양적 휘트니스 분석 워크플로우

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Biology
 

Summary

양적 피트니스 분석 (QFA)는 미생물 문화 fitnesses을 계산하는 실험 및 전산 방법을 보완 시리즈입니다. QFA는 유전자 변이, 약물이나 미생물의 성장에있는 다른 적용 트리 트먼트의 효과를 추정하고있다. 단일 문화권의 focussed 분석에서 병렬 문화 수천 실험 스케일링을 설계할 수 있습니다.

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Banks, A. P., Lawless, C., Lydall, D. A. A Quantitative Fitness Analysis Workflow. J. Vis. Exp. (66), e4018, doi:10.3791/4018 (2012).

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Abstract

양적 피트니스 분석 (QFA)는 병렬 1,2,3,4 재배 미생물 문화 fitnesses을 비교하기위한 실험 및 전산 작업 흐름이다. QFA은 단일 문화 focussed 관찰에 적용하지만, 독립적인 문화 수천까지 조사 게놈 전체 유전자 상호 작용이나 약물 화면에 가장 유용합니다. 중앙 실험 방법은 incubated 정기적으로 촬영되는 고체 한천 플레이트를 향해 독립 묽은 액체 미생물 문화의 접종이다. 매번 포인트에서 사진이 양적 피트니스 조치 얻을 수 있도록, 성장 곡선을 만드는 데 사용되는 정량 셀 밀도 견적, 제작, 분석하고 있습니다. 문화 fitnesses는 계량 및 유전적 상호 작용 강점이나 약물 감성 순위를 비교할 수 있습니다. 모든 치료의 문화 적합성에 대한 효과는 기판 한천 (예 : 작은 분자, 항생제 또는 영양분)에 추가하거나 접시 외부에 적용단조 (예 : 자외선 조사, 온도)이 QFA에 의해 계량하실 수 있습니다.

QFA 흐름은 성장률이 96도 또는 200도 플레이트 리더에 평행 액체 문화의 분광 측정으로 얻은 것과 유사한 추정 생산하고 있습니다. 중요한 것은, QFA 같은 방법에 비해 훨씬 높은 처리량을 가지고 있습니다. QFA 배양 고체 한천 표면에 성장하므로 잘 교반이나 흔들림없이도 성장하는 동안 aerated됩니다.

QFA 처리량 일부 합성 유전자 배열 (SGA) 전형 방법 5,6의만큼 높지 않을 것입니다. QFA 문화가 많이 한천로 주사되기 전에 희석되기 때문에 그러나, QFA 3 지수와 채도 단계를 포함하여보다 완벽한 성장 곡선을 캡처할 수 있습니다. 예를 들어, 성장 곡선 관찰 이전에 논의로 문화 더블링 시간이, 높은 정밀도와 직접 견적을 계산할 수 있습니다.

여기 소개특정 QFA 프로토콜 S. 수천에 적용 자동 접종, 배양 및 이미징 동안 로봇에 의해 처리됩니다 cerevisiae 문화. 이러한 자동화된 단계에는 처리량의 관련 감소와 함께 이에 상응하는, 수동 프로 시저로 대체하고, 우리는 또한 낮은 처리량 매뉴얼 프로토콜을 제시 할 수 있습니다. 동일한 QFA 소프트웨어 도구 중 워크플로우에서 촬영한 이미지에 적용할 수 있습니다.

우리는 광범위한 경험 신진 효모의 문화 QFA를 적용했습니다 S. 하지만 우리는 QFA는 분열 효모의 문화를 조사에 동일하게 유용 것으로 cerevisiae를 기대 S. pombe와 세균성 문화.

Protocol

수동 QFA 프로토콜 (S. cerevisiae의 긴장 용)

1. Culturing 효모의 종자

  1. 최대 96 독립 효모 종자에는 96 - 웰 배양 접시에 풍부한 액체 미디어 200 μl에 배양해 있습니다. 변종은 배양기를 제어 온도에서 포화로 성장하고 있습니다.
  2. 96 핀, 1 / 8 "지름 수동 복제 도금 장이 (시그마 R-2508)가 처음으로 100 % 에탄올에 복제 광택히을 찍기 불타는 후 냉각 이별로 소독한다.
  3. 멸균 물 200 μl는 96 - 웰 배양 판에 arrayed있다. 포화 문화가 vortexed (Eppendorf MixMate, 30 초, 750 RPM)와 한 번 물을 포함하는 판에 다음 포화 직전에 세 번 소독 핀 도구를 찍기로 희석한다.
  4. 핀 도구는 1.2에 따라 다시 소독을하고 있습니다.
  5. 멸균 핀 도구는 희석 문화를 포함하는 판에 세 번을 찍기에 의해 판매 한천 플레이트에 희석 문화를 탐지하는 데 사용됩니다N 직사각형 솔리드 한천 플레이트에 핀 도구를 전송할 수 없습니다.
  6. 직사각형 솔리드 한천 플레이트는 수동으로 S & P 로보틱스 spImager를 사용하여 몇 군데되기 전에 적절한 온도에 incubated됩니다. 치료는 심지어 조명, 영상 카메라에 상대적으로 일관성 플레이트 포지셔닝을 보장하기 위해 촬영하는 경우 대체 이미지 캡쳐 방법은 같은 FujiFilm LAS4000, 또는 저렴 디지털 SLR 카메라로도 사용될 수 있습니다.
  7. 방법은 치료는 각 사진 중에 이미징 카메라에 동일한 각도 친척을 보장하기 위해 촬영한 경우 왕복 배양 접시에 장착되어 수 등 48과 같은 병렬 문화의 작은 숫자에 대한 적응이다.

완전 자동화된 QFA 프로토콜 (S. cerevisiae의 긴장 용)

2. Culturing 효모의 종자

  1. 고체 배지에서 성장하고 독립적인 효모 종자의 사각형 배열로 시작합니다. 이 예제에서는 시작 변종은 온도를 건너 결과입니다합성 유전자 배열 (SGA)에 의한 효모 삭제 콜렉션 (YDC)가있는 민감한 쿼리 돌연변이. 최종 SGA 번호판 1536 형식으로되어 있습니다. 이것은 384 독립 효모 종자의 복제 식민지 / 넷 대표 문화 24 열에 의해 16 행입니다. 플레이트 레이아웃을위한 그림 1을 참조하십시오.
  2. 1536의 아웃 384 변종은 선택적 미디어 200 μl (그림 1)을 포함하는 네 96 - 웰 배양 접시에 96 핀, 1 mm 핀 직경 멸균 pintool와 S & P 로보틱스 INC BM3-SC 로봇을 사용 robotically 전송됩니다. Pintool의 청결과 불임은 순차적으로, (파편을 제거하기 위해 회전 브러쉬와 함께 한) 두번 멸균 물 속에서 70 %의 에탄올 (sonication)와 마지막으로 100 % 에탄올을 세척하여 이루어진다.
  3. 문화가 (20에서 사흘 동안이 예제에서는 ° C, 그림 1 참조) 포화로 성장하고 있습니다.

3. 효모 문화를 구경하기

  1. Beckman Biomek FX, 채도 문화권을 사용하여Variomag의 Teleshake (20 초 동안 1000rpm에서 시계 바늘 횐전과 반대)에 vortexing에 의해 resuspended과 멸균 96 핀 로봇 핀 툴 (V & P 과학 pintool 마운트 마그네틱, 2 밀리미터 핀 직경)을 사용하여 200 μl 멸균 물에 달아하여 약 1:70 희석 재. 핀 도구 청결과 불임이 70 % 에탄올로 세정 (파편을 제거하는 브러쉬 포함) 그리고 마지막으로 건조 다음에 70 % 에탄올에서 수영, 멸균 물에 세척에 의해 이루어진다.
  2. 희석 문화는 청소 및 살균 후에 동일한 로봇 핀 도구를 (그림 1 참조)을 사용하여 384 형식의 고체 한천 플레이트에 목격하고 있습니다.
  3. 달아 후, 접시는 자동 회전 목마 및 액세스 해치와 Cytomat 온도 조절, humidified 인큐베이터으로 전송됩니다.

4. 이미지 캡처

  1. S & P 로보틱스 자동 영상기 반복, Cytomat 인큐베이터에서 접시를 제거 플레이트 뚜껑을 제거 동봉해 아래 정확하게 그들을 배치D, 캐논 EOS 반란군 티 35mm DSLR 아래에 균일하게 조명 공간, 5,184 X 3,456 픽셀 해상도로 이미지를 캡처 플레이트 뚜껑을 대체하고, 보육 회전 목마로 반환합니다. 하나의 이미지가 제로 시점의 성장 측정 (배경)을 할 수 있도록 보육에 대한 초기 전송에 따라 즉시 캡처합니다. 로봇 핸들링과 사진은 접시 당 2 분 정도 걸립니다.
  2. 완전히 로드된 회전 목마를 통해 최대 달성 플레이트 이미지 캡처 주파수는 하나는 있어야 매 여섯 시간입니다. 접시 6 일 (식민지 성장 채도까지를 위해 incubated되었습니다. 그림 1은 20 ° C. 번에 코스 세 전형적인 이미지를 보여줍니다
  3. 추적을 위해 플레이트는 인큐베이터에서 인큐베이터 이름, 온도, 독특한 순차 배치 번호 및 위치에 따라 지정됩니다. 이미지 이름은 플레이트 이름과 타임 스탬프에 연결하고 자동으로 (이미지 캡처에 따라 건설되는 등 K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, 파일 형식 FT1, Table1).

5. 실험 메타 데이터의 캡쳐

이 절에서 설명하는 메타 데이터 파일을 수동으로 (스프레드 시트 소프트웨어를 사용 예) 생성된 탭으로 구분된 텍스트 파일입니다. 실험 설명 파일 (FT2, 표 1) 각 실험에 고유한 것이지만, 라이브러리 설명 (FT3, 표 1)은 광범위하게 한번 만들어 다시 사용할 수 있습니다.

  1. 실험과 도서관을 위해 바코드 열이 (또는 자동으로 생성된 플레이트 이름) 포함하는 실험 설명 파일 (FT2, Table1), 실험 시작 타임 스탬프, 플레이트 처리, 고체 한천 배지, 대화명, 도서관, 차량 번호판 (의 내용에 설명되어 있습니다 여러 접시)와 1,536 포맷에서 384 포맷으로 다운 축소를위한 반복 - 쿼드런트 번호 (그림 1 참조).
  2. 효모 스트레인 도서관은 도서관에 대한 설명 파일 (FT3과 함께 설명되어 있습니다
  3. 상영중인 변종을 식별하는 각각의 체계적인 ORF 당 - 숫자 (예 : YDR217C)과 관련된 표준 유전자 이름 (예 : RAD9) 설명하는 선택적 표준 유전자 이름 파일 (FT4, 표 1) 제공할 수 있습니다. ORF 및 유전자 이름 :이 파일에는 두 개의 열이 포함되어 있습니다.

6. 데이터 분석

QFA 전산 작업 흐름 Colonyzer 이미지 분석 소프트웨어 도구 3,4 및 QFA R 패키지 7 설치된 합리적으로 강력한 멀티 코어 컴퓨터 워크 스테이션 (제온 쿼드 코어 2.67 GHz의 프로세서 및 12Gb RAM과 예 델 프리시젼 T3500)에 액세스해야 , 둘 다 온라인으로 문서화되어 자유롭게 사용할 수 있으며 운영 체제의 범위에서 실행됩니다.

  1. 캡처된 각각의 이미지에 대해 하나 Colonyzer 출력 파일 (FT5 표 1)을 생성, 입력으로 촬영된 접시 이미지 각각 Colonyzer를 실행합니다. Colonyzer 출력 파일은 문화 밀도 추정, 문화 지역, 모양과 몇 군데 접시에 384 각각의 위치에 대한 색상을 지정합니다. 출력 파일 이름이 자동으로 (예 : 접시 사진 K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, 표 1) Colonyzer 출력 파일 K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat에 해당합니다 (원본 이미지 파일 이름으로 복사됩니다 FT5, 표 1)).
  2. QFA R 패키지를 사용하여 실험적인 메타 데이터 (FT2, Table1)와 Colonyzer 출력 파일 (FT5 표 1)을로드합니다. 이러한 데이터는 추가 분석을위한 연구 데이터 프레임 (어떤이 QFA 원시 데이터 텍스트 파일 (FT6, 표 1)로 내보낼 수 있습니다)에 병합됩니다.
  3. QFA R 패키지는 일반 이오에 맞게, 각 문화에 대한 세포 밀도 timecourses를 수집하는 기능들을 포함하고관측 및 플롯에 gistic 인구 모델 모두 (그림 2 및 예제 3을 참조). 장착 매개 변수 값은 QFA 물류 매개 변수 파일 (FT7 표 1)에 기록됩니다. 자세한 사항 QFA R 패키지 설명서를 참조하십시오.
  4. QFA R 패키지는 또한 품질 관리를위한 기능들을 포함하고 있습니다 : 최첨단 식민지 판 벽, 스크린 특정 마커 유전자와 연동을 표시 SGA와 genotypes을 지키지 문화 근처 이미지 분석으로 판 가장자리와 난이도에 영양소보다 가용성에 의해 삭제됩니다 분석에서 제외됩니다.
  5. 몇 가지 양적 적합성 대책은 각 문화의 물류 인구 모델의 매개 변수에서 파생됩니다. 이들은 최대 인구 복제 속도 (MDR)과 접종에서 채도 (MDP)에 대한 부서의 전화 번호를 포함합니다. 복제 문화의 각 집합 (예 : 고유 유전자형의) 내용과 각 피트니스 정의에 대해, 피트니스 견적 여러 요약 통계는 광고입니다uted :의 평균과 중앙값 피트니스, 피트니스 표준 편차와 번호가 관찰 복제합니다. 요약 통계는 자세한 분석을위한 QFA 휘트니스 요약 파일 (FT8, 표 1)에 출력, 유전자 상호 작용 점수 (FT9 표 1)의 예 : 계산입니다.

7. 대표 결과

그림 2는 대략 이일 이후에 감지되는 첫번째 셀 밀도 증가, ° C Colonyzer하여 계량으로 고체 한천 배지에서 20 성장 384 QFA 문화 중 하나가 일반적인 성장 곡선 밖을 보여줍니다. 이러한 지연 가능성이 고체 배지와 세포 밀도에 대한 감지의 하한선 향해 접종 후 문화 래그 단계의 결합 효과이다. 그림 3은 하나의 접시에서 촬영된 308과 비슷한 성장 곡선을 보여줍니다. 그림 4는 두 게놈 차원의 비교를 보여줍니다 유전자 추측하는 QFA 화면상호 작용 강점 (1에서 적응). QFA R 패키지 7도를위한 Q-값 (False로 디스커버리 속도 (루즈벨트) P-값 수정)와 함께, 그림 3을 생산하고 검사 genotypes와 유전자의 상호 작용 강도 (GIS)의 견적 순위 목록을 출력하는 기능이 포함되어 있습니다 관찰된 GIS의 중요성.

그림 1
1 그림. 384 스폿 형식의 효모 종자의 로봇 접종을위한 제도.이 절차는 접시 당 1,536 독립적 문화 (왼쪽)로 시작합니다. 이 전형적인 예에서는 순위 1,1에서 식민지, 1,2가, 2,1 및 2,2 (붉은 색)은 동일한 유전자형으로 복제 넷입니다 his3 :: 노란색의 KANMX 문화, 접시의 가장자리에 성장. 경쟁의 부족으로 성장 우위를 가지고 있으므로 QFA을 면밀히 검토하지 않습니다. 이 복제 중 하나 (예 1,1) 96 - 웰 플레이트에 액체 성장 미디어로 주사된다 s은 1,536 식민지 각 시간 96 inoculates 96 핀 도구를 사용합니다. 384 유전자 삭제, 네 가지 'quadrants "(빨강, 파랑, 초록, 보라색으로 표시됨) 하나씩 복제를 예방하기 위해서는 성장 미디어를 포함하는 네 가지 96 - 웰 플레이트에 주사한다. 포화로 성장 (예 : ° C ~ 20 3 일간) 후, 문화가 물에 희석되며, 다음 하나 반복에서 네 가지 quadrants은 원래 SGA 판과 같은 패턴으로 고체 한천 플레이트 (오른쪽)에 384 형식으로 발견된다 (같은 컬러로 표시). , 2,1와 2,2 1,2를 : 프로세스가 다른 복제 테스트 반복 수 있습니다. 오른쪽 예제 촬영된 이미지는 0.5, 2, 3.5 일 접종 후 캡처했다. 보충 그림 1 2에서 적응. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

018/4018fig2.jpg "/>
그림 2. 단일 로봇-캡처한 QFA 성장 곡선. 20 한천이 포함된 갈락토 오스를 ​​재배 효모 변형) QFA 성장 곡선 ° C. 이미지는 대략 2 시간마다 robotically 점령했다. 이 온도 지수 위상은 문화의 밀도 증가가 처음 접종 후 약 이일 감지되고 함께 약 1.5 일 동안 관찰할되었다. 일반 물류 모델은 관찰된 데이터 (회색 곡선)에 맞게되었습니다. 자동 QFA R 패키지가 장착되어 모델 매개 변수가 제공됩니다 : K (용량 (AU)를 들고), R (성장률 (D -1)), G (inoculum 밀도 (AU)), V를 (성장 대칭). B) 패널에 관해서는 로그 스케일의 세포 밀도로 꾸몄다 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

그림 3
그림 3. 자동 유전자 평점 성장 곡선은 하나의 384 포맷 플레이트에서 병렬로 캡처. 각 패널은 세포 밀도 추정 (빨간색 십자가)와 유전자 이름이나 ORF 당 - 숫자 QFA 절차 재배에 의해 분류된 독립 문화에 대한 모형 적합 (검은색 곡선)를 보여줍니다. 이 예제 플레이트는 로봇에 의해 몇 군데와 20 ° C.에 자동 인큐베이터에서 자란 플레이트 이름, 판 치료, 한천 배지 및 도서관 플레이트 번호 : 실험적 메타 데이터가 자동으로 그림 제목에 포함되어 있습니다. 장착 모델 매개 변수 값 또한 자동 (그림 2 참조) 각 패널에 인쇄됩니다. 가장자리 문화가이 음모의 308 문화 (QFA 프로토콜 5.4 참조)를 떠나, QFA 분석에서 제거되었습니다. 에지 문화가 QFA에서 분석되지 않고 있으므로, 이러한 문화 위치는 일반적으로 중성 제어 계통 (이 경우 pGAL-HIS3)로 채워진다. 이 그림의 원본 버전은 QFA R 패키지에 의해 출력.에 PDF 형식이므로 끝도 zoomable와 텍스트 쿼리에 의해 검색이 가능합니다.:/ / www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
4 그림. 유전자 상호 작용을 연역 두 QFA 화면에서 fitnesses을 비교.이 줄거리에 대해 중립 ura3Δ 돌연변이 또는 온도에 민감한 cdc13-1 돌연변이와 결합하고 준결승 허용 온도에서 성장 신진 효모 삭제 (yfgΔ)의 적합성 비교를 보여줍니다 cdc13- 1 (27 ° C). 휘트니스는 최대 복제 속도와 최대 복제 가능성 1의 제품으로 계산되었다. 대부분 삭제 변종은 중립 ura3Δ 돌연변이와 결합하면 예상대로 잘 성장과 높은 체력을 가지고 있지만, cdc13-1과 결합 삭제는 fitnesses 다양한 있습니다. 하늘색 라인이 일에서 건너중립 his3Δ 변이의 전자 위치는, 실선은 유전자 독립 선형 회귀 모델 (cdc13-1의 예상 적합성 yfgΔ ura3Δ yfgΔ 뮤턴트의 적합성 부여 돌연변이)과 점선이 같은 적합성의 라인입니다. 삭제 색이 녹색으로 크게 cdc13-1 계통의 휘트니스 결함을 향상시킬 수 있습니다. 붉은 색 크게 동일한 결함을 억제 삭제. 실선에서 어떤 변이 cdc13-1 yfgΔ의 수직 거리는 플레이트 조건 cdc13-1과 yfgΔ 사이의 유전적 상호 작용의 강도를 나타냅니다. cdc13-1의 강력한 진압 중 일부는 이전에 오른쪽 상단 근처 검문소 유전자, RAD17, DDC1과 RAD24와 nuclease EXO1의 신원을 확인하는주의. 누구 삭제 체력을 감소 유전자 근처 YKU80을 (단백질 Yku80을 상한 DNA의 수리 및 telomere 인코딩)를 포함 오른쪽 아래. 또한 함께 작동 유전자 중 일부 그룹이이 음모에 공동으로 위치하는 경향이 있습니다. 세 예를 들어 클러스터는 푸른 SPE1, SPE2SPE3으로 강조 표시됩니다 : DDR과 EST1에 참여 MRX 복합 : spermidine 합성 유전자, RAD17, DDC1과 RAD24 : 검사점 슬라이딩 클램프 및 검사점 클램프 로더, MRE11, RAD50XRS2의 인코딩 구성 요소를 & EST3 : 유전자 telomere 길이 조절에 관여. 보충 그림 1B 1 일부터 적응,이 음모가 생성된있는 원시 데이터는 여기에서 다운로드할 수 있습니다 http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/ . 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

"> 파일 ID 파일 형식 수동 준공 주파수 업데이트 필수 조건 FT1 플레이트 사진 아니 플레이트 & timepoint 당 예 FT2 실험 설명 예 실험 당 예 FT3 라이브러리 설명 예 도서관 당 예 FT4 표준 유전자 이름 예 도서관 당 아니 FT5 Colonyzer Ouput 아니 판 당 timepoint 당 예 FT6 QFA 원시 데이터 아니 실험 당 - FT7 아니 실험 당 - FT8 QFA 피트니스 요약 아니 실험 당 - FT9 QFA 유전자 상호 작용 Hitlist 아니 GIS 연구 당 (2 expts.) -

표 1. 전자 QFA 파일. 나열된 모든 파일 (제외 FT1)은 탭으로 구분된 텍스트 파일이며, 건설 또는 텍스트 편집 기나 스프레드 시트 소프트웨어를 사용하여 읽을 수 있습니다. 건설 QFA 메타 데이터 파일과 QFA 출력의 정확한 해석에 대한 자세한 내용을 보려면 QFA R 패키지 설명서 7 Colonyzer 소프트웨어 설명서 3 참조하시기 바랍니다.

표 2
표 2. 문화 적합성을 평가하는 방법이 있습니다. 기능 요약 및 요구미생물 배양 체력을 평가하기위한 방법의 수를 ments. Blomberg 8 시까지 검토는 이들 중 일부의 상세한 비교를 포함하고 있습니다. 더 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 .

Discussion

QFA은 여러 감각에 직접 셋 설립 벤치 규모의 미생물 기술의 후손 : 문화 희석 시리즈 스포트 테스트 9 aerated 액체 문화 9, 복제 도금 13 성장 곡선 결정. 이러한 세 가지 방법을 요약하고 QFA 및 표 2에있는 다른 높은 처리량 기법과 비교됩니다. 희석 시리즈 스폿 테스트 inoculum의 dilutions의 범위에서 성장 문화 일련의 식​​민지를 형성하는 기능으로 변형의 적합성을 정의하는 반면, 단일 문화의 반복 관측에 의한 QFA 측정 스트레인 헬스는 성장 곡선을 만들 수 있습니다. 단일 문화권에서 체력을 Quantifying 것은 더 많은 변종이 동일한 조건 하에서, 동시에 검사 할 수 있습니다. 다른 환경이나 유전적 배경에있는 문화 운동의 차이에 대해 테스트할 때 문화의 복제 배열은 대부분의 유용 스트레인 컬렉션의 반복 테스트를하실 수 있습니다. QFA 프로토콜 제공여기에, 독립적인 문화 (로봇 QFA, 표 2) 수천의 성장을 관찰 적합한 부화 및 이미지 한천 플레이트를 복제 예방하기 위해 고가의 로봇 장비를 사용합니다. QFA가 설립, 전통적인 실험실 기법을 기초로했기 때문에하지만, 그것은 또한 수동 단계 (수동 QFA, 표 2)와 로봇의 도움을 대체하여보다 싸게 많이 수행 할 수 있습니다. 수동 QFA는 수동 핀 도구 및 및 사진을위한 인큐베이터에서 접시의 수동 전송을 사용하여 한천 플레이트를 향해 문화 복제 및 접종을 포함한다. 동일한 전산 분석 워크플로우는 두 실험적인 디자인의 성장 곡선을 생성하는 데 적용할 수 있습니다.

QFA 휘트니스 견적은 비교적 정확하게 될 것 같습니다. 그림 4에서 기능적으로 관련 유전자 삭제 네 가지 예제 클러스터의 평균 fitnesses가 강조 표시됩니다. 이 independ의 각 기능과 관련된 유전자 클래스의 멤버 근접엔트 유전적 배경 (ura3Δcdc13-1) QFA 휘트니스 견적의 재현성을 나타냅니다. 예를 들어, 불과 3 유전자 삭제는 (아웃 가능 4,300의) 보존 MRX 복합의 세 멤버를 구분합니다.

미생물 종자의 성장 특성을 테스트하기 위해 QFA까지 고속 처리 대안 SGA 5,6, 분광 플레이트 판독기에 광학 밀도 속도론을 캡처 경쟁 barcoded 라이브러리에서 화면 11,12와 스크린을 포함 표 2에 요약하며 더욱 완벽하게 다른 여덟 설명되어 있습니다 10 . QFA와 문화가 고체 한천 표면 (한천 기반 방법, 표 2)에서 자라는 SGA 판은 로봇에 의해 신속하고 간편하게 처리할 수 있습니다. 고체 한천 표면 문화가 잘 성장 전역 aerated하고 전지는 사교적인 미생물들이 지역 사회 14 성장할 수 있도록 고정 문화권으로 성장할 수있다. 왼쪽 그대로, 미생물 커뮤니티자신의 마이크로 환경 등 에탄올과 같은 secreting 독소, 그리고 아마도 세포 사이에 신호를 ffect. 그러나 적절한 통기를 달성하는 데 필요한 액체 문화의 혼합 지속적인 성장을 인위적으로 자신의 모드에 영향을 미칠 수있는 미생물 지역 사회와 그들의 마이크로 환경을 방해. 문화 사이의 세포를 나르는 액체 많아요을위한 더 적은 기회가 있기 때문에 교차 오염은 고체 한천 방법에 우려의 적습니다. 오염 고체 한천 assays 외국 공기 매개로 미생물에 의해 발생하는 경우, 그것은 흔히 고체 한천 플레이트의 육안 검사에 의해 감지 집결하거나 제거할 수 있습니다.

QFA 처리량은 두 가지 방법으로 병렬 액체 방법에 비해 훨씬 높다. 우선, QFA (그리고 SGA) 접시에 주사 문화는 접시 당 독립적인 문화를 제공,보다 밀도가 함께 포장됩니다. QFA 년 308 문화권이 아닌 실험적인 첨단 문화 (그림 1) co.kr 사이트를 세지 않고, 일반적으로있다판 당 96 또는 100의 문화와 액체 문화를 병렬하는 앞에 서. 둘째, QFA 실험은 접시의 훨씬 더 큰 숫자에 따라 결정됩니다. 단일 QFA 실험에서 분석 번호판의 숫자에만 보육이나 따뜻한 방, 최소 허용 이미지 캡처 주파수와 최대 달성 캡처 주파수에서 사용 가능한 공간에 의해 제한되는 반면, 액체 성장 실험 접시의 수를 강력히 제한 플레이트 리더 (일반적으로 하나 또는 두 개의 접시) 또는 플레이트 리더 (일반적으로 25-50 접시)에 연결된 스태커의 용량에 의해. 우리는 최근에 37,884 동시 문화를주는 308 실험적인 문화를 가진 123 접시, 각에서 완전 자동화된 QFA 실험을 실시했습니다. 우리는 액체로 성장하고 독립적인 문화의 최대 달성 번호 96 (문화 / 플레이트)는 것을 예상하고 우리 QFA 처리량보다 열 배 가량 X 50 (플레이트 / 스태커) = 4,800. 액체 배양 화면에 대한 대안은 많은 자동 촉진제을 활용하는 것입니다병렬 wth 장치 (Blomberg 8 시까지 검토에서 표 1), 하나 또는 두 개의 접시의 용량을 가진 각. 각 장치의 온도 제어가 독립적이고, 그래서 조건이 똑같은 건 아니지만, 그들이한다고 가정하고,이 흐름은 적어도 190과 같은 장치가 QFA 처리량 (장치 당 200 액체 문화를 가정)과 일치하도록 요구한다.

요약에서는 QFA는 유용 소규모 focussed 실험 및 높은 처리량 화면에 모두 양적 성장 phenotypes를 수집하기 위해 적용할 수있는 고품질의 흐름이다. 그것은 로봇 장비에 대한 요구 사항 변화에 효과적으로 적용될 수있을만큼 유연합니다. QFA 작업 흐름의 전산 구성 요소를 자유롭게 사용할 오픈 소스 코드를 기반으로합니다.

Disclosures

관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.

Acknowledgments

우리는 기꺼이 우리의 연구실과 기술 지원 및 도움 토론 고령화와 영양 (CISBAN)의 통합 시스템 생물학을위한 센터의 모든 구성원을 인정합니다. 이 연구는 생명 공학 및 생물 과학 연구 협의회 (BBSRC) (BB/C008200/1)와 Wellcome 트러스트 (075,294, 093,088)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Replica Plater Sigma R-2508 96 pin manual pintool with 1/8 " diameter pins
Mix Mate Eppendorf 5353 000.014
Biomek FX Beckman A31842
Teleshake Thermo Scientific 50095890 Installed on Biomek FX
BM3-SC S&P Robotics Inc BM3-SC 192 shelf rotating carousel
spImager S&P Robotics Inc spImager High resolution manual imaging
spImager with Cytomat S&P Robotics Inc Custom Temperature controlled automated high resolution imaging
Cytomat 6001 with heat exchanger Thermo Scientific 51022222 Attached to spImager
Ecoline RE207 Lauda RE207 Attached to Cytomat
spImager with carousel S&P Robotics Inc Custom Automated high resolution imaging
Robot pin tool fixture for FP12pins V&P Scientific AFIX96FP12 N/A
96 x FP12 pins V&P Scientific FP12 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length
Docking Station for Pin Tool V&P Scientific VP425 Docking station base removed to allow fan drying of pins
Pin Cleaning Brush V&P Scientific VP425 N/A
Replica Plater Sigma R-2508 Manual pin tool
Nunc OmniTray with Lid Nunc 734-0490 N/A
96 well sterile polystyrene plates Greiner BioOne 655161 N/A
96 well sterile polystyrene lids Greiner BioOne 656171 N/A

Table 3. Specific reagents and equipment.

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References

  1. Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects. PLoS Genetics. 7, (4), e1001362 (2011).
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