Kantitatif Spor Analizi İş Akışı

* These authors contributed equally
Biology
 

Summary

Kantitatif Spor Analizi (QFA) mikrobiyal kültür uyumu tahmin etmek için deneysel ve hesaplamalı yöntemleri tamamlayıcı bir dizi. QFA genetik mutasyonlar, uyuşturucu ya da mikrop büyümesi üzerine uygulanan diğer tedavilerin etkisi tahmin ediyor. Tek kültür odaklı analiz paralel kültürlerin binlerce deneyler ölçekleme dizayn edilebilir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Banks, A. P., Lawless, C., Lydall, D. A. A Quantitative Fitness Analysis Workflow. J. Vis. Exp. (66), e4018, doi:10.3791/4018 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kantitatif Spor Analizi (QFA) paralel 1,2,3,4 yetiştirilen mikrobiyal kültürlerin uyumu karşılaştırmak için bir deney ve hesaplama iş akışıdır. QFA tek kültür odaklı gözlem uygulandı, ancak bağımsız kültürlerin binlerce kadar araştıran genom genetik etkileşim veya ilaç ekranlar için en yararlı olabilir. Merkezi deneysel yöntem inkübe ve düzenli çekilmiştir katı agar plaklarına bağımsız, seyreltik sıvı mikrobiyal kültürlerin aşılama olduğunu. Her zaman noktasından fotoğraflar nicel spor önlemler elde izin vererek, büyüme eğrileri oluşturmak için kullanılır kantitatif hücre yoğunluğu tahminleri, üretim, analiz edilir. Kültür uyumu ölçmek ve genetik etkileşimin güçlü veya ilaç hassasiyetleri rütbe karşılaştırılabilir. Herhangi bir tedavi kültür fitness üzerinde etkisi substrat agar (örneğin küçük moleküller, antibiyotikler veya besin) olarak eklenir veya plakaları dışarıdan uygulananly (örn. UV radyasyon, sıcaklık) QFA ile belirlenebilir.

QFA iş akışı büyüme oranı 96-veya 200-iyi plaka okuyucuları paralel sıvı kültürleri spektrofotometrik ölçülmesi ile elde edilen benzer tahmin üretir. Önemlisi, QFA tür yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha yüksek hızı daha vardır. QFA kültürleri sağlam bir agar yüzeyinde büyür ve bu nedenle de Karıştıktan gerek kalmadan büyüme sırasında havalandırılmakta.

QFA üretilen bazı Sentetik Genetik Array (SGA) tarama yöntemleri 5,6 o kadar yüksek değildir. QFA kültürlerin yoğun agara inoküle edilmeden önce seyreltilir beri Ancak, QFA 3 üstel ve doygunluk aşamaları da dahil olmak üzere daha kapsamlı büyüme eğrileri, yakalayabilir. Örneğin, büyüme eğrisi gözlemleri daha önce 1 anlatıldığı gibi kültür katlama süreleri, yüksek hassasiyetli doğrudan tahmin edilmesine olanak tanımaktadır.

Burada bir sunuyoruzBelirli QFA protokol S. binlerce uygulanan otomatik inokülasyon, inkübasyon ve görüntüleme sırasında robotlar tarafından işlenir cerevisiae kültürleri. Bu otomatik adımları herhangi üretilen bir azalma ile ilişkilendirilmiş, bir eşdeğer, manuel prosedürü ile değiştirilir, ve bu da daha düşük bir verim kılavuzu protokolü mevcut olabilir. Aynı QFA yazılım araçları ya da iş akışı içinde çekilen resimlere uygulanabilir.

Biz geniş bir deneyime tomurcuklanan maya kültürleri QFA uygulayarak var S. ama biz QFA fisyon maya kültürleri incelemek için eşit derecede yararlı olacağını bekliyoruz S. cerevisiae pombe ve bakteri kültürleri.

Protocol

Manuel QFA Protokolü (S. cerevisiae suşların için)

1. Kültüre Maya Suşları

  1. 96 kadar, bağımsız bir mantar suşlarına 96 bölümlü kültür çanağı bakımından zengin sıvı ortamın 200 ul içinde kültürlenmiştir. Suşlar inkübatör ısı kontrol doygunluk yetiştirilmektedir.
  2. Bir 96 pin, 1/8 "çap kılavuzu çoğaltma kaplamacı (Sigma R-2508) birinci,% 100 etanol içinde çoğaltma kaplamacı daldırma yanan ve ardından soğumaya bırakarak sterilize edilir.
  3. Steril su 200 ul bir 96-kuyucuklu kültürü plakası halinde dizilmiş edilir. Doymuş kültürleri vortekslenmiş (Eppendorf MixMate, 30 sn, 750 rpm) ve bir kez su içeren plakaya sonra doymuş suşlara üç kez steril iğne aracı daldırma seyreltilir.
  4. Pin aracı 1.2 göre tekrar sterilize edilir.
  5. Sterilize pin aracı seyreltilmiş kültürü içeren plaka içine üç kez daldırma tarafından satılan agar plaklarına seyreltilmiş kültür nokta için kullanılırn dikdörtgen bir katı agar için pin aracı aktarılması.
  6. Dikdörtgen katı agar elle S & P Robotik spImager görüntülendi edilmeden önce uygun bir sıcaklıkta inkübe edilir. Bakımı hatta aydınlatma ve görüntüleme kamerası göre tutarlı plaka konumlama sağlamak için alınırsa Alternatif görüntü yakalama yöntemleri gibi bir FujiFilm LAS4000, ya da daha az pahalı dijital SLR fotoğraf makinesi olarak da kullanılabilir olabilir.
  7. Metodu, her bakımı fotoğrafını sırasında görüntüleme makinesi için aynı açıyla sağlamak için alınırsa yuvarlak petri üzerine monte edilebilir örneğin 48 paralel olarak kültürler, daha az sayıda uyarlanabilir.

Tam Otomatik QFA Protokolü (S. cerevisiae suşların için)

2. Kültüre Maya Suşları

  1. Katı agar üzerinde büyüyen bağımsız maya suşları, dikdörtgen bir dizi ile başlayın. Bu örnekte, başlangıç ​​soyları bir sıcaklıkta geçen sonucudurSentetik Genetik Array (SGA) ile Maya Silme Collection (YDC) ile hassas sorgu mutasyon. Nihai SGD plakalar 1536 biçimindedir. Bu 384 bağımsız maya suşlarının çoğaltır koloni / dört temsil kültürler 24 sütun 16 satır olduğunu. Plaka düzenleri için Şekil 1'e bakınız.
  2. 1536 dışında 384 suşları seçici medya 200 ul (Şekil 1) içeren dört adet 96-kültür plakları bir 96 pin, 1 mm pin çapındaki steril pintool ile S & P Robotik A.Ş. BM3-SC robot kullanarak robotik aktarılır. Pintool temizlik ve kısırlığa sırayla, (kalıntı kaldırmak için bir döner bir fırça ile bir kez) iki kez steril su içinde% 70 etanol (sonikasyon ile) ve son olarak% 100 etanol yıkama ile elde edilir.
  3. Kültürleri (20 az üç gün için bu örnekte ° C bkz. Şekil 1) doygunluk için yetiştirilmektedir.

3. Maya Kültürler Spotting

  1. Beckman Biomek FX, doymuş kültürlerinin kullanılmasıBir Variomag Teleshake (20 saniye 1000rpm de saat yönünün tersine) üzerindeki vorteks tarafından süspanse ve steril bir 96 pin robotik pin aracı (V & P Bilimsel pintool montaj manyetik, 2 mm pin çapı) kullanarak 200 ul steril su içine iğneleyerek yaklaşık 1:70 seyreltilmiş yeniden. Pim aracı temizlik ve steril% 70 etanol ile yıkama (kalıntı kaldırmak için bir fırça ile) ve son olarak kurutulması ve ardından% 70 etanol içinde daldırma, steril su ile yıkama ve elde edilir.
  2. Seyreltilmiş kültürler temizlik ve sterilizasyon sonrası aynı robotik pin aracı (bkz. Şekil 1) kullanarak 384 formatında katı agar plaklarına fark vardır.
  3. Çivileme sonra, plakalar otomatik atlıkarınca ve giriş kapısı ile bir Cytomat sıcaklık kontrollü, nemli inkübatör aktarılır.

4. Görüntü Yakalama

  1. S & P Robotik otomatik görüntüleyici defalarca Cytomat inkübatör gelen plakaları kaldırır plaka kapağı kaldırır, bir içine altında tam yerleştirird, Canon EOS Rebel Ti 35mm DSLR altında eşit ışıklı alanı, 5184 x 3456 piksel çözünürlükte bir görüntü yakalar plaka kapağı yerine geçer ve inkübatör atlıkarınca onları döndürür. Bir görüntü bir sıfır zaman noktasında büyümenin ölçümü (arka plan) izin vermek için inkübatör için ilk transferi hemen ardından yakalanır. Robot kullanımı ve fotoğraf plaka başına 2 dakika sürer.
  2. Tam yüklü bir atlıkarınca ile, maksimum elde edilebilir plaka resim yakalama frekansı bir fotoğraf her altı saattir. Tabaklar altı gün (koloni gelişimini doygunluk kadar e kadar inkübe edilir. Şekil 1 20 ° C'de bir zaman dersten üç tipik görüntüleri gösterir
  3. Izleme amaçları için, plaka inkübatöre inkübatör adı, sıcaklık, benzersiz sıralı parti numarasını ve pozisyonuna göre adlandırılır. Resim isim plakası adı ve zaman damgası bir birleştirme ve otomatik olarak (görüntü yakalama üzerine inşa edilir örneğin K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg, Dosya Türü FT1, Tablo 1).

5.. Deneysel Metadata Capture

Bu bölümde anlatılan meta dosyaları elle (hesap tablosu yazılımlarını kullanarak gibi) oluşturulan sekme ile sınırlandırılmış metin dosyalarıdır. Deneysel Açıklama dosyası (FT2, Tablo 1) her bir deney için benzersiz olan, ancak Kütüphane Açıklama (FT3, Tablo 1) yaygın bir kez inşa yeniden kullanılabilir.

  1. Deneme ile kütüphaneler için barkod için sütunları (veya otomatik olarak oluşturulan plaka adı) içeren Deneysel Açıklama dosyası (FT2, Tablo 1), deney başlamadan damgası, plaka arıtma, katı agar, ekran adı, kütüphane, plaka numarası (içeriği açıklanmıştır Çok plakalı) 1536 biçiminden 384 formatında aşağı ölçekleme için tekrar kadranlı numarası (bkz. Şekil 1).
  2. Maya suşu kütüphane, Kütüphane Açıklama dosyası (FT3 ile açıklanmıştır
  3. Taranan suşların belirlenmesi her sistematik ORF y-sayı (örneğin YDR217C) ile ilişkili standart gen adı (örneğin RAD9) tanımlayan isteğe bağlı Standart Gen Adı dosyası (FT4, Tablo 1) sağlanabilir. ORF ve Gen adı: Bu dosya iki sütun içerir.

6. Veri Analizi

QFA hesaplama iş akışı Colonyzer görüntü analizi yazılımı aracı 3,4 ve QFA R paketi 7 yüklü olduğu bir makul güçlü çok çekirdekli bilgisayar iş istasyonu (Xeon dört çekirdekli 2.67 GHz işlemci ve 12Gb RAM ile örneğin bir Dell Precision T3500) erişimi gerektirir , her ikisi de çevrimiçi belgelenen, serbestçe kullanılabilir ve işletim sistemleri bir dizi çalıştırın.

  1. Çekilen her resim için tek bir Colonyzer Çıktı dosyası (FT5 Tablo 1) üreterek, girdi olarak yakalanan plakası görüntüleri her biri ile Colonyzer çalıştırın. Colonyzer Çıktı dosyaları kültür yoğunluğu tahminleri, kültür alanı, şekil ve görüntülü plaka üzerinde 384 yerlerin her biri için renk belirleyin. Çıkış dosya adı otomatik olarak (örneğin plaka fotoğraf K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.jpg (FT1, Tablo 1) Colonyzer çıktı dosyası K000011_030_010_2011-09-22_09-47-54.dat karşılık (kaynak görüntü dosya kopyalanır FT5, Tablo 1)).
  2. QFA R paketini kullanarak, deneysel meta (FT2, Tablo 1) ve Colonyzer çıktı dosyalarını (FT5 Tablo 1) yükleyin. Bu veriler, ileri analiz için R veri çerçeveleri (hangi QFA Ham Veri metin dosyaları (AB6 Aşağıdakiler, Tablo 1) olarak ihraç edilebilir) birleştirilir.
  3. QFA R paketi genelleştirilmiş lo sığdırmak için, her kültür için hücre yoğunluğu timecourses toplamak için fonksiyonları içerirgözlem ve arsa şündürmektedir nüfus modelleri hem (Şekil 2 ve örnekler için 3). Gömme parametre değerleri QFA Lojistik Parametre dosyaları (FT7 Tablo 1) yazılır. Ayrıntılı bilgi için QFA R paketi belgelerine bakın.
  4. QFA R paketi de kalite kontrol fonksiyonları içerir: kenar koloniler levha duvarlar, ekran-spesifik bir marker genleri ile bağlantı gösteren SGA ve genotipler başarısız kültürleri yakın görüntü analizi ile plaka kenarları ve zorluk olarak besinlerin daha fazla yer nedeniyle atılır analiz arındırılır.
  5. Birkaç nicel Fitness önlemler, her kültür için lojistik nüfus model parametreleri elde edilmektedir. Bu maksimum nüfus iki katına oranları (MDR) ve aşılama ile doygunluk (MDP) ile bölünmeler sayısını içerir. Çoğaltma kültürlerin her set (örneğin benzersiz genotipi) için ve her spor tanımı için, fitness tahminler birkaç özet istatistikleri comp vardıruted: ortalama ve medyan spor, fitness standart sapma ve sayı gözlenen çoğaltır. Özet istatistikleri daha fazla analiz için QFA Spor Özet dosyaları (FT8, Tablo 1) çıkış, genetik etkileşim puanları (FT9 Tablo 1) örneğin hesaplama vardır.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 2 yaklaşık 2 gün sonra tespit edilebilir hale ilk hücre yoğunluğundaki artış, ° C Colonyzer ile nicellefltirilen katı agar 20 büyüyerek 384 QFA kültürlerinden biri tipik büyüme eğrisi olduğunu gösteriyor. Bu gecikme muhtemelen katı orta ve hücre yoğunluğu için algılama bir alt limit üzerine inokülasyonundan bir kültür lag fazı bir ortak etkisidir. Şekil 3 tek plak yakalanan 308 benzer büyüme eğrileri görülmektedir. Şekil 4 iki genom ile karşılaştırılması göstermektedir genetik anlaması için QFA ekranlaretkileşimi güçlü (1 uyarlanmıştır). QFA R paketi 7 ayrıca bir q-değer (Yanlış Discovery Oranı (FDR) p-değeri düzeltilmiş) ile birlikte, Şekil 3 üretmek ve incelenen genotipler ve genetik etkileşim gücü (CBS) tahminleri sıradaki listeleri çıktı fonksiyonları içeren Gözlemlenen CBS önemi.

Şekil 1
Şekil 1.. 384-spot biçiminde maya suşlarının robotik aşılama için Scheme. Bu prosedür, plaka başına 1536 bağımsız kültürleri (solda) ile başlar. Bu tipik bir örnek olarak, pozisyonları 1,1 kolonileri; 1,2, 2,1 ve 2,2 (kırmızı renkli) aynı genotip çoğaltır dört olan HIS3 :: sarı KanMX kültürleri, plaka kenarında büyüyen. , rekabet eksikliği nedeniyle bir büyüme avantajı var ve bu nedenle QFA tarafından incelenir değildir. Bu çoğaltır biri (örneğin 1,1) 96-plaka sıvı büyüme ortamı inokule edilir s 1536 koloniler her zaman dışında 96 inoculates 96-pin aracını kullanarak. 384 gen delesyonu, dört farklı "çeyrek" (kırmızı, mavi, yeşil ve mor olarak gösterilir) her biri için kopyalayan aşılamak için büyüme ortamı içeren dört farklı 96-plakaları inoküle edilir. Doygunluk büyüme (örneğin 20 ° C'de 3 gün) sonra, kültürler suda seyreltilir, sonra bir tekrar gelen dört kadranda orijinal SGA plakayla aynı desende bir katı agar (sağda) üzerine 384-biçiminde tespit edilmiştir (gibi renk ile gösterilir). ; 2,1 ve 2,2 1,2: işlemi diğer çoğaltır test etmek için tekrar edilebilir. Sağdaki Örnek time-lapse görüntüleri 0.5, 2 ve 3.5 gün inokülasyonundan sonra yakalandı. Ek Şekil 1 2 uyarlanmıştır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

018/4018fig2.jpg "/>
Şekil 2. Tek bir robot yakalanan QFA büyüme eğrisi. 20 agar içeren galaktoz üzerinde büyüyen bir maya suşunun A) QFA büyüme eğrisi ° C Görüntüler yaklaşık 2 saatte bir robot ele geçirildi. Bu sıcaklıkta Üstel faz kültür yoğunluğu artışı ilk aşılama sonrası yaklaşık 2 gün saptanabilir olmasıyla birlikte, yaklaşık 1,5 gün boyunca gözlemlenebilir oldu. Genelleştirilmiş bir lojistik modeli gözlenen verilerin (gri eğri) için uygun edildi. Otomatik QFA R paketi ile donatılmış model parametreleri sunulmuştur: K (kapasite (AU) taşıyan), r (büyüme hızı (d -1)), g (inokulum yoğunluğu (AU)), v (büyüme simetri). B) panel A gelince, bir günlük ölçekte hücre yoğunluğu ile çizilmiştir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3
Şekil 3. Otomatik olarak gen Oy büyüme eğrileri tek bir 384-format plaka paralel olarak ele geçirdi. Her panel hücre yoğunluğu tahminleri (kırmızı çarpılar) ve gen adı veya ORF y numarası QFA prosedürü yetişen tarafından etiketli bağımsız kültürler için model uyum (siyah eğriler) gösterir. Bu örnek plaka robot tarafından görüntülendi ve 20 ° C'de otomatik bir kuluçka yetiştirildi Plaka adı, plaka tedavi, agar ve kütüphane plaka numarası: Deneysel meta otomatik şekil başlığı yer almaktadır. Uygun modelin parametre değerleri de otomatik olarak (bkz. Şekil 2) Her bir paneldeki yazdırılır. Kenar kültürleri bu arsa içinde 308 kültür (QFA Protokolü 5.4) bırakarak, QFA analizi sıyrılmıştır. Kenar kültürler QFA analiz olmadığından, bu kültürü yerlerde genellikle nötr kontrolünde zorlanmalar, (bu durumda PGAL-HIS3) ile doldurulur. Bu rakamın orijinal versiyonu, QFA R paketi ile çıktı. Pdf formatında ve bu nedenle sonsuz yakınlaştırılabilen ve metin sorguları göre taranabilir.:/ / Www.jove.com/files/ftp_upload/4018/4018fig3.pdf "target =" _blank "> büyük rakamı görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4
Şekil 4. Genetik etkileşim anlamak için iki QFA ekranlarından uyumu karşılaştırılması. Bu arsa için nötr ura3Δ mutasyon ya da ısıya duyarlı cdc13-1 mutasyonu ile birlikte ve yarı-müsamahakar sıcaklığında yetiştirilen Maya silme (yfgΔ), fitness karşılaştırılması gösterilmiştir cdc13- 1 (27 ° C). Spor maksimum hızı katlama ve maksimum katlama potansiyeli 1 ürünü olarak hesaplandı. En silme suşlar nötr ura3Δ mutasyonu ile birlikte beklendiği gibi de büyümeye ve yüksek spor var, ama cdc13-1 ile birlikte silme uyumu geniş bir yelpazesi var. Açık mavi çizgiler inci kesişmesinötr his3Δ mutasyon e konumu, düz çizgi genetik bir bağımsızlık lineer regresyon modeli (cdc13-1 beklenen spor yfgΔ ura3Δ yfgΔ mutantların spor verilen mutant) ve kesikli çizgi eşit fitness hattıdır. Delesyonlar yeşil renkli belirgin cdc13-1 suşlarının spor defekt geliştirmek. Kırmızı renkli belirgin aynı arızanın bastırmak Delesyonlar. Düz çizgi herhangi bir mutasyon cdc13-1 yfgΔ dikey mesafesi plakası koşullar altında cdc13-1 ve yfgΔ arasında genetik etkileşimin gücünü gösterir. Cdc13-1 en güçlü bastırıcılarının bazıları daha önce sağ üst yakınlarındaki kontrol noktasında genler, RAD17, DDC1 ve RAD24 ve nükleaz EXO1 tespit edildiğini unutmayın. Olan silinmesi spor azaltır Genler yakın YKU80 (protein Yku80 kapaklama DNA onarım ve telomer kodlama) içerir sağ alt. Ayrıca birlikte hareket genler bazı gruplar bu arsa üzerinde birlikte yer almaya meyillidir unutmayın. Üç örnek kümeleri mavi SPE1, SPE2 ve SPE3 vurgulanır: DDR ve EST1 yer MRX kompleksi: spermidin sentezi genlerin, RAD17, DDC1 ve RAD24: kapısı sürgülü kelepçe ve denetim noktası kelepçe yükleyici, MRE11, RAD50 ve XRS2 kodlamasını bileşenleri & EST3: genler telomer uzunluğu düzenlenmesinde rol. Ek Şekil 1B 1 uyarlanan bu arsa oluşturulduğu ham veri buradan indirebilirsiniz: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/AddinallQFA/ . büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

"> Dosya numarası Dosya Türü El inşa Frekans güncelleyin Ön Koşul FT1 Plaka fotoğraf Yok Plaka ve timepoint Başına Evet FT2 Deneysel Açıklama Evet Deneme başına Evet FT3 Kütüphane Açıklama Evet Kitaplık başına Evet FT4 Standart Gen İsimler Evet Kitaplık başına Yok FT5 Colonyzer Çıkışı Yok Plaka başına timepoint Başına Evet AB6 Aşağıdakiler QFA Ham Veriler Yok Deneme başına - FT7 Yok Deneme başına - FT8 QFA Spor Özeti Yok Deneme başına - FT9 QFA Genetik Etkileşim Hitlist Yok CBS çalışmada başı (2 expts.) -

Tablo 1. Elektronik QFA Dosyaları. Listelenen tüm dosyaları (hariç FT1) sekme ile ayrılmış metin dosyaları olan ve inşa veya herhangi bir metin düzenleyicisi veya hesap tablosu yazılımlarını kullanarak okunabilir. Inşa QFA meta dosyaları ve QFA çıkış hassas yorumlanması hakkında ayrıntılı bilgi için QFA R paketi belgeleri 7 ve Colonyzer 3 yazılım belgelerine bakın.

Tablo 2
Tablo 2. Kültür spor değerlendirilmesi için yöntemler. A özelliklerin özeti ve ihtiyaçmikrobik kültürü spor değerlendirmek için yöntemler bir dizi elde edilmesi gerekmektedir. Blomberg 8 tarafından bir inceleme Bunların bazılarının daha detaylı karşılaştırma içermektedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

QFA birçok bakımdan bir doğrudan üç kurulan tezgah ölçekli mikrobiyolojik tekniklerin soyundan: kültür dilüsyon serisi nokta testleri 9, gazlı sıvı kültürleri 9 ve çoğaltma kaplama 13 büyüme eğrisi belirlenmesi. Bu üç yöntem özetlenmiş ve QFA ve Tablo 2'de diğer yüksek verimlilik teknikleri ile karşılaştırılmıştır. Dilüsyon serisi nokta testleri inokulum dilüsyonları bir dizi yetiştirilen kültürlerin bir dizi koloniler kurma yeteneğini bir zorlanma fitness tanımlamak Oysa, tek bir kültür tekrarlanan gözlemlere QFA önlemler gerginlik spor bir büyüme eğrisi inşa etmek. Tek bir kültürden spor miktarının daha fazla sayıda suşları aynı koşullar altında, eş zamanlı olarak incelenmiştir izin verir. Farklı ortamlarda veya genetik kökenli kültür spor farklılıkların test ederken kültürlerin çoğaltılıyor diziler çoğu yararlı suşu koleksiyonları, tekrarlanan test yapılmasını sağlar. QFA protokolü sunduBurada, bağımsız kültürleri (robotik QFA, Tablo 2) binlerce büyüme gözlemlemek için uygun inkübe ve görüntü agar, çoğaltmak aşılamak için pahalı robotik ekipman kullanır. QFA köklü, geleneksel laboratuvar teknikleri dayanmaktadır Bununla birlikte, aynı zamanda manuel adımları (manuel QFA, Tablo 2) robot yardımı yerine daha ucuza çok daha yapılabilir. Manuel QFA manuel pin aracı ve ve fotoğraflar için inkübatör plakalarını manuel aktarma yöntemi kullanarak agar plaklarına kültürlerin çoğaltma ve aşılama içerir. Aynı bilişimsel analizi akışı ya deney tasarımı gelen büyüme eğrilerinin üretmek için uygulanabilir.

QFA spor tahminleri nispeten kesin gibi görünüyor. Şekil 4'te, işlevsel olarak ilgili genin delesyonları dört örneğin kümelerinin ortalama uyumu vurgulanmıştır. İki bağımsızlık her işlevsel ilişkili gen sınıfın üyelerinin yakınent genetik kökenden (ura3Δ ve cdc13-1) QFA spor tahminlerinin tekrarlanabilirlik gösterir. Örneğin, sadece 3 gen delesyonu (dışarı olası 4.300 ile) korunmuş MRX kompleksinin üç üyesi ayırın.

Mikrobik suşların büyüme özellikleri test etmek için QFA Yüksek throughput alternatifler SGA 5,6, spektrofotometrik plaka okuyucuları optik yoğunluk kinetik yakalayarak rekabet barkodlu kütüphanelerde ekranlar 11,12 ve ekranlar dahil Tablo 2'de ve daha tam olarak başka bir yerde 8 açıklanan 10 . QFA ve kültürler katı agar yüzeyler (agar temelli yöntemler, Tablo 2) büyümek SGA tabak, robot tarafından hızlı ve kolay işlenebilir. Katı agar yüzeyinden kültürleri de büyüme boyunca havalandırılmakta ve hücrelerin sosyal mikroplar bir topluluk 14 büyürse, sabit kültürlerde büyüyebilir. Sol bozulmamış, mikrobiyal topluluklar birkendi mikro-ortam, örneğin etanol gibi salgılayan toksinler, ve muhtemelen hücreleri arasındaki sinyal ffect. Ancak, yeterli havalandırma sağlamak için gerekli sıvı kültürleri, karıştırma sürekli, yapay büyüme tarzlarını etkileyebilir mikrobiyal topluluklar ve onların mikro-ortamlar bozar. Kültürler arasındaki hücreleri taşıyan sıvı sıçraması için daha az fırsat olmadığı için çapraz kontaminasyon katı agar yöntemleri daha az kaygı verici olduğunu. Kontaminasyon katı agar tayinlerde yabancı hava yoluyla bulaşan mikroplar tarafından meydana gelirse, genellikle katı agar görsel muayene ile tespit ve hesaba veya kaldırılabilir.

QFA üretilen iki şekilde paralel sıvı yöntemlerine göre daha yüksektir. Öncelikle, QFA (ve SGA) tabaklarda, inoküle kültürleri plaka başına daha bağımsız kültür vererek, daha yoğun birlikte paketlenmiştir. QFA yılında 308 kültürleri deneysel olmayan kenar kültürler (Şekil 1) com saymazsak, genellikle vardırplaka başına 96 veya 100 kültürleri ile sıvı kültür paralel olarak hazırlandık. İkincisi, QFA deneyler plakaların çok daha büyük bir sayıya ölçeklendirilebilir. Tek bir QFA deneyde analiz plaka sayıda tek bir inkübatör ya sıcak bir odada, en az kabul edilebilir görüntü yakalama frekansı ve maksimum elde yakalama frekansı mevcut alan ile sınırlanmıştır ise, bir sıvı büyüme deneyde plakaların numarası kuvvetli sınırlıdır plaka okuyucu (tipik olarak bir ya da iki levha) veya plak okuyucu (tipik olarak 25-50 plakaları) eklenmiş istif bölmesi arasında kapasitesiyle. Yakın zamanda 37.884 eşzamanlı kültürleri vererek, 308 deneysel kültürleri olan 123 tabak, her bir tam otomatik QFA deney gerçekleştirdi. Biz sıvı büyüyen bağımsız kültürlerin maksimum elde edilebilir sayısı 96 (kültür / plaka) olduğu tahmin bizim QFA verimi az on misli civarındadır x 50 (tabak / istifleyici) = 4800. Sıvı kültür ekranları için alternatif bir çok otomatikleştirilmiş gro kullanmaktırparalel wth cihazları (8 Blomberg tarafından incelemesi ile Tablo 1), bir ya da iki levha bir kapasiteye sahip her. Her cihaz Sıcaklık kontrolü bağımsızdır ve bu nedenle şartlar aynı değildir, ama onlar olduğunu varsayarak, bu iş en az 190 tür cihazların QFA throughput (cihaz başına 200 sıvı kültürleri varsayarak) maç gerektirecektir.

Özetle, QFA yararlı küçük ölçekli odaklanmış deneyler ve yüksek işlem ekranlar hem de nicel büyüme fenotipleri toplamak için uygulanabilir yüksek kaliteli bir iş akışıdır. Robotik ekipman için gereksinimleri değişen etkili uygulanacak esnektir. QFA iş akışının bilgisayar bileşeni serbestçe kullanılabilir, açık kaynak kodu dayanmaktadır.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Biz minnetle ve laboratuvar desteği ve yararlı tartışmalar için Yaşlılık ve Beslenme (CISBAN) Entegre Sistem Biyolojisi Merkezi'nin tüm üyeleri kabul ediyorsunuz. Bu çalışma, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) (BB/C008200/1) ve Wellcome Trust (075.294, 093.088) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Replica Plater Sigma R-2508 96 pin manual pintool with 1/8 " diameter pins
Mix Mate Eppendorf 5353 000.014
Biomek FX Beckman A31842
Teleshake Thermo Scientific 50095890 Installed on Biomek FX
BM3-SC S&P Robotics Inc BM3-SC 192 shelf rotating carousel
spImager S&P Robotics Inc spImager High resolution manual imaging
spImager with Cytomat S&P Robotics Inc Custom Temperature controlled automated high resolution imaging
Cytomat 6001 with heat exchanger Thermo Scientific 51022222 Attached to spImager
Ecoline RE207 Lauda RE207 Attached to Cytomat
spImager with carousel S&P Robotics Inc Custom Automated high resolution imaging
Robot pin tool fixture for FP12pins V&P Scientific AFIX96FP12 N/A
96 x FP12 pins V&P Scientific FP12 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length
Docking Station for Pin Tool V&P Scientific VP425 Docking station base removed to allow fan drying of pins
Pin Cleaning Brush V&P Scientific VP425 N/A
Replica Plater Sigma R-2508 Manual pin tool
Nunc OmniTray with Lid Nunc 734-0490 N/A
96 well sterile polystyrene plates Greiner BioOne 655161 N/A
96 well sterile polystyrene lids Greiner BioOne 656171 N/A

Table 3. Specific reagents and equipment.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects. PLoS Genetics. 7, (4), e1001362 (2011).
  2. Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 180, 2251-2266 (2008).
  3. Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar. BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).
  4. Colonyzer - Image analysis software [Internet]. Newcastle University. Newcastle, UK. Available from: http://research.ncl.ac.uk/colonyzer/ (2012).
  5. Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
  6. Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
  7. qfa - An R Package for Quantiative Fitness Analysis [Internet]. University of Vienna. Vienna, Austria. Available from: http://qfa.r-forge.r-project.org/ (2012).
  8. Blomberg, A. Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping. Curr. Opin. Biotechnol. 22, (1), 94-102 (2011).
  9. Maringele, L., Lydall, D. EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Δmutants. Genes and Dev. 16, (15), 1919-1933 (2002).
  10. Warringer, J., Blomberg, A. Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 20, 53-67 (2003).
  11. Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, (5874), 362-365 (2008).
  12. Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries. J. Vis. Exp. (54), e2864 (2011).
  13. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).
  14. Queller, C. Behavioural ecology: The social side of wild yeast. Nature. 456, 589-590 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics