Detectie van virale RNA door fluorescentie

Biology
 

Summary

Een fluorescentie

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vyboh, K., Ajamian, L., Mouland, A. J. Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (63), e4002, doi:10.3791/4002 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Virussen die cellen infecteren oproepen specifieke wijzigingen in de normale celfuncties, die dienen om energie en grondstoffen af ​​te leiden voor virale replicatie. Veel aspecten van de gastheercel functie worden gevorderd door virussen, meestal door de expressie van virale gen-producten die werven gastheercel eiwitten en machines. Bovendien, virussen ingenieur specifieke membraan organellen of tag op de mobiele blaasjes en motor eiwitten aan de regio's van de cel (tijdens de novo infectie, virussen coöpteren moleculaire motor eiwitten aan de kern richten richten, later, tijdens de montage virus, zullen ze kapen cellulaire machinerieën die zal helpen bij de assemblage van virussen). Minder is wel te verstaan ​​over de manier waarop virussen, met name die met een RNA genoom, het coördineren van de intracellulair verkeer van zowel eiwit-en RNA-componenten en hoe ze te bereiken montage van infectieuze deeltjes op specifieke loci in de cel. De studie van RNA lokalisatie begon in eerder werk. Het ontwikkelen van een lagere eukaryote embryos en neuronale cellen die belangrijke biologische informatie, en ook gewezen op het belang van RNA lokalisatie in de programmering van genexpressie cascades. Het onderzoek in andere organismen en cel systemen heeft geleid tot soortgelijke belangrijke informatie. Virussen zijn obligate parasieten en moeten gebruik maken van hun gastheercellen te repliceren. Zo is het essentieel te begrijpen hoe RNA virussen de RNA-genomen richting van de kern via de nucleaire poriën door het cytoplasma en aan een van zijn eindbestemming, in voorloper virusdeeltjes 1.

FISH dient als een nuttig hulpmiddel om veranderingen in de steady-state lokalisatie van viraal RNA te identificeren. In combinatie met immunofluorescentie (IF) analyse 22, VIS / IF co-analyses zullen informatie geven over de co-lokalisatie van eiwitten met het virale RNA 3. Deze analyse geeft daarom een ​​goed uitgangspunt om voor RNA-eiwit interacties te testen door andere biochemische of biofysischetest 4,5, omdat co-localisatie is op zichzelf niet genoeg bewijs om zeker te zijn van een interactie. Bij het ​​bestuderen van viraal RNA lokalisatie met behulp van een methode als deze is, heeft veel informatie opgedaan op zowel virale en cellulaire RNA handel gebeurtenissen 6. Bijvoorbeeld, HIV-1 RNA produceert in de kern van geïnfecteerde cellen, maar de RNA alleen vertaald in het cytoplasma. Wanneer een toets viraal eiwit ontbreekt (Rev) 7 is FISH van het virale RNA gebleken dat het blok van virale replicatie door het behoud van de HIV-1 RNA genomische in de kern 8.

Hier wordt de gevolgde methode voor visuele analyse van genomisch viraal RNA in situ. De methode maakt gebruik van een gelabeld RNA probe. Deze sonde is ontworpen om een ​​aanvulling op het virale genoom RNA. Tijdens de in vitro synthese van de antisense RNA probe de ribonucleotide die is gemodificeerd met digoxigenine (DIG) is opgenomen in een in vitro transcription reactie. Zodra de probe gehybridiseerd is de doel-mRNA in cellen worden vervolgens antilichaam labeling stappen (figuur 1) tonen de lokalisatie van de mRNA en eiwit van belang bij het ​​uitvoeren FISH / IF.

Protocol

1. Probe Voorbereiding

  1. Digest 1 pg van het in vitro transcriptie vector, pKS (+) pol 236nt 9 met Kpn1 enzym bij 37 ° C gedurende 1 uur en loopt het gelineariseerde DNA product op een agarose gel. Het fragment dient ongeveer 2500 bp.
  2. Snij het ​​fragment van de gel en zuiveren met de Roche Micro Elueer gelextractiekit (alle gebruikte reagentia worden in tabel 1). Voer de laatste elutie in 30 pi elutiebuffer. Run 5 ul van het product op een agarose gel om de zuivering te controleren.
  3. Meng een in vitro transcriptie reactie (zie onderstaand recept) met de DIG Roche RNA labeling kit en incuberen bij 37 ° C gedurende 2 uur.

In vitro transcriptie reactie:

Gelineariseerde DNA 23 pl
1X DIG RNA etikettering mix (Roche) 4 pi
1X Transcription buffer 8 pl
20U RNase UIT 1 pi
80U T7 RNA-polymerase 4 pi
Totaal 40 pi
  1. Voeg 228 U van DNase I en incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
  2. Stop de reactie door toevoeging EDTA pH 8,0 tot een eindconcentratie van 20 mM.
  3. Zuiver de reactie met behulp van de Quick Spin kolommen van Roche zoals gespecificeerd door de fabrikant.
  4. Zuiver de sonde door neerslag met 1/10 volume DEPC behandeld met 3M NaOAc pH 5,2 en 2,5 volumes van ijskoude 95% ethanol. Mengen en incuberen bij -80 ° C gedurende 30 min een nacht.
  5. Centrifugeer de sonde 15 min bij 4 ° C bij 15.000 x g.
  6. Verwijder het supernatant en was de pellet in ijskoude 70% ethanol. Centrifugeer opnieuw gedurende 5 min bij 4 ° C bij 15.000 x g.
  7. Verwijder het supernatant en droog de pellet. Resuspendeer de pellet in 50 ul water (DNase / RNase gratis) met 10 U Invitrogen RNase OUT.
  8. Bereken de concentratie van probe spectrofotometrisch (maatregel RNA bij 260 nm), en verdund tot een concentratie van 5 ng / pl. Bewaren in fracties bij -20 ° C voor kortdurend gebruik, of -80 ° C voor opslag op lange termijn. Het wordt aanbevolen om onder assay vergelijkingen uit te voeren, zodat behoud van een hoeveelheid voor.

2. Cell Fixatie

  1. Het is in eerste instantie belangrijk om zaad hechtende cellen op onbehandeld, steriele glazen dekglaasjes zodat de uiteindelijke confluentie na de oogst is ongeveer 70-80%. Voor niet-hechtende cellen groeien normaal en wanneer bereid verzamelen, te incuberen met dekglaasjes die zijn 0,01% w / v poly-L-lysine (Sigma-Aldrich, Inc) behandeld gedurende 1 uur. Voor een typische 12 en polystyreen weefselkweek plaat (3,8 cm 2) worden 150.000 cellen (bijv. HeLa) uitgeplaat 24 uur voorafgaand aan transfectie. Niet-hechtende cellen geïnfecteerd of getransfecteerd zoals gebruikelijk en mag adhier om dekglaasjes voor fixatie 3.
  2. Gooi de media en was de cellen met 1X fosfaat-gebufferde zoutoplossing bereid in dubbel gedistilleerd water (DPBS) gedurende 1 minuut. Diethylpyrocarbonaat (DEPC, Sigma-Aldrich, Inc) behandelde 1X PBS kunnen ook worden gebruikt, kunnen echter onbehandelde PBS niet omdat kan RNase enzymen.
  3. Gooi de PBS en voeg 4% paraformaldehyde, genoeg om volledig te bedekken de cellen. Incubeer gedurende 15-20 minuten.
  4. Gooi de paraformaldeyhyde en was cellen met 1X DPBS gedurende 1 minuut.
  5. Gooi de DPBS en voeg 0,1 M glycine (opgelost in 1X DPBS). Incubeer gedurende 10 minuten.
  6. Gooi de glycine en was de cellen met 1X DPBS gedurende 1 minuut.
  7. Gooi de DPBS en voeg 0,2% Triton-X (opgelost in 1X DPBS). Incubeer gedurende 5-10 minuten. Als kleuring voor nucleolair of nucleaire envelop-eiwitten, permeabilize met Triton X-100 voor niet meer dan 5 min of het eiwit wordt de lokalisatie en diffuus.
  8. Gooi Triton X-100 en was een keer in1X DPBS 1 min.
  9. Voor de lange-termijn opslag, vervang PBS met 70% ethanol en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal vier maanden. U kunt ook eenmaal meer wassen met 1X DPBS en beginnen te vissen.

3. Fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)

  1. Indien de dekglaasjes opgeslagen in ethanol, vervangen ethanol 1X DPBS en kunnen de cellen te rehydrateren gedurende 30 minuten. Rehydratatie kan 's nachts worden gedaan als de dekglaasjes worden opgeslagen bij 4 ° C.
  2. Was de dekglaasjes met 1X DPBS gedurende 1 minuut.
  3. Bereid je dia's aan het broeden op dekglaasjes en zorg te reinigen en goed te labelen ze.
  4. Voor een 18mm dekglaasje, voeg 50 ul DNase oplossing (25 eenheden / dekglaasje, los verkrijgbaar) aan de dia. Voeg de dekglaasje, waarbij u het cel zijde leggen en dat zij het incuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Was de dekglaasjes met 1X DPBS gedurende 1 minuut.
  6. Voeg 50 ul hybridisatiemengsel (zie recept) per dekglaasje opeen dia en incubeer het dekglaasje cel naar beneden gedurende 16-18 uur bij 42 ° C De incubatie moet worden uitgevoerd in een bak met een 50% formamide, 2X SSPE mix (12,5 ml gedeïoniseerd formamide, 2,5 ml 20X SSPE, 10 ml water).

Hybridisatiemengsel (voor een dekglaasje 50 pi):

Bedrag op voorraad Materiaal (bij uiteindelijke concentratie)
25 pi Formamide, 50% (gedeïoniseerd; elke bron)
5 il (10 mg / ml) tRNA, 1 mg / ml (Sigma-Aldrich, Inc)
5 il (20X) SSPE, 2X
5 il (van 50X) Denharts, 5x
0,125 pi (5 eenheden) RNase UIT
5 pi (25 ng 5 ng / pl) Sonde
5 pi H2O DEPC, de uiteindelijke tevolume 50 ul
  1. Incubeer dekglaasjes cel naar beneden in 50 pi 50% formamide (verdund in 1X DPBS) gedurende 15 minuten bij 42 ° C.
  2. Tweemaal wassen de dekglaasjes in 2X SSPE door incubatie deze cel naar beneden in 50 pi 2X SSPE (20X SSPE verdund in 1X DPBS) gedurende 5 min elk bij 42 ° C.
  3. Was de dekglaasjes in 1X DPBS gedurende 1 minuut.

4. Immunofluorescentiekleuring

  1. Blok de dekglaasjes door ze cel naar beneden in 50 pi 1X Roche blokkeeroplossing (10X Roche blokkeren verdund in 1X DPBS) gedurende 30 minuten.
  2. Incubeer de dekglaasjes cel naar beneden in 50 pi primaire antilichaam oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C. Anti-DIG antistof worden verdund volgens fabrikant richting 1X blokkeeroplossing. Als andere antilichamen worden gebruikt om eiwitten vlek, kunnen zij worden toegevoegd aan het juiste concentratie voorwaarde dat alle gebruikte antilichamen zijn afgeleid van verschillende gastheer specn.
  3. Was de dekglaasjes gedurende 10 min in 1X DPBS.
  4. Incubeer de dekglaasjes cel naar beneden in 50 pi secundair antilichaam oplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C. Alexa Fluor-geconjugeerde antilichamen (Invitrogen) kan worden gebruikt om verschillende kleuren genereren en worden op 1:500 in 1X blokkeeroplossing, 1X DPBS.
  5. Was twee keer de dekglaasjes gedurende 10 minuten elk in 1X DPBS.
  6. Droog de dekglaasjes cel kant naar boven op Whatman papier. Zorg ervoor dat u de dekglaasjes dekking van blootstelling aan licht en bleken te voorkomen.
  7. Zodra alle vloeistof is verdampt, monteren de dekglaasjes op verse dia's met 8 pi ImmunoMount (Thermo Scientific, Inc.) Tik voorzichtig naar beneden het dekglaasje om eventuele luchtbellen te verwijderen.
  8. Breng nagellak aan de randen van het dekglaasje om deze vast te zetten.
  9. De visualisatie van RNA en eiwitten door microscopische technieken is ook cruciaal voor het succes van deze techniek. Instellingen op de gebruikte microscoop kan helpen of hinderen visualisatie dus het is belangrijk dat deinstellingen van de microscoop goed ingesteld en consistent ene monster elkaar in een bepaalde proef. Voor gedetailleerde microscopie instellingen, optica en antilichaam combinaties zie referenties 1,10.

5. Representatieve resultaten

Een voorbeeld van virale RNA kleuring te zien in figuur 2. Het virale RNA voor HIV-1 is te zien in het cytoplasma diffuus weergegeven voor het grootste deel, hoewel kleine cytoplasmatische punctae zijn niet ongewoon. De specificiteit kan worden gezien door het vergelijken van positieve cellen naar de omliggende cellen die geen fluorescentie weer te geven. Zoals in de inleiding, HIV-1 die de regulerende Rev eiwit mist produceert RNA dat wordt vastgehouden in de kern: dit kan gezien worden als een heldere signaal in de kern, en een gebrek aan RNA fluorescentiesignaal in het cytoplasma. Overexpressie van cellulaire eiwitten kan ook verschuiving van de verdeling van de HIV-1 RNA. In figuur 2 11 of N-terminaal verwijderd RILP (RILPN) 11, en ​​eiwitten die interfereren met dyneine motorische functie [bv p50/dynamitin 1, 12], interfereren met de normale stationaire toestand lokalisatie van het virale genoom RNA bepaald door FISH analyse RILP expressie leidt opnieuw lokalisatie van het virale genoom RNA het microtubule organisatie centrum (MTOC) 13;. RILPN dispergeert late endosomen in de cytoplasma als gevolg van het onvermogen om te binden aan p150 gelijmd van de dyneine motor complex 14 en p50/dynamitin blokkeert de grote subeenheid van dyneine motor en releases endosomen laat, maar ook het virale genoom RNA en HIV-1 structurele eiwitten van de cel periferie 1 (Figuur 2). De manipulatie van de steady-state lokalisatie van het virale genoom RNA, een belangrijke bijdrage leveren aan de besmettelijkheid vanvirusdeeltjes, zou in de eventuele ontwikkeling van geneesmiddelen. In onze handen viraal RNA in de cel reeds op 3 uur na transfectie en infectie 10 en wordt gemakkelijker door deze FISH techniek 12 uur.

Figuur 1
Figuur 1. Stroomschema van het protocol voor FISH / IF co-analyses. De cellen worden gekweekt op dekglaasjes en daarna gefixeerd met paraformaldehyde. Behandelingen glycine en Triton-X worden uitgevoerd voordat de cellen worden gebruikt voor hetzij FISH / IF of opgeslagen in 70% ethanol voor opslag. Cellen gedehydrateerd voor opslag worden gerehydrateerd in 1X DPBS (DEPC behandelde PBS) alvorens verder te gaan met FISH / IF. Cellen worden behandeld met DNase I en liet nacht te hybridiseren met de probe. Na hybridisatie is voltooid, worden de cellen gewassen met formamide, en met SSPE, en een laatste 1X DPBS spoelen. Blokkeren oplossing wordt aangebracht op de cellen, gevolgd door incubatie metde primaire antilichamen. Na het wassen worden secundaire antilichamen toegepast. Laatste twee wasbeurten in 1X DPBS completeren het kleuringsprocedure waar op de dekglaasjes worden gedroogd en gemonteerd op dia's voor de beeldvorming.

Figuur 2
Figuur 2. Representatieve resultaten met FISH / IF co-analyses. A) HIV-1 wordt getransfecteerd in HeLa-cellen en in sommige gevallen met constructen die de expressie van cellulaire eiwitten (RILP, p50/Dynamitin en RILPΔN (een amino-terminale deletie mutant) veroorzaken) . FISH / IF co-analyses werd uitgevoerd: RNA wordt aangeduid in het groen met een G3BP of LAMP1 (rood) te differentiëren. B) HIV-1 wordt uitgedrukt in HeLa en verzameld op verschillende tijdstippen. Viraal RNA expressie wordt gevolgd in het groen, terwijl het cellulaire eiwit, hnRNP A1, is gekleurd in het rood. Grootte balken 10 urn. Afbeeldingen gewijzigd ten opzichte van referenties 1 (selecteer cijfers van panel A; RILP, p50/Dynamitin en RILP deltaN)en 17 (panel B).

Discussion

FISH / IF co-analyse is een betrouwbare methode om virale RNA te visualiseren in cellen die nu is geraffineerd 9,15,16. In de loop van enkele jaren, hebben we een verfijndere methode van kleuring voor RNA. Deze techniek kan worden gebruikt op een groot aantal celtypes die de sonde specifiek voor het doel RNA 17. Door het labelen van de sonde met DIG, zijn wij in staat het visualiseren van de RNA door eenvoudige kleuring. Wanneer kleuring voor RNA en andere eiwitten worden gecombineerd, FISH / IF co-analyses uitgegroeid tot een krachtig instrument om cellulaire structuren en eiwit / RNA-lokalisatie te observeren.

De specificiteit van de RNA detectie vrij hoog. Dit wordt geïllustreerd in figuur 2. In een deel van het originele werk dat zich richtte op virale genoom RNA lokalisatie, FISH vastgesteld dat een gebrek aan Rev viraal RNA gevangen in de kern 18. Aangezien dit is, heeft veel nieuwe informatie over virale genoom RNA lokalisatie is verkregen met behulp van de technique hier beschreven. Door overexpressie cellulaire eiwitten kunnen specifieke groepen en niet alle van het virale RNA gedwongen lokaliseren verschillende gebieden van de cel. RILP overexpressie, die lijkt op de fenotype verkregen wanneer hnRNP A2 is uitgeput door siRNA in HIV-1-expresserende cellen 13, waardoor de RNA zichtbaar ophopen op de MTOC. De virale genoom RNA kan worden geduwd om de cel omtrek uitschakelen van de min-end motor eiwit dyneine: p50/Dynamitin overexpressie of knockdown van de zware keten dyneine 1 resulteert in het vrijkomen van virale genoom RNA van intracellulaire domeinen van de cellulaire periferie ( Figuur 2). Een mutant van RILP, RILPΔN, die niet meer bindt de dyneine motor, verspreidt endosomen (getagged door LAMP1) in het cytoplasma, omdat ze niet meer actief gelokaliseerd in juxtanuclear domeinen. Deze resultaten wijzen op het idee van een plastic populatie van HIV-1 RNA genoom en in het bijzonder, dat verschillende zwembaden van HIV-1 genoomRNA bestaan ​​soms identificeerbare rollen in de virale replicatie cyclus. Dezelfde begrippen zijn reeds aangegeven voor het eiwit gecodeerd door dit mRNA, Gag 19.

Er zijn beperkingen aan het gebruik van FISH / IF co-analyses die zijn gerelateerd aan antilichaam keuze en beschikbaarheid. De optimalisatie van de beste combinatie van primaire en secundaire antilichamen, en de concentraties daarvan, zal de tijd nemen om te optimaliseren (zie tabel 1 & 2). Antilichamen gemaakt van hybridoma of geproduceerd door grote bedrijven kan hebben concentraties die overal variëren van 1:2 tot 1:2000, maar zorg ervoor dat de richtlijnen van de fabrikant voor het beste resultaat te volgen. De gastheer waarin het antilichaam geproduceerd moet worden overwogen. Mengen schapen met geit antilichamen moet worden vermeden in primaire en secundaire antilichamen als deze combinatie hoge achtergrond door cross-soortherkenning (gegevens niet getoond). Voor de Alexa-Fluor secondary antilichamen, kan de concentratie worden gebruikt 1:500 bijna elk antilichaam in de toestel. De andere nadeel van FISH / IF co-analyses, zoals beschreven in dit rapport is het vangt de RNA op de locatie bij steady-state, na cellen zijn gefixeerd en doorlaatbaar gemaakt met behulp van paraformaldehyde en wasmiddel (Figuur 1).

Er is echter RNA-imaging in levende cellen is bereikt door een verscheidenheid aan middelen 20-22, meestal in varianten van de virale RNA-genomen die zijn voorzien van tag door fluorescerende eiwitten zoals GFP. Echter aanvullende middelen om RNA-lokalisatie te identificeren in levende cellen blijven aan de oppervlakte. Deze nieuwe methoden betrekking op de tagging RNA door middel van Spinazie 23, SNAP 24, of MTRIP 2. Deze technieken lijden enkele nadelen waaronder de vereiste cellen permeabilize voor toevoeging substraten of een groep worden geconstrueerd om de mRNA labelen te detecteren mRNA microscopie. Immers de belangrijkste ADVAntage van FISH analyse beschreven in dit rapport ligt in het feit dat de natieve RNA ongewijzigde leidt tot de fysiologisch relevante resultaten.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

De auteurs danken verleden en huidige leden van het lab voor bijdragen aan de ontwikkeling van de methodiek die hier geschetst en Alan Cochrane voor advies. LA is een ontvanger van een Canadese Institutes of Health Research (CIHR) Doctoral Fellowship en AJM wordt ondersteund door een Fraser, Monat en MacPherson Career Award. Dit werk wordt ondersteund door een subsidie ​​van het CIHR (subsidie ​​# MOP-56974).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
18mm coverslips VWR international 48380 046
16% paraformaldehyde Polysciences, Inc. 18814 Dilute to 4% (wt/vol) in 1X DPBS
Triton-X OmniPur, EMD Millipore 9400
Micro Elute Gel Extraction Kit Roche Group D6294-02
DIG RNA Labelling Mix Roche Group 11277073910
Transcription T7 RNA Polymerase Invitrogen 18033-019
Quick Spin Columns Roche Group 11814427001
DNase I Invitrogen 18047-019
1X DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-250
Formamide EMD Millipore FX0420-8
tRNA Invitrogen 15401-021
RNase OUT Invitrogen 10777-019
Fluorescent Antibody Enhancer Set for DIG Detection #4 (blocking solution) Roche Group 1768506
Alexa Fluor secondary antibodies Invitrogen See Table 2
Hybridization Oven Boekel Scientific Model 24100
Microslides VWR international 48300-047
Immunomount Thermo Fisher Scientific, Inc. 9990402
Table 1. Identification of specific reagents and equipment
Species of anti-DIG antibody (dilution; company, catalogue number) Colours Alexa Fluor used (1:500)
Mouse (1:500;Sigma, B7405) green Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21202)
red Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse (Invitrogen, A21203)
blue Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (Invitrogen, A31571)
Sheep (1:200;Roche, 11376623) green Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11015)
red Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep (Invitrogen, A11016)
blue Alexa Fluor 647 donkey anti-sheep (Invitrogen, A21448)
Table 2. Combinations of secondary antibodies and anti-DIG listed with catalogue numbers and concentrations

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lehmann, M. Intracellular transport of human immunodeficiency virus type 1 genomic RNA and viral production are dependent on dynein motor function and late endosome positioning. J. Biol. Chem. 284, 14572-14585 (2009).
  2. Zurla, C., Lifland, A. W., Santangelo, P. J. Characterizing mRNA interactions with RNA granules during translation initiation inhibition. PLoS One. 6, e19727 (2011).
  3. Abrahamyan, L. G. Novel Staufen1 ribonucleoproteins prevent formation of stress granules but favour encapsidation of HIV-1 genomic RNA. J. Cell Sci. 123, 369-383 (2010).
  4. Milev, M. P., Brown, C. M., Mouland, A. J. Live cell visualization of the interactions between HIV-1 Gag and the cellular RNA-binding protein Staufen1. Retrovirology. 7, 41-41 (2010).
  5. Vercruysse, T. Measuring cooperative Rev protein-protein interactions on Rev responsive RNA by fluorescence resonance energy transfer. RNA Biol. 8, 316-324 (2011).
  6. Cullen, B. R. Nuclear mRNA export: insights from virology. Trends Biochem. Sci. 28, 419-424 (2003).
  7. Cmarko, D. Rev inhibition strongly affects intracellular distribution of human immunodeficiency virus type 1 RNAs. J Virol. 76, 10473-10484 (2002).
  8. Ajamian, L. Unexpected roles for UPF1 in HIV-1 RNA metabolism and translation. RNA. 14, 914-927 (2008).
  9. Beriault, V. A late role for the association of hnRNP A2 with the HIV-1 hnRNP A2 response elements in genomic RNA, Gag, and Vpr localization. J. Biol. Chem. 279, 44141-44153 (2004).
  10. Monette, A., Pante, N., Mouland, A. J. HIV-1 remodels the nuclear pore complex. J. Cell Biol. 193, 619-631 (2011).
  11. Jordens, I. The Rab7 effector protein RILP controls lysosomal transport by inducing the recruitment of dynein-dynactin motors. Curr. Biol. 11, 1680-1685 (2001).
  12. Schrader, M., King, S. J., Stroh, T. A., Schroer, T. A. Real time imaging reveals a peroxisomal reticulum in living cells. J. Cell Sci. 113 (Pt. 20), 3663-3671 (2000).
  13. Levesque, K. Trafficking of HIV-1 RNA is mediated by heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2 expression and impacts on viral assembly. Traffic. 7, 1177-1193 (2006).
  14. Rocha, N. Cholesterol sensor ORP1L contacts the ER protein VAP to control Rab7-RILP-p150 Glued and late endosome positioning. J. Cell Biol. 185, 1209-1225 (2009).
  15. Soros, V. B., Carvajal, H. V., Richard, S., Cochrane, A. W. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 Rev function by a dominant-negative mutant of Sam68 through sequestration of unspliced RNA at perinuclear bundles. J. Virol. 75, 8203-8215 (2001).
  16. Sanchez-Velar, N., Udofia, E. B., Yu, Z., Zapp, M. L. hRIP, a cellular cofactor for Rev function, promotes release of HIV RNAs from the perinuclear region. Genes Dev. 18, 23-34 (2004).
  17. Monette, A., Ajamian, L., Lopez-Lastra, M., Mouland, A. J. Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) induces the cytoplasmic retention of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 by disrupting nuclear import: implications for HIV-1 gene expression. J. Biol. Chem. 284, 31350-31362 (2009).
  18. Malim, M. H., Hauber, J., Le, S. Y., Maizel, J. V., Cullen, B. R. The HIV-1 rev trans-activator acts through a structured target sequence to activate nuclear export of unspliced viral mRNA. Nature. 338, 254-257 (1989).
  19. Klein, K. C., Reed, J. C., Lingappa, J. R. Intracellular destinies: degradation, targeting, assembly, and endocytosis of HIV Gag. AIDS Rev. 9, 150-161 (2007).
  20. Molle, D. Endosomal trafficking of HIV-1 gag and genomic RNAs regulates viral egress. J. Biol. Chem. 284, 19727-19743 (2009).
  21. Jouvenet, N., Bieniasz, P. D., Simon, S. M. Imaging the biogenesis of individual HIV-1 virions in live cells. Nature. 454, 236-240 (2008).
  22. Kemler, I., Meehan, A., Poeschla, E. M. Live-cell coimaging of the genomic RNAs and Gag proteins of two lentiviruses. J. Virol. 84, 6352-6366 (2010).
  23. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333, 642-646 (2011).
  24. Eckhardt, M. A SNAP-tagged derivative of HIV-1--a versatile tool to study virus-cell interactions. PLoS One. 6, e22007 (2011).

Comments

2 Comments

  1. This is a very interesting method, and your results look great! Have you attempted this method with tissue sections from animals, be in frozen or fixed or parafin embedded or anything like that?

    Reply
    Posted by: Joe M.
    August 6, 2012 - 12:40 PM
  2. Dear Kishanda Vyboh, Lara Ajamian, and Andrew J. Mouland:

    I am a students of eight year program of clinical medicine of Xiangya medical school, Central South university of China, and I have been doing a research for my M.D degree on Spinal Muscular Atrophy(SMA) . Now I have been doing research on the mechanism of the protein Survival Motor Neuron (SMN) during the fusion of myoblasts to form myotubes, and how it affects the development of skeletal muscle when SMN is reduced, as always seen in the biopsy of those SMA patients. My hypothesis is that the role of SMN is to transfer the mRNA of β-actin to the lamellepodia of fusing myoblast to produce β-actin locally, just the same as it dose in the development of neurons . And lamellepodia is the very organelle for migration and fusion. The key step is to prove the co-existence of the mRNA of β-actin, the protein of β-actin and the protein of SMN at the lamellepodia, and that when SMN is reduced, the β-actin protein is reduced at lamellepodia and more mRNA of β-actin is retained in the nucleus. That is quite new and it forced me to use some new technique----the combination of immunofluorescence and fluorescence in situ hybridization. However, the combination of IF-FISH is something new to our lab technicians. So I have found ² protocols newly published in ²01², and one is yoursA²88; http://www.jove.com/video/400²/detection-of-viral-rna-by-fluorescence-in-situ-hybridization-fishA²89;showing the whole process. I need your video very much because I have only 4 months left and it provides the best and the most direct guide to me. I have tried to subscribe it using my own account, but unfortunately I failed because WWW.JoVE Video.com only accepts the subscription from public institutions such as libraries. Then I have contacted the library of Xiangya medical school but with no reply yet. So could you kindly do me a favor to share this video with me? I will appreciate your great generosity, Thank you very much!
    Best wishes,
    Zhaotai Zeng,


    angukgong@163.com

    Reply
    Posted by: Zhaotai Z.
    February 14, 2013 - 10:44 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics