرار الذرية. في الوقت الحاضر، لا يوجد سوى طريقة واحدة لالتقاط هذه المعلومات كما ينطبق على البروتينات الغشاء لا يتجزأ (الشكل 1)، وأنها تشكل المجمعات، وهذا الأسلوب هو الجزيئات البلورات بالأشعة السينية (MX). للقيام البلورات هناك حاجة MX نوعية حيود التي، في حالة من البروتينات الغشاء، لا تشكل بسهولة. وقد اكتسب طريقة لبلورة البروتينات الغشاء الذي ينطوي على استخدام mesophases شحمي، وتحديدا في المراحل مكعب والاسفنج 1-5، اهتماما كبيرا من المقرر في وقت متأخر إلى النجاحات وكان له في مستقبلات البروتين G مجال يقترن 6-21 ( شبكة الاتصالات العالمية . mpdb.tcd.ie ). ومع ذلك، وهي طريقة، المشار إليه فيما لفي المتوسط ​​شحمي أو أسلوب المرحلة مكعب، ويأتي مع التقنية الخاصة بهاالتحديات. هذه تنشأ، في جزء منه، نظرا لطبيعة لزجة لزجة وعموما من mesophase شحمي فيه البلورات، والتي غالبا ما تكون بلورات متناهية الصغر، وتنمو. بلورات يصبح من الصعب التلاعب نتيجة لذلك وخاصة أثناء الحصاد 22،23. تنشأ مشاكل أيضا في الخطوة التي تسبق الحصاد الذي يتطلب أن يتم فتح الزجاج لوحات ساندويتش التي تنمو بلورات (الشكل 2) 24،25 لفضح البلعة mesophase، وبلورات فيه، للحصاد، البرد التبريد وX في نهاية المطاف حيود أشعة جمع البيانات.

المتغيرات mesophase مكعب والإسفنج (الشكل 3) من الذي يجب أن يكون حصاد بلورات مختلفة rheologies عميقا 4،26. المرحلة مكعب هو لزج ودبق أقرب إلى معجون الأسنان سميكة. على النقيض من ذلك، فإن المرحلة الاسفنج هو أكثر مرونة مع وجود اتجاه متميز في التدفق. وفقا لذلك، ونهج مختلفة لبلورة فتح الآبار containiوتسمى بلورات نانوغرام نموا في المرحلة مكعب والاسفنج لكما في الواقع هناك حاجة لأساليب مختلفة من بلورات حصاد أنواع mesophase اثنين. بروتوكولات لتفعل ذلك تم تنقيحها وتنفيذها في الغشاء الأحياء الهيكلية والوظيفية (MS & FB) مجموعة، وصفها بالتفصيل في هذه المقالة إن الرب (الشكل 4). يتم إعطاء أمثلة على الحالات التي تحصد بنجاح بلورات البرد ويبرد. ونحن نقدم أيضا أمثلة على الحالات التي تنشأ مشاكل التي تؤدي إلى خسارة لا تعوض من بلورات وتصف كيف يمكن تجنب هذه المشاكل. في هذه المقالة يتم توفير العارض مع خطوة بخطوة تعليمات لفتح الآبار الزجاج تبلور ساندويتش، للحصاد والبرد التبريد بلورات من البروتينات الغشاء نموا في مكعب وعلى مراحل الاسفنج.

Protocol

1. مختبر مجموعة المتابعة قبل الحصاد

  1. استعدادا للحصاد، وملء الجافة رغوة النتروجين السائل ديوار مع وضعه بجانب المجهر حيث هو حصاد لتأخذ مكان.
  2. غمر عفريت التخزين، فتح نهاية المطاف، في النيتروجين السائل داخل ديوار الرغوة والسماح لتبرد تماما.
  3. تأمين الصغيرة جبل حجم يطابق الكريستال للحصاد على عصا المغناطيسي (الشكل 5). من المهم أن يكون على يد عدد من الصولجانات بقطع مغناطيسية صغيرة محملة يتصاعد لتلبية احتياجات الحالات التي يكون فيها من الضروري حصاد بلورات عدة من البلعة واحدة. يجب أن تكون متاحة الصولجانات الغيار في جميع الأوقات.
  4. وضع micropipette، نصائح والحل الذي تم استخدامه مرسب لنمو البلورات إلى جانب المجهر الحصاد. قد تكون هناك حاجة لتغطية mesophase لمنع جفاف وعند فتح البئر.
  5. ودفترا وقلما على مقاعد البدلاء قبل إغلاق و / أوفتح جهاز الكمبيوتر. وسوف تستخدم هذه لتسجيل الملاحظات فيما يتعلق بنوعية، والمظهر والمكان وعدد عفريت التخزين، وما إلى ذلك، من بلورات كما يتم حصادها، البرد المبردة وتوضع في المخازن.
  6. إذا كان مساعد متاح للمساعدة في حصاد هذا الشخص يجب أن يفهم بوضوح البروتوكول الذي سيتبع، الترتيب الذي مختلف الخطوات سوف تتم، ودورها في العملية الشاملة.

مع كل من المواد والمعدات في مكان مهمتنا التالية هي:

2. لوحات تحديد ويلز التي تحتوي بلورات

  1. طريقة أبسط وأكثر مباشرة لإيجاد بلورات حصاد هو لتفقد الآبار يدويا باستخدام مجهر العادي مع ومع الضوء المستقطب المجهري. يمكن ضبط شدة الضوء المنير على المساعدة في تحديد مكان المجهر البلورات.
  2. بدلا من ذلك، حيث يعبروا تصوير يتم فحص لوحات طبيعية تلقائيا مع واستقطابويمكن استخدام ضوء د، للبحث عن البلورات.
  3. سجلت تقييم بالعين الصور الرقمية على شاشة الكمبيوتر.
  4. علامة واضحة مع تلك الآبار بلورات للتعليق الحصاد وسجل على نوعية وحجم وموقع البلورات في mesophase في دفتر أو على الكمبيوتر.
  5. إزالة لوحة تحتوي على بلورات لحصاد من تصوير.

3. فتح بشكل جيد مع mesophase مكعب. الأسلوب 1

لوحات التي تنمو بلورات من قبل في طريقة المتوسط ​​هي لوحات ساندويتش الزجاج (الشكل 2). من أجل الوصول إلى mesophase وبلورات فيه، لا بد من فتح أيضا. يتم ذلك باستخدام أداة قطع الزجاج لقطع ساترة العليا التي الأختام البئر ومن ثم يمكن إزالتها.

هناك العديد من الطرق لقطع وإزالة ساترة من أكثر من بلورة أيضا. وأملت واحدة لاستخدامها من قبل س نوعو في mesophase التي وجدت على الكريستال المتنامية. هذا يمكن أن يكون مرحلة لزجة جدا ولزجة مكعب (الشكل 3A) أو البديل لها أكثر مرونة، والمرحلة الإسفنج (الشكل 3B). في هذه المقالة الفيديو نعرض كيفية فتح الآبار وحصاد بلورات من كل من هذه المواد استضافة.

  1. ضع بلورة ساندويتش لوحة من الزجاج على مسرح المجهر الخفيفة.
  2. باستخدام أداة قطع الزجاج ساترة نقاط طفيفة مع اثنين من دوائر متحدة المركز يقع فوق التبادل وخارج محيط البئر. مع أداة قطع جديدة، وسجل تتطلب الحد الأدنى من الضغوط التي مورست. استبدال الأداة مع واحدة جديدة عندما يكون الضغط المطلوب لدرجة حتى يزيد كسريا، وهذا يحدث عادة بعد فتح 10 آبار.
  3. تفريق الزجاج في الفضاء بين الدائرتين وسجل لغرض الإفراج عن ساترة الداخلية. هذا يولد الكثير من شظايا الزجاج والغبار. مسح عليها بعيدا مع مبللورقة منشفة.
  4. إزالة ساترة المحررة التي تحكم قبضتها عليها مع ملاقط والرؤوس الجميلة ويميل بعيدا عن وخارج البئر. في هذه الحالة، يبقى مكعب المرحلة عالقة في مكانها وعلى اللوح الأساس من البئر.
  5. تكبير للحصول على رؤية أوضح للmesophase مكعب التي هي الآن جاهزة للاستخدام في الحصاد وضوح الشمس.

4. فتح حسنا مع Mesophase مكعب. الأسلوب 2

  1. باستخدام أداة قطع الزجاج نقاط خطوط متوازية على التوالي في ساترة لجانب واحد من البئر والتي تمتد عبر البئر نفسها. وهذا يتيح سهولة الوصول إلى ملاقط وإزالة ساترة.

في هذه المظاهرة خاصة، ساترة الشقوق في تحرير ساترة من سطح التبادل لزجة. في هذه العملية، والتحولات في موقف ساترة ومرسب يفصل من مرحلة مكعب. عندما يتم رفع ساترة بعض الكثيرمن تتفق معها. وتركنا مع تعرض بolus من دون أي mesophase الكثيرمن المحيطة بها. على الفور، إضافة 1 ميكرولتر الكثيرمن جديدة على رأس البلعة باستخدام micropipette لمنع mesophase من الجفاف ويخضع لتغيير المرحلة التي قد تؤدي إلى تلف البلورات. والبلعة الآن جاهزة للاستخدام في الحصاد وضوح الشمس.

5. فتح حسنا مع المرحلة الإسفنج. دون جدوى

المرحلة الاسفنج هو أقل تسامحا للعمل مع لقدرتها على التدفق. إذا سوف ينتج تدفق في المرحلة الإسفنج الاتصال محيط الشعرية جيدا استخلاص mesophase وسيتم فقدان البلورات. ويرد مثال على هذا يحدث في هذا الفيديو كليب.

  1. التكبير في المرحلة الاسفنج والتبديل ذهابا وإيابا بين الضوء المستقطب الطبيعي وعبرت لتحديد موقع بلورات في المرحلة الاسفنج.
  2. تمهيدا لفتح نقاط بشكل جيد وقطع ساترة كما هو موضح في القسم 3. في هذه العملية، وساترة الشقوق. في محاولةجي لفتح جيدا التحولات الكثيرمن في اتجاه الصدع في نهاية المطاف ويتعلق الأمر في اتصال مع التبادل. مع الكثيرمن يذهب بعض من المرحلة الاسفنج وحمولتها من بلورات هي التي فقدت.

في هذا تسلسل معين، وليس على المستقطبات المجهر عبرت تماما ويمكن رؤية بلورات ككائنات مشرق في الوقت نفسه أن البئر ومحتوياته تبقى مرئية.

6. فتح حسنا مع المرحلة الإسفنج. بنجاح

  1. التكبير في المرحلة الاسفنج وتحديد الكريستال سواء في الضوء المستقطب الطبيعي وعبرت.
  2. نقاط، وقطع وإزالة جزء من ساترة تغطي البئر، كما في القسم 4.1. ويستخدم الضوء المستقطب عبرت بشكل غير كامل لتعقب من الكريستال.
  3. إدخال قطعة من المناديل الورقية الجافة من خلال فتحة في ساترة في البئر وحتى يلمس فقط الحل الكثيرمن. الفتيل بعيدا حذرا الحللي تقريبا حتى يتم كل ذلك ذهب ثم قم بإزالة الأنسجة. هذا يتسبب في الكثيرمن المتبقية ومرحلة الاسفنج، مع الكريستال تزال في مكانها، لتتراجع تحت ساترة.
  4. نقاط، وقطع وإزالة مع ملاقط بقية ساترة، كما في القسم 4.1. في هذه الحالة، مرحلة الانقسامات الاسفنج، وبعض لا تزال في البئر والعصي إلى بعض ساترة. الكريستال هو في البلعة على ساترة. لأن هناك الكثيرمن الوقت الحاضر قليلة جدا، تبدأ المرحلة الاسفنج للخضوع لمرحلة انتقالية على الأرجح بسبب الجفاف. يمكن أن ينظر إلى هذا باعتباره حلقة من الانكسار أن يهاجر نحو وسط البلعة. إضافة إلى الكثيرمن فورا لوقف البلعة المرحلة الانتقالية. والبلعة الآن جاهزة للاستخدام في الحصاد وضوح الشمس.

7. الحصاد والبرد بلورات التبريد من المرحلة مكعب

  1. تذهب جيئة وذهابا بين الضوء المستقطب الطبيعي وعبرت لتحديد البلورات في البلعة المرحلة مكعب في البئر مفتوحة. في رويمكن ملاحظة تسلسل الفيديو له ما يصل إلى أربعة بلورات ثنائية الانكسار في البلعة المرحلة مكعب مع الضوء المستقطب المجهري.
  2. استخدام. شنت البرد حلقة (الشكل 5) للتحقيق في mesophase يتعرض لبلورات طازجة، لصيد السمك من بلورات ثم بانزلاق لهم، الواردة في البرد حلقة، في النيتروجين السائل في ديوار فور الحصاد من الناحية المثالية، ينبغي أن الحصاد والمفاجئة تبريد يحدث في اقتراح واحد المستمر والسريع. وينبغي أن تحصد اقل قدر ممكن من الالتزام mesophase مع الكريستال. في تجربتنا، ليست هناك حاجة البرد حاصن مع المتوسط ​​ويزرع في البلورات.
  3. لأنه ليس من الممكن أن نبحث عن الكريستال في البرد حلقة مباشرة بعد الحصاد تفقد البلعة mesophase تستخدم في حصاد للتحقق من أن الكريستال لم يعد هناك مما يشير إلى أن تم حصاده بنجاح.

8. الحصاد والبرد تبريد بلورات من المرحلة الإسفنج

  1. تذهب جيئة وذهابا بين الضوء المستقطب الطبيعي وعبرت لتحديد البلورات في الاسفنج البلعة المرحلة في البئر مفتوحة. يمكن في هذا التسلسل الفيديو أن ينظر بلورات ثنائية الانكسار كثيرة في بلعة تحت الضوء المستقطب المجهري.
  2. استخدام. شنت البرد حلقة (الشكل 5) لصيد السمك من بلورات من المرحلة الاسفنج ويغرق بها، الواردة في أو على cryoloop، في النيتروجين السائل في ديوار فور الحصاد كما هو الحال مع حصاد من مرحلة مكعب، من الناحية المثالية، ينبغي أن عملية التبريد البرد يحدث على الفور يتم صيد وضوح الشمس مع أقل وقت ممكن تفصل بين الحدث الفعلي الحصاد وتغرق في النيتروجين السائل. وينبغي أن تحصد اقل المرحلة الإسفنج الالتزام قدر الإمكان مع وضوح الشمس. كما لوحظ، لا يطلب البرد حاصن مع المتوسط ​​ويزرع في البلورات.

9. تخزين بلورات في دوار

  1. بعد أن أغرقت حلقة شنت في السائل نيtrogen وضعه في واحدة من فتحات عقد من عفريت التخزين في ديوار الرغوة. تتم كافة المعالجات مع الحلقة، الجزء العلوي من عصا المغناطيسي وعفريت والغارقة في النيتروجين السائل.
  2. تسجيل الموقع وتفاصيل عن المقطوع والكريستال البرد المبردة في دفتر الملاحظات و / أو على الكمبيوتر.
  3. عندما عفريت في ديوار رغوة ممتلئ أو حصاد لاكتمال نقل يوم عفريت عفريت إلى حامل الرف في التخزين أو النقل ديوار مليئة النيتروجين السائل. يمكن شحنها في دوار بلورات النقل إلى مرفق السنكروترون لجمع البيانات حيود.

10. ممثل النتائج

أظهرت أهداف المناورات الحصاد والبرد تبريد هنا لنقل الكريستال من mesophase استضافة البرد في الحلقات، لتزجج البلورة ويحلق لوضعه في المخازن في النيتروجين السائل في ديوار. الوضع المثالي هو المكان الحصاد وجتتم ريو التبريد في مثل هذه الطريقة التي يتم الاحتفاظ نوعية حيود من الكريستال في هذه العملية. كما ينبغي أن تحصد mesophase أقل قدر ممكن مع وضوح الشمس. هذا هو جعل تحديد مكان وجود وضوح الشمس وتركز ذلك في شعاع الأشعة السينية أن أقل تحديا، لتسريع البرد التبريد بهدف التزجيج، والتدخل للحد من التشرذم الخلفية من خلال جمع البيانات mesophase الحيود. وترد بعض الأمثلة من البرد وتبريد العينات التي يمكن ويمكن للالكريستال ألا ينظر في الشكل 6. حيث لا يمكن أن ينظر إليه من قبل الكريستال العين فإنه عادة ما يكون من الضروري اللجوء إلى rastering الحيود من أجل العثور على الكريستال ومركز تقنية المعلومات في شعاع لجمع البيانات 27.

الشكل 1
الشكل 1. تمثيل تخطيطي للغشاء البيولوجي تبين طبقة ثنائية المادة الدهنية في والتي عه تقع مجموعة متنوعة من البروتينات.

الشكل 2
الشكل 2. A محملة بالكامل ومختومة ساندويتش الزجاج 96-وحة تبلور بشكل جيد. كل بئر يحتوي على 50 مرحلة NL مكعب و 1 ميكرولتر حل الكثيرمن. من أجل الوضوح، وقد ملطخة المرحلة مكعب مع الأحمر السودان والحل يتضمن الكثيرمن الأزرق الميثيلين. من المرجع 5.

الشكل 3
الشكل 3. بلورات من البروتينات الغشاء نموا في mesophase شحمي. A. المرحلة مكعب من الكريستال مع رودوبسين جرثومي من H. halobium. B. المرحلة التي تحتوي على الاسفنج وضوح الشمس من فيتامين B12 BtuB مستقبلات / نقل، من E. القولونية. من مرجع 25. المراحل مكعب والإسفنج والمتناقضة appearances كما هو واضح من خلال مقارنة لوحات A وباء المرحلة مكعب في شكله A هو لزج للغاية ويحتفظ الأصلي. لا تتدفق. هذا واضح بصورة خاصة في حواف البلعة mesophase أن تكون ذات مظهر خشن. من العقد، المرحلة الإسفنج إلى حد كبير أقل لزوجة ويفعل التدفق. وهكذا، فإن المرحلة الإسفنج فشل في الاحتفاظ بشكلها الأصلي وأطرافها على نحو سلس مميز. يمكن أن تشمل مسببات Jeffamine، PEG 400، 2-الميثيل-2 ،4-pentandiol، ثريتول تترانيترات propoxylate، وبيوتانديول الهيكسنديول، يؤدي إلى الانتقال من مرحلة إلى مكعب الإسفنج 4،26.

الشكل 4
الشكل 4. ومخطط يلخص الخطوات المتبعة في حصاد وإنتاج وتبريد البرد في المتوسط ​​من بلورات البروتين، نمت غشاء (A). فقط تلك الخطوات محاطة الأحمر متقطعوتغطي الخط، ووصف بالتفصيل في (B)، في هذه المقالة إن الرب. الفريق هو من المرجع 3. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 5
الشكل 5. شنت فارغة البرد حلقة دبوس على أن يقام في مكان على عصا المغناطيسي. المشاهدات الموسع للدبوس (A) والصغرى جبل ل(ب) من هذه أداة هامة لتجميع وتبريد البرد ترد. حلقة فارغة في نهاية الدقيقة في جبل B هو 30 ميكرومتر في القطر. في حين وجود لم تختبر أنواع أخرى حلقة نطاق واسع، نجد أن MiTeGen حلقات العمل المعروضة بشكل جيد مع كل مراحل مكعب والإسفنج.

الشكل 6
الشكل 6. المقطوع والبرد المبردة بلورات من البروتينات الغشاء في البرد كما هو الحال مع حلقات شاهدوا المجهر في الخط على beamline السنكروترون. B، A. أمثلة من بلورات حصاد (أوكسيديز السيتوكروم caa3 34 (A)، كيناز diacylglycerol، DgkA (B)) حيث بلورات (السهم الأزرق) مرئية من خلال mesophase البرد المبردة على مثال C. البرد حلقة. من حيث الكريستال المقطوع غير مرئية في mesophase البرد المبردة على البرد حلقة. يتم تعريف غيض من حلقة مع سهم أحمر. يتم التعرف على الالتزام البرد المبردة mesophase مع السهم الأزرق.

Discussion

في هذه المقالة الفيديو أثبتنا كيف يتم حصاد بلورات نمت في mesophase شحمي والبرد تبريد استعدادا لاستخدامها في جمع البيانات والحيود في نهاية المطاف لتحديد الهيكل. يمكن للmesophase استضافة تكون المرحلة لزج ودبق أو مكعب المرحلة الإسفنج أكثر مرونة 4. كيف يتم فتح الزجاج لوحات ساندويتش وكيف يتم حصاد هذه البلورات كثيرا يعتمد على نوع mesophase. ولذا فمن المهم أن تعرف أي واحد اثنين من يتعامل مع في وقت مبكر. هوية الدهون استضافة ومرسب المستخدمة هي هامة في هذا الصدد، والمظهر الخارجي للبلعة mesophase في التبلور بشكل جيد يمكن استخدامها لتمييزها عن بعضها البعض (الشكل 3). وقد تجلى الحصاد من كل أنواع mesophase في هذه المقالة.

حصاد بلورات صغيرة من mesophase شحمي في لوحات ساندويتش الزجاج هو عملية مضنية تتطلب وقتا ومهارة، experيتزوج والصبر ومطرد من ناحية. من المهم أن يوضع جانبا مبلغ مناسب من الوقت لجمع وإعداد المختبر حتى يتسنى لجميع اللوازم والمعدات هي في متناول اليد مقدما. A الشخص الثاني للمساعدة في الحصاد ليست ضرورية ولكنها أوصت و. يمكن أن تساعد الشخص مع توريد لوحات ما قبل ملحوظ على الفرد القيام الحصاد وكذلك وضع البرد المبردة الحلقات مزودة بلورات تحصد في عفريت التخزين. يمكن للمساعد أيضا أن تلعب دورا هاما في دعم توثيق الملاحظات على بلورات التي قدمت خلال الحصاد التي قد تكون حاسمة خلال جمع البيانات حيود. في حالة عدم وجود مساعد، يمكن أن تستخدم صوت تنشيط السمعية وتسجيل الجهاز لميزة للتوثيق.

وبعد بروتوكول الموصوفة في هذه المقالة مساعدة في الحصول على عارض وتشغيلها مع الحصاد وضوح الشمس. ومع ذلك، فمن المهم أن نقدر أن العملية ليست واضحة وأن تحليل مخاطر الآفاتوهناك حاجة إلى إطلاق ctice قبل الحصاد قيمة بلورات البروتين الغشاء. ولذلك فمن المستحسن أن جربت لوحات اختبار مع بلورات من البروتينات التي لا قيمة خاصة مع الأول. وهذا سيوفر على المبتديء مع خبرة قيمة في قطع الزجاج، وإزالة شظايا الزجاج، ورفع حتى ساترة من خلال mesophase، وذلك باستخدام ميزة الاستقطاب على المجهر لرؤية بلورات وتعقبهم أثناء الحصاد، وأخيرا التعامل مع أنواع مختلفة من mesophases والحصاد منها. نسيج من mesophase، وبالتالي السهولة التي يمكن حصادها بلورات، هل تغير مع مرور الوقت خلال التبلور. ولذلك فمن المهم لممارسة الحصاد مع بلورات أقل قيمة ولكن مع تلك التي نمت في ظل نفس الظروف ومنها أكثر قيمة. فمن الممكن أن تنمو بلورات الليزوزيم وthaumatin من قبل في المتوسط ​​شحمي أو أسلوب المرحلة مكعب 28 و ينبغي consid هذهered عن طريق كسب الألفة مع المواد والأسلوب. ينبغي للمرء أن ينظر أيضا العمل مع البروتين خالية mesophase أول من تعلم من تقلبات والخمسين.

تم الانتهاء من جميع الإجراءات أثبتت هنا في C ° 20 مريحة أو ما يقرب من ذلك. فمن الممكن أن تنمو بلورات من قبل في طريقة المتوسط ​​في درجات حرارة منخفضة. وبالتالي، يمكن استخدام الدهون monoolein كما في حالة استضافة المرحلة متبدل الاستقرار في 4 1،2،29،30 C °. والبديل هو استخدام تصميم بعقلانية 7،9 MAG لبلورة درجة حرارة منخفضة 31. نفعل انخفاض درجة الحرارة بشكل روتيني crysallogenesis مع بعض الأهداف البروتين الغشاء. في هذه الحالة، يتم نمو البلورات والحصاد في الثلاجة المشي في ° C 4. العمل في ظل هذه الظروف والتحديات الخاصة به وليس أقلها الذي هو الحاجة إلى الملابس دافئة ومريحة.

الخطوة التالية في العملية الشاملة لتصميم هيكل الجزيئات باستخدام بلورةtallography هو جمع البيانات حيود على بلورات حصاد وبرد الإضافية كما هو موضح في هذه المقالة. في المتوسط ​​نابعة من بلورات وعادة ما تكون صغيرة. ومع ذلك، فقد كانت مفيدة لجمع البيانات حيود ممكن مع وجود بلورات بعدا أقصى 20 ميكرون 9. لهذا الغرض، يتم استخدام شعاع السنكروترون الصغيرة X-الإشعاع وهو محور مقالة منفصلة إن الرب في هذه السلسلة 32،33.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

هناك العديد من الذين ساهموا في هذا العمل ومعظمها من الغشاء Caffrey الهيكلية والوظيفية المجموعة الأحياء، وكلاهما عضو في الماضي والحاضر. للجميع، وخاصة ليون وتان جينغ تشيوان يوسف، نتقدم بأحر الشكر والتقدير. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم ايرلندا (07/IN.1/B1836)، والمعاهد الوطنية للصحة (GM75915، وP50GM073210 U54GM094599)، وCOST FP7 وماري كوري الإجراءات (وPIEF CM0902-GA 2009- -235612).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Curved tweezers Sigma F4142 Tool
Disposable pipette tips Gilson Various Disposable
Foam dewar Spearlab FD-500 Tool
Glass and metal waste containers Daniels Healthcare DD479OL Tool
Harvesting loops MiTeGen Various Tool
Harvesting microscope Nikon SMZ1500 Tool
Lab notebook Various NA Tool
Magnetic push button sample loading wand Hampton Research/Molecular Dimensions HR4-729/MD7-411 Tool
Original Puck (for use with ALS-style robots only) Crystal Positioning Systems CP-111-035 Tool
Pipetting devices Gilson Various Tool
Precipitant solutions Various Various Reagent
Puck Bent Cryo-Tong Crystal Positioning Systems CP-111-030 Tool
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod Crystal Positioning Systems CP-111-029 Tool
Purified water Millipore Reagent
Safety goggles Various NA Tool
Sample Pin Bases - Magnetic (non-copper) Crystal Positioning Systems CP-111-015 Tool
Shipping dewar Taylor-wharton CX100 Tool
Tissues NA NA Disposable
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) Silverline Tools (Yeovil, UK) 633657 Tool

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Caffrey, M. Crystallizing membrane proteins for structure determination: use of lipidic mesophases. Annu. Rev. Biophys. 38, 29-51 (2009).
  2. Caffrey, M., Li, D., Dukkipati, A. Membrane protein structure determination using crystallography and lipidic mesophases - recent advances and successes. Biochemistry. Forthcoming (2012).
  3. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protocols. 4, 706-731 (2009).
  4. Cherezov, V., Clogston, J., Papiz, M. Z., Caffrey, M. Room to move: crystallizing membrane proteins in swollen lipidic mesophases. J. Mol. Biol. 357, 1605-1618 (2006).
  5. Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases. Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).
  6. Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Setvens, R. C. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318, 1258-1265 (2007).
  7. Chien, E. Y., Liu, W., Zhao, Q., Katritch, V., Han, G. W., Hanson, M. A., Shi, L., Newman, A. H., Javitch, J. A., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structure of the human dopamine D3 receptor in complex with a D2/D3 selective antagonist. Science. 330, 1091-1095 (2010).
  8. Granier, S., Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Weis, W. I., Kobilka, B. K. Structure of the delta-opioid receptor bound to naltrindole. Nature. 485, 400-404 (2012).
  9. Haga, K., Kruse, A. C., Asada, H., Yurugi-Kobayashi, T., Shiroishi, M., Zhang, C., Weis, W. I., Okada, T., Kobilka, B. K., Haga, T., Kobayashi, T. Structure of the human M2 muscarinic acetylcholine receptor bound to an antagonist. Nature. 482, 547-551 (2012).
  10. Hanson, M. A., Roth, B., Jo, E., Griffith, M. T., Scott, F. L., Reinhart, G., Desale, H., Clemons, B., Cahalan, S. M., Schuerer, S. C. Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor. Science. 335, 851-855 (2012).
  11. Jaakola, V. P., Griffith, M. T., Hanson, M. A., Cherezov, V., Chien, E. Y., Lane, J. R., Ijzerman, A. P., Stevens, R. C. The 2.6 angstrom crystal structure of a human A2A adenosine receptor bound to an antagonist. Science. 322, 1211-1217 (2008).
  12. Kruse, A. C., Hu, J., Pan, A. C., Arlow, D. H., Rosenbaum, D. M., Rosemond, E., Green, H. F., Liu, T., Chae, P. S., Dror, R. O. Structure and dynamics of the M3 muscarinic acetylcholine receptor. Nature. 482, 552-556 (2012).
  13. Manglik, A., Kruse, A. C., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Mathiesen, J. M., Sunahara, R. K., Pardo, L., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Granier, S. Crystal structure of the micro-opioid receptor bound to a morphinan antagonist. Nature. 485, 321-326 (2012).
  14. Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Fung, J. J., Pardon, E., Casarosa, P., Chae, P. S., Devree, B. T., Rosenbaum, D. M., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Schnapp, A., Konetzki, I., Sunahara, R. K., Gellman, S. H., Pautsch, A., Steyaert, J., Weis, W. I., Kobilka, B. K. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469, 175-180 (2011).
  15. Rasmussen, S. G. F., Devree, B. T., Zou, Y., Kruse, A. C., Chung, K. Y., Kobilka, T. S., Thian, F. S., Chae, P. S., Pardon, E., Calinski, D. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477, 549-555 (2011).
  16. Rosenbaum, D. M., Cherezov, V., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Yao, X. J., Weis, W. I., Stevens, R. C. GPCR engineering yields high-resolution structural insights into beta2-adrenergic receptor function. Science. 318, 1266-1273 (2007).
  17. Rosenbaum, D. M., Zhang, C., Lyons, J. A., Holl, R., Aragao, D., Arlow, D. H., Rasmussen, S. G., Choi, H. J., Devree, B. T. Structure and function of an irreversible agonist-beta(2) adrenoceptor complex. Nature. 469, 236-240 (2011).
  18. Shimamura, T., Shiroishi, M., Weyand, S., Tsujimoto, H., Winter, G., Katritch, V., Abagyan, R., Cherezov, V., Liu, W., Han, G. W., Kobayashi, T., Setvens, R. C., Iwata, S. Structure of the human histamine H1 receptor complex with doxepin. Nature. 475, 65-70 (2011).
  19. Thompson, A. A., Liu, W., Chun, E., Katritch, V., We, H., Vardy, E., Huang, X. P., Trapella, C., Guerrini, R., Calo, G., Roth, B. L., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic. Nature. 485, 395-399 (2012).
  20. Wu, B., Chien, E. Y., Mol, C. D., Fenalti, G., Liu, W., Katritch, V., Abagyan, R., Brooun, A., Wells, P., Bi, F. C., Hamel, D. J., Kuhn, P., Handel, T. M., Cherezov, V., Stevens, R. C. Structures of the CXCR4 Chemokine GPCR with Small-Molecule and Cyclic Peptide Antagonists. Science. 330, 1066-1071 (2010).
  21. Wu, H., Wacker, D., Mileni, M., Katritch, V., Han, G. W., Vardy, E., Liu, W., Thompson, A. A., Huang, X. P., Carroll, F. I. Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic. Nature. 485, 327-332 (2012).
  22. Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets. Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).
  23. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J. Vis. Exp. (2011).
  24. Cherezov, V., Caffrey, M. Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).
  25. Cherezov, V., Caffrey, M. Picolitre-scale crystallization of membrane proteins. J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).
  26. Wöhri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization. Structure. 16, 1003-1009 (2008).
  27. Cherezov, V. Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron. 6, 587-597 (2009).
  28. Caffrey, M. A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).
  29. Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system. J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).
  30. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21, 223-234 (2000).
  31. Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. Rational design of lipid for membrane protein crystallization. J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).
  32. Caffrey, M., Porter, C. Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. e1712 (2010).
  33. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase. J. Vis. Exp. e4000 (2012).
  34. Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase. Nature. 10, (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics